低劑量137Cs照射對甘藍(lán)型油菜幼苗抗氧化酶活性及光合作用的影響

李 斌，閆 冬，范 莉，姜曉燕

(中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，北京 100088)

隨著核能核技術(shù)的不斷發(fā)展，環(huán)境中的放射性污染風(fēng)險(xiǎn)增加，137Cs 和134Cs 為環(huán)境放射性污染中的主要人工放射性核素[1]。由于137Cs 和134Cs 半衰期長，所產(chǎn)生的電離輻射能夠在環(huán)境中長期存在，并且核素可隨著大氣環(huán)流沉降到土壤中，破壞土壤系統(tǒng)的生態(tài)環(huán)境，對土壤中植物的正常生長造成損傷，進(jìn)而改變植物種群的平均特征、破壞植物種群的遺傳結(jié)構(gòu)[2]。

植物受到照射后，體內(nèi)產(chǎn)生的過量活性氧自由基對植物自身產(chǎn)生毒害作用，為抵御活性氧毒性的影響， 植物體內(nèi)以超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物酶(peroxidase，POD)等為主的抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)生變化，清除體內(nèi)過量自由基，維持植物細(xì)胞活性氧穩(wěn)態(tài)。作為植物抵御氧化應(yīng)激的主要保護(hù)系統(tǒng)，通常將SOD、CAT、POD 等抗氧化酶的活性作為植物應(yīng)激反應(yīng)的重要監(jiān)測指標(biāo)。此外，抗氧化酶還參與植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)中活性氧依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]，在抵御外界脅迫，增強(qiáng)植物耐受性，維持植物正常生長方面發(fā)揮重要作用。

電離輻射抑制植物生長和發(fā)育的具體原因很復(fù)雜，研究表明通常是由于照射所引起的直接和間接作用所導(dǎo)致，其中光合能力的降低被認(rèn)為是最關(guān)鍵的因素之一[4-6]。在高等植物中，光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化過程是由葉綠體類囊體膜上的蛋白復(fù)合物及其相關(guān)電子載體完成的[7]。這些蛋白復(fù)合物主要包括光系統(tǒng)Ⅰ(photosystem Ⅰ，PS Ⅰ)、光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ，PS Ⅱ)、細(xì)胞色素b6f 和ATP 合酶復(fù)合物[8]。葉綠素能夠吸收光子并與蛋白質(zhì)結(jié)合形成PS Ⅰ和PS Ⅱ，是植物葉片進(jìn)行光合作用的主要色素，其含量是衡量植物光合作用強(qiáng)度的重要指標(biāo)。

目前關(guān)于電離輻射對植物生理特性改變的研究主要集中在大劑量輻射育種方面，而關(guān)于植物幼苗期受到相對低劑量照射后的生理效應(yīng)研究相對較少。甘藍(lán)型油菜(Brassica napusL.)作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，對其進(jìn)行相關(guān)研究具有重要意義，且幼苗期作為其整個(gè)生育期的關(guān)鍵階段，直接影響后期的生長發(fā)育和產(chǎn)量。因此，本實(shí)驗(yàn)選取甘藍(lán)型油菜(簡稱油菜)幼苗作為研究對象，以137Cs為照射源對油菜幼苗進(jìn)行低劑量(≤30 Gy)照射，檢測其受照后抗氧化酶活性、葉綠素含量的變化，并對光合作用相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，初步探討低劑量137Cs照射對油菜幼苗抗氧化酶活性及光合作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用油菜種子為中國科學(xué)院夏綠216。SOD、CAT 和POD 抗氧化酶活性測定試劑盒均購于Boxbio 公司，總RNA 提取試劑盒購于Solarbio 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real time PCR，qPCR)試劑盒均購于翌圣生物公司。

1.2 方 法

1.2.1 油菜幼苗培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室條件下，采用土培方式獲得油菜幼苗。隨機(jī)挑選無病蟲害、充分成熟及籽粒飽滿的種子埋于盛有植物培養(yǎng)土的花盆中(20 cm×20 cm×18 cm)，使用光照培養(yǎng)架進(jìn)行植物培養(yǎng)，期間溫度控制在22～24 ℃，濕度控制在50%～85%，光照周期為光期14 h，暗期10 h，光照度為5 000 lx[9]。

1.2.2 輻照條件幼苗長至二葉一心，株高3～4 cm時(shí)進(jìn)行照射，每個(gè)劑量組包括5 棵油菜。以137Cs 為放射源，采用間隔照射代替慢性照射，每周照射5 d，每天照射7 h，照射劑量率為8.28 mGy/min，總照射劑量分別為0(對照組)、5、10、15、20、25和30 Gy。

1.2.3 抗氧化酶活性測定采用試劑盒進(jìn)行酶的提取。稱取0.1 g新鮮油菜葉片加入1 mL提取液冰浴勻漿，4 ℃、8 000 g 離心10 min，取上清置于冰上待測。SOD活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法測定，CAT活性采用過氧化氫法測定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，每次測定設(shè)置3 個(gè)平行樣。具體操作步驟均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 葉綠素與類胡蘿卜素含量的測定取0.1 g 葉片與2 mL 濃度為80%的丙酮混合勻漿，避光提取12 h 后，定容至5.0 mL，8 000 g 離心10 min。采用分光光度法測定葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b與類胡蘿卜素含量。取上清液在紫外分光光度計(jì)上分別測定663、645 和470 nm 處的吸光度，按照下面的公式計(jì)算色素的濃度(μg/mL)，每次測定設(shè)置3個(gè)平行樣：

Ca=12.72×D(663)-2.59×D(645)

Cb=22.88×D(645)-4.67×D(663)

Ca+b=20.29×D(645)+8.05×D(663)

Cx+c=[1 000×D(470)-3.27×Ca-104×Cb]/229

式中：Ca為葉綠素a含量；Cb為葉綠素b含量；Ca+b為葉綠素a+b 含量；Cx+c為類胡蘿卜素含量；D為吸光度。

1.2.5 qPCR 檢測光合作用相關(guān)基因的表達(dá)在高等植物體內(nèi)，光合作用是由多個(gè)基因共同調(diào)控的復(fù)雜過程，為了解137Cs 照射對光合作用相關(guān)基因表達(dá)的影響，采用總RNA提取試劑盒提取油菜葉片總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 的合成，分別采用SYBR qPCR試劑盒對psb A、psb D、psb C和LOD106434505基因的表達(dá)進(jìn)行qPCR 分析，反應(yīng)體系為10 μL Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix，0.5 μL 正向和反向引物，5 μL 模板cDNA 并補(bǔ)充無菌超純水至20 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃、5 min；95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為參照。通過2-ΔΔCT法進(jìn)行定量分析，每次測定設(shè)置3個(gè)平行樣。引物序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

通過Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的計(jì)算和整理，采用R 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，通過GraphPad Prism 9 進(jìn)行圖表的繪制。數(shù)值采用±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同劑量137Cs 照射對油菜幼苗抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶活性的變化與植物體內(nèi)氧化穩(wěn)態(tài)有直接關(guān)系，常作為衡量植物抗逆性強(qiáng)弱的指標(biāo)[10]。不同劑量137Cs 照射對油菜幼苗中抗氧化酶活性有顯著影響。與對照組比較，隨照射劑量的增加，5～30 Gy 照射組SOD 活性逐漸增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1A)。其中5、10和15 Gy劑量組的SOD活性分別增加至對照組的1.32、1.48 和1.63 倍(P＜0.05)；20 和25 Gy 劑量組的SOD 活性增加至對照組的2 倍(P＜0.05)；30 Gy 劑量組的SOD 活性最高。CAT 活性在30 Gy 照射組最高，增加至對照組的1.50 倍(P＜0.05，圖1B)。POD活性在5和15 Gy照射組表現(xiàn)為增加(P＜0.05)，其中15 Gy 劑量組活性最高，增加至對照組1.90 倍(P＜0.05)；25 Gy 劑量組最低，降至對照組的41%(P＜0.05，圖1C)。

圖1 不同劑量137Cs照射后的油菜幼苗葉片中抗氧化酶活性的變化

2.2 不同劑量137Cs 照射對油菜幼苗光合色素含量的影響

葉綠素在植物光合作用的光能吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化等環(huán)節(jié)中具有重要作用，葉綠素含量降低是引起植物光合速率降低的重要原因之一[11]。137Cs 對油菜幼苗葉片中葉綠素含量有一定影響。隨著照射劑量的增高，油菜幼苗葉片的葉綠素a 在10 Gy 劑量組含量最高，較對照組增加了24.51%(P＜0.05)；在30 Gy 劑量組含量最低，較10 Gy 劑量組降低了29.49%(P＜0.05)，見圖2A。葉綠素b 的含量在5 和10 Gy 劑量組分別較對照組增加了23.04 和29.51%(均為P＜0.05)；30 Gy 劑量組的葉綠素b 含量最低，較10 Gy 劑量組降低了39.46%(P＜0.05)，見圖2B。葉綠素a+b 的含量在5 Gy劑量組最高，比對照組增加了25.22%(P＜0.05)，見圖2C。葉片內(nèi)類胡蘿卜素含量與葉綠素a+b 的變化趨勢相似，5 Gy 劑量組時(shí)較對照組增加了28.30%(P＜0.05)；30 Gy劑量組含量最低，較5 Gy劑量組降低了29.37%(P＜0.05)，見圖2D。

圖2 不同劑量137Cs照射處理的油菜幼苗葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量

2.3 qPCR 檢測137Cs 照射對油菜幼苗光合基因表達(dá)的影響

psb A和psb D基因?qū)?37Cs的照射不敏感(圖3A和B)。受到照射后，與對照組比較，psb C mRNA 表達(dá)水平均下調(diào)(15 Gy 劑量組除外)，5 Gy 劑量組表達(dá)水平下調(diào)了45.1%(P＜0.05)，10 Gy 劑量組表達(dá)水平降低了50%(P＜0.05，圖3C)。而LOC106434505 mRNA 的表達(dá)水平在照射后均顯著上調(diào)(P＜0.05)，15 Gy劑量組較對照組增加了1倍(P＜0.05)，在30 Gy劑量組表達(dá)水平最高(圖3C)。

圖3 不同劑量137Cs照射后油菜幼苗葉片中光合基因的表達(dá)情況

3 討 論

研究表明，在重金屬、極端溫度、電離輻射等逆境脅迫下，植物光合作用過程中卡爾文循環(huán)(也稱暗反應(yīng))中電子的減少和梅勒反應(yīng)中的過量電子泄露能夠?qū)е麦w內(nèi)活性氧水平增加[12]，過量的活性氧破壞生物分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，甚至導(dǎo)致植物死亡。SOD、CAT 和POD是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的重要抗氧化酶，能有效清除植物受到脅迫后所產(chǎn)生的大量活性氧及其他過氧自由基，抑制膜脂質(zhì)過氧化，減輕活性氧等物質(zhì)對植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞。在本研究中，油菜幼苗受照后，體內(nèi)活性氧大量累積，SOD作為防御活性氧的第一道酶防線迅速反應(yīng)[12]，隨著137Cs 照射劑量的增加，活性逐漸增強(qiáng)。SOD從超氧陰離子中接受電子并傳遞電子，將油菜體內(nèi)大量活性氧轉(zhuǎn)化為無毒的O2和毒性較低的H2O2；隨著體內(nèi)H2O2增多，CAT活性也隨之增強(qiáng)，催化分解H2O2產(chǎn)生H2O和O2；POD參與植物體內(nèi)多種生理功能，與CAT協(xié)作清除H2O2，起到保護(hù)作用，而隨著逆境脅迫的發(fā)展，POD能夠促進(jìn)活性氧的生成，加速葉綠素降解，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化，表現(xiàn)為膜損傷作用[13]。在李春牛等[14]和Kiani 等[15]的研究中，茉莉花、小麥?zhǔn)艿秸丈浜篌w內(nèi)SOD、CAT 及POD活性隨著照射劑量的增加而逐漸增高，當(dāng)劑量高達(dá)一定程度時(shí)轉(zhuǎn)而下降。而在本研究中，油菜幼苗受到137Cs照射后，SOD和CAT活性逐漸增強(qiáng)，隨著照射劑量的增加，并未出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象，這可能是由于不同物種對電離輻射的敏感性不同有關(guān)，油菜對電離輻射的耐受性較強(qiáng)[16]。

光合作用是植物生長和生物能量積累的基礎(chǔ)，葉綠素在光合作用過程中吸收光能，并將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，是植物體內(nèi)的主要光合色素。高等植物體內(nèi)葉綠素的合成是一個(gè)復(fù)雜的過程，整個(gè)過程由17種酶調(diào)控[17]。大量研究表明，植物葉綠素的合成與分解不僅受自身激素與酶的調(diào)節(jié)，還受到溫度、光照、電離輻射等環(huán)境因素的影響，并且電離輻射的影響表現(xiàn)為低劑量促進(jìn)、高劑量抑制的規(guī)律[18]。本研究中，采用不同劑量的137Cs 照射油菜幼苗后，隨著137Cs 劑量增加，油菜葉片中葉綠素含量表現(xiàn)為先增后減的趨勢，與其他研究結(jié)果一致[19-20]。這說明低劑量(5 和10 Gy)電離輻射能夠促進(jìn)葉綠素合成，而隨著照射劑量增加，葉綠素合成逐漸受到抑制，如通過降低葉綠素合成酶活性[21]、改變?nèi)~片類囊體的正常結(jié)構(gòu)[22]，或調(diào)控葉綠素降解酶[23]而促進(jìn)葉綠素降解。有研究表明，葉綠素含量與光合速率、植物產(chǎn)量呈正相關(guān)關(guān)系[6，17]，若阻斷植物葉綠素合成或促進(jìn)植物葉綠素降解，將引起植物光合作用紊亂，植物生長受阻甚至導(dǎo)致死亡。

除此之外，137Cs 照射還通過促進(jìn)光反應(yīng)過程中的光能捕獲和能量傳遞對油菜幼苗光合作用產(chǎn)生影響。在光合作用過程中，葉綠素和類胡蘿卜素吸收光能并結(jié)合到類囊體膜的蛋白上，形成2 大類超分子復(fù)合物：PS Ⅰ和PS Ⅱ，其中PS Ⅱ是電離輻射的主要靶標(biāo)之一[6]。PS Ⅱ主要由在功能和結(jié)構(gòu)上不同的兩部分組成：①核心復(fù)合體，主要成分包括D1、D2 蛋白所組成的光化學(xué)反應(yīng)中心及兩個(gè)序列相關(guān)的核心天線蛋白CP43、 CP47； ②捕 光 復(fù) 合 體(light-harvesting complex，LHC)和放氧復(fù)合體外周蛋白，主要由色素蛋白復(fù)合體組成[24-25]。在結(jié)構(gòu)上，psb A和psb D分別編碼PS Ⅱ的D1 蛋白和D2 蛋白，D1 蛋白也叫Qβ蛋白，在光抑制條件下能夠快速更新，與D2 蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，在光電子轉(zhuǎn)運(yùn)中起著重要的作用[26]。psb C編碼PS Ⅱ葉綠素載脂蛋白CP43，CP43 和CP47與PS Ⅱ核心復(fù)合物緊密相連，并結(jié)合大量葉綠素，將PS Ⅱ外周LHC 吸收的能量傳給光反應(yīng)中心，從而引起光化學(xué)反應(yīng)[27]。研究表明，psb A的轉(zhuǎn)錄受到光敏色素介導(dǎo)，且psb A和psb B表現(xiàn)出光依賴性，其表達(dá)主要受到光的調(diào)控，維持光誘導(dǎo)的成熟葉綠體中D1和D2蛋白的快速周轉(zhuǎn)，以避免光抑制[28]。因此，在本研究中，psb A和psb D基因的表達(dá)水平并未受到137Cs照射的影響。而psb C基因的表達(dá)水平在受到照射后顯著下調(diào)(P＜0.05)，這說明137Cs 照射對油菜光合作用的光電子轉(zhuǎn)運(yùn)和能量傳遞具有一定影響。在功能上，LHC II蛋白是PS Ⅱ的主要捕光葉綠素a和或b結(jié)合蛋白，由LHC b家族編碼，其含量占了類囊體膜蛋白總量的1/3 以上，并且結(jié)合了50%以上的葉綠素[24]。LHC II的主要功能是光能的吸收和傳遞，提高捕光面積和捕光效率；此外，LHC II在光能分配的調(diào)節(jié)以及光保護(hù)過程中也具有重要的作用[24-25]。其中，LHC Ⅱ中的Ⅲ型葉綠素a 和或b 結(jié)合蛋白由LOC106434505基因編碼，油菜受到照射后，LOC106434505基因的表達(dá)隨著137Cs 照射劑量的增加而增加(P＜0.05)，以增強(qiáng)對光能的捕獲和傳遞，通過調(diào)節(jié)光合作用為受照后的油菜解毒機(jī)制提供能量，提高植物抗逆性。此外，psb C基因的表達(dá)在受到照射后立即出現(xiàn)下調(diào)，而LOC106434505基因的表達(dá)在劑量增至15 Gy時(shí)才出現(xiàn)顯著上調(diào)。這也說明油菜幼苗體內(nèi)可能存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制[29]，當(dāng)幼苗體內(nèi)光合作用相關(guān)基因psb C下調(diào)后，油菜幼苗葉片中光電子轉(zhuǎn)運(yùn)和能量傳遞受阻，光合作用效率降低，反向上調(diào)LOC106434505基因的表達(dá)，增加幼苗葉片對光能的吸收和傳遞，以彌補(bǔ)油菜幼苗光合作用過程中光電子轉(zhuǎn)運(yùn)受阻的影響。

綜上所述，低劑量(≤30 Gy)137Cs 照射能夠增強(qiáng)油菜幼苗抗氧化酶活性，并通過影響油菜幼苗葉綠素含量、光電子轉(zhuǎn)運(yùn)、能量捕獲與傳遞對油菜光合作用產(chǎn)生影響。