不同表型的利川雞爪黃連的形態學和生物學活性差異研究

方昕悅, 李 宇, 冉亞蘭, 龍入海, 楊永康, 張喬會, 譚生權, 何美軍*

(1.湖北省農業科學院中藥材研究所/農業農村部中藥材生物學與栽培重點實驗室/國家中藥材產業技術體系恩施綜合試驗站, 湖北 恩施 445000;2.恩施土家族苗族自治州農業農村局, 湖北 恩施 445000; 3.利川市農業農村局, 湖北 利川 445400;4.恩施土家族苗族自治州農業科學院, 湖北 恩施 445000; 5. 恩施土家族苗族自治州中心醫院, 湖北 恩施 445000)

雞爪黃連為毛茛科植物味連(CoptischinensisFranch)的根莖,形似雞爪習稱雞爪黃連,是黃連中的名貴品種,湖北省利川市是其主要產地之一[1-2].黃連味苦、性寒,具有燥濕瀉火、清熱解毒的作用,現代藥理學研究表明黃連中的主要活性成分為鹽酸小檗堿又稱黃連素,具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降血脂等藥理活性[3-5].

致病細菌引起的嚴重感染及其對抗生素的耐藥性,已成為制藥和醫學界面臨的最大醫療威脅之一,2019年全球疾病負擔數據顯示全球約有495萬人的死亡與耐藥細菌相關(https://www.healthdata.org/research-article/global-burden-bacterial-antimicrobial-resistance-2019-systematic-analysis)[6].雖然抗生素耐藥性的產生是一種自然的進化現象,但在人類醫學和預防個體疾病的過程中,抗生素的濫用和過度使用加劇了耐藥性的產生.鑒于這一嚴重的全球威脅,世衛組織發出警告,如果不采取行動,任由耐藥性的持續增加,到2050年可能會膨脹到每年1 000萬人死亡[7].因此,尋找新型抗生素已迫在眉睫,目前從傳統中藥中尋找合適的聯用品或替代品已成為趨勢.

自由基是機體新陳代謝產物,當機體氧化防御系統不能清除多余的自由基時或自由基積累過多時會引起細胞氧化損傷,進而引起如肝癌、肝損傷等氧化應激性疾病[8].黃連為中醫臨床常用藥材,由于抑菌效果廣泛,素有“中藥抗生素”之稱[9],且研究發現黃連生物堿[10]、黃連多糖[11]等具有較好的抗氧化活性,是天然抗氧化劑重要來源.隨著課題組多年的研究實踐發現,雞爪黃連存在大葉、細葉兩種顯著且穩定遺傳的性狀分離,不同性狀的黃連產量差異巨大.因此,開展對不同表型黃連的鹽酸小檗堿含量、抑菌、抗氧化活性研究,為后期開展雞爪黃連優質育種和臨床用藥提供科學依據.

1 材料

1.1 藥材與試劑

4年生黃連樣品采集于利川市建南鎮板坪村黃連藥材基地,由湖北省農業科學院中藥材研究所何美軍副研究員鑒定.鹽酸小檗堿標準品國家藥品標準物質,購于中國食品藥品檢定研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購自阿拉丁試劑公司;乙腈、甲醇,色譜純,購自美國邁瑞達公司;乙醇,分析純,購自國藥集團;氯化鈉,分析純,武漢市中天化工有限責任公司;酵母提取物、胰蛋白胨(OXOID)均購自生工生物工程股份有限公司.

十二株供試菌種(表1)由中國科學院熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室鑒定提供.

表1 供試革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)類型

1.2 儀器與設備

C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,安捷倫科技有限公司)、Q5200DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)、CR-80CO2培養箱(廣州市康恒儀器有限公司)、德國SIGMA離心機(希格瑪實驗室離心機公司)、BC-R208型旋轉蒸發儀(上海貝凱生物化工設備有限公司)、酶標儀(北京華安麥科生物技術有限公司)、THZ-B氣浴恒溫振蕩器(常州杰博森儀器有限公司)、HDL超凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)、立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)、真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)等.

2 方法

2.1 形態差異分析

在基地中隨機選取利川黃連大小表型的樣品各3 株,測定并記錄株高和葉片數、葉柄長度、葉片寬度、葉綠素含量(soil and plant analyzer development, SPAD),單株總生物量、干重,3 次重復.運用SPSS 軟件,采用單因素方差統計分析不同表型的黃連性狀差異.

2.2 鹽酸小檗堿含量HPLC檢測;

參考劉洋等[12]方法并改良,黃連樣品烘干、粉碎過篩(40目),超聲輔助甲醇提取,料液比1∶20,超聲功率250 W,超聲溫度50 °C,提取時間50 min;旋轉蒸發濃縮,冷凍干燥成粉末備用.稱取鹽酸小檗堿標準品5.15 mg,用乙腈溶解,定容至10 mL量瓶中,作為鹽酸小檗堿標準品貯備液,濃度為0.515 mg·mL-1.色譜條件:Agilent色譜柱C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A相水溶液(1%乙酸),B相乙腈(1%乙酸);柱溫25 °C;檢測波長270 nm;流速1 mL·min-1;進樣量20 μL.梯度洗脫條件:時間5 →25 min,A相100% →20%;時間25.1 →30 min,A相20% →100%.

2.3 抑菌活性測定

抑菌活性初篩[13]:采用濾紙片法,取200 μL 培養至D(600)=0.6的菌懸液與20 mL LB固體培養基混合均勻倒平板,將無菌濾紙片置于凝固好的混有菌液的固體培養基上.將兩種供試藥液、氨芐青霉素、二甲基亞砜分別取10 μL滴加于濾紙片(直徑為8.00 mm)上,37 ℃恒溫培養24 h后測量抑菌圈大小.參照抗生素藥敏標準(抑菌圈直徑):高敏(≥20 mm)、中敏(10～<20 mm)、輕敏或耐藥(0～<10 mm),對其抑菌能力進行判斷.

最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)與最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)的測定[14]:將大葉、小葉黃連甲醇提取物用二乘稀釋法制成系列濃度梯度的供試藥液,在96孔細胞培養板第3～12列的每孔加入含不同濃度的黃連甲醇提取物樣品的LB液體培養基100 μL.分別將菌懸液稀釋1 000倍,在每孔加入稀釋菌液100 μL,37 °C培養18 h后使用HP4500酶標儀檢測D(600).第1列為空白培養基對照組,第2列為空白提取物對照組,另設氨芐青霉素96孔板作陽性對照組,根據CLSI M100-S25標準:與陽性生長對照組比較,抑制80%細菌生長的藥物濃度為受試菌的MIC值.取200 μL 供試菌液均勻涂布于含有不同藥物濃度的平板培養基表面,37 ℃培養24 h,以剛好無菌落生長的濃度為MBC值.

2.4 抗氧化活性測定

取黃連提取物加無水乙醇配制成濃度為100 mg·mL-1的母液,加無水乙醇稀釋成濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1的系列待試液,同時運用抗壞血酸作為陽性對照藥物,參照彭曉婷等[15]方法,取不同濃度待測液2.0 mL,加入200 μmol·L-1DPPH溶液2.0 mL,搖勻,置于30 ℃水浴鍋中避光反應30 min.無水乙醇調零,517 nm處測定D試樣.對照組D對照:樣品溶液2.0 mL+無水乙醇2.0 mL.D0:2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL無水乙醇.不同濃度進行3組重復.清除率計算公式如下:DPPH清除率/%=[1-(D試樣-D對照)/D0]×100.運用GraphPad Prism 8對DPPH 自由基清除率結果進行回歸分析,計算半數抑制濃度(IC50).

2.5 數據分析

所有實驗數據運用SPSS 25.0 軟件進行統計分析,實驗數據以“平均值±標準偏差”表示.p<0.05,表明具有顯著性差異,p<0.01,表明具有極顯著性差異.

3 結果與分析

3.1 形態及小檗堿含量差異分析

如圖1,黃連大葉植株平均株高31.83±2.66 cm,葉柄長度11.81±1.85 cm,葉片寬 7.46±0.66 cm,葉綠素平均含量(SPAD)為43.41±1.28,鮮重30.47±12.19 g,干重9.07±2.93 g.黃連小葉植株平均株高21.33±1.25 cm、葉柄長度11.81±1.85 cm、葉片寬6.56±0.75 cm,葉綠素平均含量(SPAD)為35.76±1.98,鮮重3.87±0.31 g,干重1.97±0.24 g.HPLC檢測大小葉兩種表型的鹽酸小檗堿的保留時間為16.24 min,含量分別為: 13.3±0.9μg·g-1和41.2±2.24 μg·g-1(圖1 b).

a. 大葉黃連(1)與小葉黃連(2)的形態學特征;b.兩種黃連的HPLC圖

兩種表型的黃連(大葉、細葉)的株高、葉柄長度、葉綠素含量、小檗堿含量是具有極顯著性差異的,干重和鮮重是具有顯著性差異,而葉片數、須根長、葉片寬度不具有顯著性差異(表2).

表2 不同表型黃連的形態學差異統計

3.2 抑菌活性測定

濾紙片法顯示,大葉黃連甲醇提取物對糞鏈球菌、藤黃微球菌、蘇云金芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、多耐銅綠假單胞菌等七種供試菌有較好的抗菌作用(抑菌圈直徑>10 mm),其對應的抑菌圈直徑分別為13.48±0.09、10.01±0.33、16.31±0.24、15.06±0.65、14.41±0.29、15.42±0.27、14.24±0.32 mm,但是對糞鏈球菌、藤黃微球菌的抑菌活性顯著低于其他5種供試菌.小葉黃連甲醇提取物對糞鏈球菌、蘇云金芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、多耐銅綠假單胞菌等六種供試菌有較好的抗菌作用(抑菌圈直徑>10 mm),其對應的抑菌圈直徑分別為12.05±0.15、15.88±0.39、12.07±0.03、11.85±0.4、11.32±0.18、12.39±0.18 mm(圖2),且對蘇云金芽孢桿菌的抑菌活性顯著強于其他5種供試菌.大葉、細葉黃連均顯示出對多重耐藥菌MRSA強的抑菌活性,但是抗生素拉卡霉素(kan)無抑菌圈顯示(圖3).

圖2 黃連不同表型對12種供試細菌的抗菌作用

圖3 抗生素對12種供試細菌的抗菌作用

進一步的MIC值檢測,大葉黃連甲醇提取物對糞鏈球菌、藤黃微球菌、蘇云金芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、多耐銅綠假單胞菌等七種供試菌的MIC值分別為3.91、7.81、7.81、7.81、3.91、7.81、7.81 mg·mL-1,顯示大葉黃提取物連對糞鏈球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌活性最強.小葉黃連甲醇提取物對糞鏈球菌、蘇云金芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、多耐銅綠假單胞菌等六種供試菌的MIC值分別為10.94、10.94、21.88、21.88、21.88、21.88 mg·mL-1,顯示小葉黃連提取物對糞鏈球菌和蘇云金芽孢桿菌的抗菌活性最強(表3).通過比較兩種不同表型的雞爪黃連抑菌活性,發現大葉黃連對糞鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、多耐銅綠假單胞菌的抑菌活性顯著優于小葉黃連;同時大葉黃連對糞鏈球菌的抑菌活性顯著優于卡拉霉素(kan),對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑菌活性與卡拉霉素沒顯著差異.

表3 黃連不同表型對12種供試細菌的抗菌作用

3.3 抗氧化活性測定

如圖4和圖5所示,在濃度0.1～0.8 mg·mL-1濃度范圍內,兩種表型黃連提取物對DPPH自由基的清除作用均具有線性關系(R≤0.999):大葉黃連y=107.3x+8.436,小葉黃連y=131.2x+15.97;IC50分別為 0.387、0.259 mg·mL-1,利川雞爪黃連甲醇提取物對DPPH自由基有很好的清除能力,且小葉表型的清除能力優于大葉表型(圖4),但兩者的DPPH自由基清除能力低于陽性藥物抗壞血酸(IC50為 0.072 mg·mL-1,圖5).

圖4 黃連不同表型抗氧化作用測定結果

圖5 抗壞血酸抗氧化作用

4 討論

黃連是我國傳統名貴藥材,用藥歷史悠久.利川是黃連主產區之一,人工種植黃連已有百年歷史之久,但由于其生長極其緩慢、品種混雜等問題,關于黃連育種工作困難且報道較少[16].本實驗選用的實驗材料為利川建南鎮培育:4年生大葉雞爪黃連的平均株高31.83±2.66 cm、葉柄長度15.77±2.05 mm、葉綠素含量43.41±1.28、鮮重30.47±12.19 g、干重9.07±2.93 g;形態學差異顯著的4年生小葉雞爪黃連的株高為21.33±1.25 cm、葉柄長度11.81±1.85 mm、葉綠素含量35.76±1.98、鮮重3.87±0.31 g、干重1.97±0.24 g;小葉雞爪黃連的鹽酸小檗堿含量(41.2±2.24 μg·g-1)顯著高于大葉雞爪黃連(13.3±0.9μg·g-1).

隨著抗菌藥物的濫用、不合理使用等現象增多,導致包括金黃色葡萄球菌等臨床常見致病菌的耐藥性增強[17].以黃連為代表的中草藥具有一定的抗菌功效,在預防與控制細菌性感染中經常發揮著重要的作用,具有副作用小、來源廣、費用低、細菌極少產生耐藥性等特點[18],蔣麗施等[19]研究發現味連對金黃色葡萄球菌具有很好的抑制效果,其MIC值為3.125 mg·mL-1,對肺炎克雷伯氏菌的MIC 值在 12.5～25 mg·mL-1的范圍.潘彥榮等[20]研究發現黃連提取液對金黃色葡萄球菌有較強的抑菌功效,抑菌濃度為 0.063 g·mL-1.本研究發現大葉雞爪黃連對7株供試菌有較好的抑菌作用,MIC值范圍為3.91～7.81 mg·mL-1;小葉黃連對6種供試菌有較好的抑菌作用,MIC值范圍10.94～21.88 mg·mL-1,雞爪黃連對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有較廣抗菌譜.

目前隨著自由基和抗氧化劑深入的研究,有關二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)、丁羥基茴香醚(butyl hydroxyanisole,BHA)等人工合成抗氧化劑的生理毒害作用逐漸被報道,天然抗氧化劑的開發和利用越來越受到人們的廣泛重視[21].有研究發現肉桂[22]、關黃柏[23]、淫羊藿[24]以及黃連[25]等中草藥具有很好的抗氧化活性,可作為天然抗氧化劑的來源.現代藥理學研究發現黃連具有抗氧化活性,能抑制體外紅細胞的自氧化溶血,提高機體抗氧化能力,減少自由基的毒副作用,減輕肝損傷[26-28].彭曉婷等[14]研究發現黃連及黃連須、黃連莖對DPPH的清除率IC50分別為0.843、0.673、2.097 mg·mL-1.本實驗的兩種不同表型雞爪黃連植株均有更強的DPPH自由基清除能力,其IC50值分別為0.387、0.259 mg·mL-1,且表型為小葉的抗氧化活性較大葉的抗氧化活性好,有助于中醫藥行業的快速發展.