離子液體1-庚基-3-甲基咪唑氯鹽對小鼠的亞急性毒性

陳世懌，夏柱南，柳 鑫，2，楊 慶，*

(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢 430023；2.湖北省疾病預防控制中心應用毒理湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079)

離子液體(ionic liquids，ILs)是一類由有機或無機陽離子(如咪唑或吡啶)和陰離子(如硝酸鹽、醋酸鹽和乳酸鹽)組成的在低溫條件下呈液態的有機鹽，通常稱為“室溫離子液體”[1]。ILs 具有可燃性低，蒸氣壓低、熱/化學穩定性好、液體溫度范圍廣以及溶劑化能力高等性能特點[2]。ILs 作為傳統有機溶劑的“綠色”替代，可以避免傳統有機溶劑揮發帶來的環境污染以及健康危害等問題，在化工、制藥以及食品工業領域表現出良好的應用前景[1-4]。

隨著ILs 在化工、食品以及醫藥等工業領域的規模化應用，ILs 的安全性也逐漸引起廣泛關注。對ILs的深入研究發現ILs 并非完全“綠色安全”，一些ILs甚至對各種環境生物產生毒性[5-7]。因此，對ILs 的毒性評價在評估其對生態環境的影響與應用風險方面起著及其重要的作用。目前，對ILs 毒性方面的研究遠遠滯后于其性質及應用研究。咪唑型ILs 是近年來應用和研究最為廣泛的一類ILs，其毒性也逐漸引起研究者的廣泛關注。現有報道表明，咪唑型ILs 對生態環境、細胞、哺乳動物等均具有一定的毒性作用[8-11]。如咪唑硝酸鹽ILs 對擬南芥幼苗和小麥的生長有抑制作用，且隨碳鏈長度增加毒性增強[12]。1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([Bmim]Cl) 可擾亂HepG2 糖原合酶2(glycogen synthase 2，GYS2)和糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase，PYGL)的表達，引起細胞糖代謝的紊亂[13]。四氟硼酸化-1-十四烷基-3-甲基咪唑鹽([C14mim]BF4)急性和慢性暴露，均導致大鼠肝臟損傷[14-15]。

咪唑型ILs 是近年來應用和研究最為廣泛的一類ILs，其毒性也逐漸引起研究者的廣泛關注，但多為研究急性染毒對生物體的影響。而咪唑型ILs 亞急性染毒對生物體，尤其是哺乳動物的毒性研究仍較為缺乏。因此，本研究通過對小鼠體質量變化、臟器系數、血清生化指標以及組織病理學改變等的分析，探討1-庚基-3-甲基咪唑氯鹽(1-heptyl-3-methylimidazolium chloride，C7[MIM]Cl)亞急性染毒對小鼠的毒性作用，以期為評價咪唑型ILs的毒性作用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

AL204 電子天平(精度0.000 1 g，梅特勒-托利多儀器/上海有限公司)；電子秤(精度0.01 g，上海力衡公司)；Advia 2120i 型全自動生化分析儀(西門子診斷公司，美國)；Centrifuge 5420型冷凍離心機(Eppendorf股份公司，德國)；IX53 型顯微鏡(奧林巴斯科學事業公司，日本)；HistoCore BIOCUTR型切片機和ASP300S型脫水機均購于德國徠卡微系統有限公司。

1-庚基-3-甲基咪唑氯鹽(C7[MIM]Cl，純度＞98.0%，中國科學院蘭州化學物理研究所)；血常規試劑(拜耳，德國)；無水乙醇(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 實驗動物

SPF 級昆明小鼠(雌性，6～8 周，25～27 g) 24 只，購自湖北省疾病預防控制中心，生產許可證號SCXK(鄂)2020-0018。小鼠飼養于標準動物房內，動物房溫度(20±3)℃，相對濕度55%，自然光照，飲食和進水自由。所有動物實驗的開展均獲得武漢輕工大學實驗動物倫理審查委員會批準(批準號202211001)。

1.3 動物暴露模型建立

依據本課題組前期研究，C7[MIM]Cl經口暴露對昆明小鼠的半致死劑量(median lethal dose，LD50)為119 mg/kg[16]。本研究中，小鼠C7[MIM]Cl 亞急性暴露設置為低(1/50 LD50，2.38 mg/kg)、中(1/20 LD50，5.95 mg/kg)和高(1/10 LD50，11.9 mg/kg)共3個劑量組。小鼠適應性喂養7 d 后隨機分為對照組，C7[MIM]Cl 低、中、高劑量組，每組6 只，每天灌胃1 次，連續28 d，對照組灌胃給予等體積的生理鹽水。進行為期28 d的小鼠亞急性C7[MIM]Cl暴露實驗。

1.4 小鼠攝食量和體質量增長情況監測

記錄小鼠的初始體質量，每4 d 稱量小鼠體質量，至第28天。

1.5 血清生化指標檢測

第28 天采集小鼠眼眶血樣0.2 mL，在4 ℃以4 000 r/min離心10 min，取血清，全自動生化分析儀測定小鼠血清10 個指標，分別為丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉移酶(aspartate aminotransferase， AST)、 堿 性 磷 酸 酶(alkaline phosphatase，ALP)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、血 尿 素(blood urea，BUN)、肌 酐(creatinine，CREA)、尿酸(uric acid，UA)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)和血糖(glucose，GLU)，這些指標與小鼠肝臟、腎臟和心血管功能及小鼠的營養狀況密切相關。

1.6 臟器指數統計及病變觀察

實驗期末將小鼠頸椎脫臼處死，取心、肝、脾、肺、腎和卵巢，稱取臟器質量，計算臟器系數。小鼠臟器系數是臟器的質量與體質量的比值，能夠初步反映小鼠整體的健康狀態。隨后，臟器組織用4%的多聚甲醛固定，乙醇脫水后進行石蠟包埋，切片。HE染色后，光學顯微鏡下觀察并記錄。

1.7 統計學方法

應用SPSS 22.0 軟件對數據進行分析。實驗結果數據均采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠攝食量和體質量變化情況

經C7[MIM]Cl 亞急性暴露28 d 后，對照組小鼠狀態無異常，不同劑量C7[MIM]Cl 暴露組灌胃當日部分小鼠活動減少。在持續灌胃28 d 過程中，高劑量組(11.9 mg/kg)有2 只小鼠在第8 天給藥后出現呼吸急促，持續2 h 后死亡。剩余小鼠直至觀察期結束，均存活。小鼠初始體質量為25～27 g，記錄小鼠4、8、12、16、20、24 和26 d 的飼料平均消耗量(因實驗結束前12 h 對小鼠禁食，故飼料消耗量僅統計到第26天)和體質量。與對照組相比，2.38 mg/kg組1～26 d飼料的平均消耗量顯著高于對照組(P＜0.05)，5.95 mg/kg組飼料的平均消耗低于對照組，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。見表1，各組小鼠體質量在0～28 d 增加，C7[MIM]Cl 處理的3 個劑量組體質量增量均低于對照組，但差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表1 小鼠C7[MIM]Cl亞急性暴露28 d的飼料消耗量 g，n=6

表2 小鼠C7[MIM]Cl亞急性暴露28 d不同時間點體質量的變化g，±s，n=6

表2 小鼠C7[MIM]Cl亞急性暴露28 d不同時間點體質量的變化g，±s，n=6

時間/d 0 4 8 12 16 20 24 28體質量增量對照組25.00±1.27 27.14±0.97 27.15±1.05 27.7±1.53 28.29±1.87 28.50±1.90 28.53±2.04 29.12±2.01 4.12±0.98 2.38 mg/kg組26.07±0.59 26.77±0.47 27.03±0.41 27.86±0.78 28.83±0.84 29.22±0.77 30.08±1.24 29.74±0.92 3.04±0.65 5.95 mg/kg組25.03±0.99 25.60±0.47 26.26±0.75 26.63±0.85 27.14±0.85 28.12±0.89 28.06±0.62 28.69±0.64 3.65 ±0.51 11.9 mg/kg組25.02±0.96 26.40±1.01 26.95±0.9 26.52±1.21 27.23±0.82 28.05±1.46 28.47±1.28 28.67±1.46 3.22 ±0.66

2.2 C7[MIM]Cl 亞急性暴露對小鼠血清生化指標的影響

小鼠血清生化指標檢測結果見表3。與對照組相比，C7[MIM]Cl 2.38 mg/kg 組小鼠ALT 水平顯著升高，而BUN、TBIL 和UA 水平顯著降低，差異均具有統計學意義(均為P＜0.05)；5.95 mg/kg 組小鼠血清TBIL、UA、TG和TC水平顯著降低，差異均具有統計學意義(均為P＜0.05)；11.9 mg/kg 組TG、TC 和Glu 水平均顯著降低，差異均具有統計學意義(均為P＜0.05)。這些結果表明，C7[MIM]Cl的亞急性暴露對小鼠的肝臟和腎臟功能產生了顯著影響，且不同暴露劑量對小鼠血清生化指標的影響具有明顯的差異。

表3 C7[MIM]Cl亞急性暴露28 d后對小鼠血清生化指標的影響 ±s，n=6

表3 C7[MIM]Cl亞急性暴露28 d后對小鼠血清生化指標的影響 ±s，n=6

ALT：丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase)；AST：天冬氨酸轉移酶(aspartate aminotransferase)；ALP：堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)；TBIL：總膽紅素(total bilirubin)；BUN：血尿素(blood urea)；CREA：肌酐(creatinine)；UA：尿酸(uric acid)；TG：甘油三酯(triglyceride)；TC：總膽固醇(total cholesterol)和GLU血糖(glucose).與對照組比較，*P＜0.05; **P＜0.01.

指標ALT/(U/L)AST/(U/L)ALP/(U/L)TBIL/(mmol/L)BUN/(mmol/L)CREA/(mmol/L)UA/(mmol/L)TG/(mmol/L)TC/(mmol/L)GLU/(mmol/L)對照組42.51±6.57 157.05±34.78 116.33±37.21 12.96±3.53 6.06±0.78 23.67±4.93 158.71±38.01 1.21±0.25 3.39±0.50 7.19±0.36 2.38 mg/kg組61.23±19.64*170.16±52.35 106.39±13.75 7.99±1.68*5.06±1.00*23.18±4.56 115.75±26.43*1.01±0.12 3.21±0.28 7.30±1.07 5.95 mg/kg組40.39±7.62 155.23±43.07 141.44±45.67 8.23±1.24*4.98±0.72 20.98±2.99 96.69±33.18*0.93±0.12*2.82±0.32*7.41±0.96 11.9 mg/kg組42.63±3.92 202.01±95.07 113.21±21.59 10.84±2.85 5.15±0.58 20.26±7.93 100.69±62.56 0.91±0.03*2.46±0.47*6.17±0.57**

2.3 小鼠臟器系數變化

C7[MIM]Cl經灌胃暴露28 d，各劑量組小鼠的臟器系數如圖1所示。與對照組相比，各劑量暴露組小鼠的心臟、肝、脾和肺的臟器系數差異均無統計學意義(P＞0.05)；而2.38 mg/kg C7[MIM]Cl暴露組小鼠的腎臟系數顯著升高，卵巢系數顯著降低(P＜0.05)。該結果表明，C7[MIM]Cl亞急性暴露對小鼠腎臟和卵巢有較大影響。

圖1 C7[MIM]Cl亞急性暴露小鼠的臟器系數

2.4 C7[MIM]Cl 亞急性暴露對小鼠主要臟器組織形態的影響

取各組小鼠的肝、脾、肺、腎及卵巢進行組織切片染色，觀察C7[MIM]Cl 亞急性暴露對小鼠組織形態的影響。結果如圖2 所示，對照組小鼠肝臟組織結構正常，肝小葉結構清晰、完整，肝細胞排列整齊，未見細胞腫脹、炎性細胞浸潤，組織充血以及組織壞死等病理現象。C7[MIM]Cl暴露組小鼠的肝組織出現了不同程度的炎性細胞浸潤，充血的病理現象。其中，2.38 mg/kg 組有少量炎性細胞浸潤，5.95 mg/kg 組出現少量充血，而11.9 mg/kg 組出現嚴重的充血。脾臟組織切片結果顯示，對照組小鼠脾臟白髓形狀規則，細胞排列規則。C7[MIM]Cl暴露后，脾臟結構模糊，細胞排列松散，且隨著劑量的升高，病理現象更為明顯。肺組織切片結果表明對照組小鼠肺組織的肺泡結構清晰、完整，肺泡隔和肺支氣管結構正常。C7[MIM]Cl暴露小鼠肺組織出現充血，部分肺泡融合以及炎性細胞浸潤等病理現象。并且隨著暴露劑量的增加，肺組織病理性損傷更加嚴重。腎臟HE 染色結果表明對照組小鼠腎臟結構完整，腎小球形態結構正常，腎小管細胞排列整齊，形態結構正常。C7[MIM]Cl暴露組小鼠腎臟組織間出現明顯淤血性腫脹，炎性細胞浸潤，腎小囊間隙狹窄等病理損傷，隨著暴露劑量的增加，腎臟病理特征愈發嚴重。對照組小鼠卵巢組織中卵泡及卵泡內卵母細胞清晰可見，顆粒細胞排列規律。C7[MIM]Cl暴露后，小鼠卵巢組織腫脹，卵泡呈囊性擴張，卵泡內卵母細胞形態模糊或消失。

圖2 C7[MIM]Cl亞急性經口暴露對小鼠臟器組織的影響

3 討 論

越來越多研究報道表明ILs 對生態環境、細胞和哺乳動物均存在一定的毒性，且隨著側鏈長度和濃度的增加，毒性增大[17-18]。ILs具有較好的抗菌活性，通過抑制細菌的增殖破壞生態環境中微生物系統穩態的維持。并且，生態環境中ILs 的暴露，對藻類、高等植物、無脊椎和水生脊椎動物的生長也有顯著影響。如離子液體可破壞藻細胞結構，影響細胞各種功能，從而抑制斜生柵藻、小球藻和羊角月牙藻等藻類的繁殖[5]；水稻和小麥在種植過程中，遭受離子液體污染后，其幼苗的生長也會被抑制，并且遭受氧化應激損傷[19]；在哺乳動物中也發現離子液體暴露可能對小鼠具有腎、肝以及生殖毒性。此外，ILs的大量使用帶來的環境污染，增加了ILs 通過飲用水或食物鏈暴露于人群的風險，給人類健康帶來威脅[6]。因此，ILs毒性的研究可為其科學管理及更好地應用提供重要的毒理學數據參考與理論支持。本研究發現，不同劑量的C7[MIM]Cl 亞急性經口暴露28 d 后可引起小鼠的肝、脾、肺、腎和卵巢一定程度的損傷，且不同暴露劑量的毒性表現有所不同。其中血清生化指標和組織病理切片染色結果表明C7[MIM]Cl 的亞急性暴露對小鼠肝功能和腎功能的影響更為顯著。

肝臟是機體的主要解毒器官，可將親脂性有毒物質轉化為水溶性代謝產物，隨尿液從體內排出，從而有效避免有毒物質的體內蓄積對機體產生損害[20-21]。正常生理條件下，動物血清的轉氨酶、ALP、TG 和TC在一定的范圍內，這些指標的異常波動與肝臟的代謝、功能及機體的營養狀態密切相關[20，22]。血清中轉氨酶活性升高，表明肝細胞損傷，轉氨酶從肝組織釋放到血液[23]。ILs 慢性和急性暴露，均被報道能引起肝、腎等臟器的損傷，導致血清中氨基轉移酶、ALP以及TBIL 等生化指標的上升[14，24-25]。本實驗中，2.38 mg/kg C7[MIM]Cl 暴露28 d 后，小鼠血清ALT 水平顯著高于對照組；5.95 mg/kg 組血清ALT、AST 水平無顯著變化；11.9 mg/kg 組AST 水平上升，但由于組內差異較大，所以與對照組相比，差異無統計學意義。組織病理結果顯示C7[MIM]Cl 暴露的小鼠肝組織出現了不同程度充血性腫脹、組織細胞壞死和炎癥性病變等，且暴露劑量越大，損傷程度越明顯。后續試驗中，需要進一步設計暴露濃度，以探明C7[MIM]Cl 亞急性暴露引起肝臟損傷的劑量-毒性規律。此外，TG，TC 和TBIL 作為肝臟脂質代謝的重要指標，其升高與心血管疾病、甲狀腺功能低下以及糖尿病等密切相關[26]；其降低則與營養不良、甲狀腺功能亢進和腫瘤等的發生與發展密切相關[27]。本實驗中，5.95 mg/kg和11.9 mg/kg C7[MIM]Cl染毒組小鼠血清的TG、TC和TBIL 水平均顯著低于對照組。11.9 mg/kg 染毒組小鼠的GLU水平也顯著低于對照組。而在飼料消耗上，染毒組小鼠平均消耗量低于對照組。這些結果揭示C7[MIM]Cl亞急性暴露可通過抑制小鼠的進食，影響小鼠的食物攝入，進而影響小鼠的營養狀態。

腎臟是毒性物質代謝和排泄的重要器官，極易受到毒性物質的攻擊，因此成為毒性物質毒理學評價中備受關注的器官[28-29]。BUN、CREA 和UA 的水平與腎臟功能密切相關，這些指標的升高與腎臟損傷性病變密相關[30]。本實驗中，表征腎臟功能的血清生化指標結果顯示，C7[MIM]Cl 亞急性暴露導致小鼠UA 和BUN水平低于對照組。該結果表明腎臟是C7[MIM]Cl 亞急性暴露重要的靶器官。

隨著離子液體的廣泛使用，不可避免地造成了其環境排放和在食物鏈及食品中的遷移，因此離子液體安全性成為國內外學者關注的重點。而烷基咪唑型ILs亞急性染毒對生物體，尤其是哺乳動物的毒性研究仍較為缺乏。本研究通過C7[MIM]Cl 灌胃染毒昆明小鼠28 d，觀察到各劑量組小鼠肝、脾、肺、腎、卵巢均出現一定程度的損傷，其中肝臟和腎臟的損傷最為明顯。血清生化指標以及病理觀察僅表明C7[MIM]Cl 具有亞急性毒性，但其劑量-毒性規律以及毒性機制尚不明確。因此，在后續研究中，需要設計實驗，進一步解析C7[MIM]Cl 的毒性量效關系，并結合分子實驗闡明毒性機制。