Notch信號(hào)通路調(diào)控巨噬細(xì)胞極化在大鼠纖維化型飼鴿者肺的作用

王文藝 彭真 楊曉紅 鄔超

飼鴿者肺(pigeon breeders’lung,PBL)是反復(fù)吸入鴿子羽毛、皮屑等脫落物后誘發(fā)的肺部炎癥反應(yīng)性疾病[1-2]。其發(fā)病依賴于吸入致敏原,致敏原被肺巨噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬,與特異性IgG結(jié)合形成免疫復(fù)合物,通過補(bǔ)體激活活化巨噬細(xì)胞[3-4]。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)是肺纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子,參與肺纖維化的形成[5]。Notch信號(hào)通路是巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器,在不同環(huán)境刺激下極化為經(jīng)典活化M1型巨噬細(xì)胞和旁路活化M2型巨噬細(xì)胞,M1型巨噬細(xì)胞增多促進(jìn)炎癥的進(jìn)展,M2型巨噬細(xì)胞增多促進(jìn)肺纖維化的進(jìn)展[6],γ分泌酶抑制劑(DAPT)阻斷Notch信號(hào)通路,可直接或間接的影響巨噬細(xì)胞的促炎功能及部分炎癥因子的轉(zhuǎn)錄[7]。課題組前期發(fā)現(xiàn)纖維化期Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路異常表達(dá)與巨噬細(xì)胞的極化相關(guān),故推測(cè)Notch信號(hào)通路可能通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化方向影響纖維化型飼鴿者肺的發(fā)展。

資料與方法

一、一般資料

本研究采用的清潔級(jí)健康成年SD大鼠(sprague-dawley rat,SD Rat)6～8周齡27只,不限雌雄,(Wt:180～200 g)。所有動(dòng)物均購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào)[SCXK(滬)2018-0006]。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度21℃～25℃,相對(duì)濕度45%～50%,用標(biāo)準(zhǔn)大鼠箱飼養(yǎng),2～3只/箱,水料充足,換氣次數(shù)1～2次/天,氣流速度0.1～0.2 cm/s,環(huán)境噪聲控制在60dB以下,照明15～20lx。檢疫1周后用于實(shí)驗(yàn)。所有操作和實(shí)驗(yàn)流程均遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》,已通過新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意(2019030615)。

二、方法

1 建立疾病模型 正常對(duì)照組(Ctrl組)0.9%生理鹽水氣道內(nèi)滴入1次/周,持續(xù)4周,培育至20周;模型組(M組):凍干粉氣道內(nèi)滴入1次/周,連續(xù)4周,將老鼠培育至20周;給予DAPT抑制劑組(M+DAPT組):造模開始給予γ分泌酶抑制劑(DAPT 0.05 mg/kg腹腔注射)干預(yù),每周2次,持續(xù)4周,造模結(jié)束后每周1次,持續(xù)到20周實(shí)驗(yàn)結(jié)束,腹腔注射戊巴比妥鈉(10 mg/kg)過麻處死大鼠,留取左肺組織,取右肺肺泡灌洗液備用。

2 肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 取肺泡灌洗液,按實(shí)驗(yàn)要求調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL,細(xì)胞吹打混勻后,移入鋪有圓形載玻片的24孔板中,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h,用D-hanks液體沖洗,貼壁細(xì)胞孔中加入RPMI1640培養(yǎng)基2mL,隔2天進(jìn)行半量換液,培養(yǎng)7天,得貼壁的巨噬細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn),免疫熒光檢測(cè)CD68鑒定巨噬細(xì)胞,分離的巨噬細(xì)胞CD68染色陽性,純度達(dá)95%以上為合格(見圖1)。

圖1 大鼠肺泡巨噬細(xì)胞鑒定免疫熒光圖(×400)

3 Western Blot檢測(cè)α-SMA、TGF-β1及Notch信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá) 本研究所用電泳系統(tǒng)由Bio-Rad公司出品的Mini-PROTEAN 3(MP3)電泳槽和Mini-PROTEAN 3緩沖液槽及蓋組成,轉(zhuǎn)膜儀為Bio-Rad公司出品的Trans-Blot SD濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印槽。取出-80℃冷凍肺組織,20～50mg左右,加緩沖液組織剪碎,研磨,用濾網(wǎng)200目過濾,標(biāo)本制備成勻漿,用預(yù)冷 PBS 洗滌細(xì)胞 3 次后加入RIPA細(xì)胞裂解液,提取細(xì)胞蛋白,BCA 法測(cè)定并調(diào)整蛋白濃度,進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜,50g/L 脫脂奶粉封閉2 h后TBST洗膜3次(10 min/次),并按照說明書要求滴加一抗、二抗,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),對(duì)所顯影的蛋白條帶用ImageJ檢測(cè)其灰度值,采用于Tanon5200化學(xué)發(fā)光成像儀拍照,獲取圖片。

4 熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)阻斷Notch通路對(duì)巨噬細(xì)胞極化方向的影響 本研究采用TRIzolRNAiso Plus(Takara,9108,即Trizol)法提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)步驟按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作[PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara,RR047A,即逆轉(zhuǎn)錄試劑盒),定量PCR根據(jù)上述反應(yīng)體系加入各種反應(yīng)試劑,是混勻好的試劑,里面有Taq polymerase,dNTP,Sybr green(SYBR?Premix Ex Taq(Takara,RR820A)]染液,反應(yīng)緩沖液。整個(gè)試劑配制體系在冰上配制,根據(jù)上述反應(yīng)體系輕輕混勻后,將8連管用蓋子蓋好后,在離心機(jī)中瞬時(shí)離心將貼在管壁上的液體沉到底部。將8連管放入定量PCR檢測(cè),采用以上反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)結(jié)束后,直接將8連管丟棄,直接根據(jù)儀器收集的數(shù)值對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析即可,引物(見表1)。

表1 巨噬細(xì)胞引物標(biāo)記基因的引物

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析,所有定量數(shù)據(jù)在符合正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)后,多組間比較使用單因素方差分析,LSD-t法進(jìn)行多組樣本均數(shù)間的兩兩比較,P<0.05表示其差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、動(dòng)物模型制備

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果20周時(shí)大鼠出現(xiàn)纖維化改變,故本研究選取18只纖維化大鼠分為2組,即大鼠飼鴿者肺纖維化模型及DAPT抑制劑干預(yù)組,正常對(duì)照組9只,采用HE及Masson染色檢測(cè)各組大鼠病理變化,Ctrl組肺組織未見炎癥及纖維化改變,M組可見肺間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤明顯,細(xì)支氣管及腺體周圍纖維組織和平滑肌組織明顯增生,肺泡間隔增寬,肉芽腫及肉芽腫中心纖維化形成。M+DAPT組炎細(xì)胞浸潤及纖維化程度明顯減低,未見明確肉芽腫形成(見圖2)。

圖2 三組大鼠肺組織HE染色及Masson染色病理圖表現(xiàn)

二、肺部CT變化

20周時(shí)正常對(duì)照組肺部影像學(xué)未見纖維化形成,大鼠纖維化型飼鴿者肺20周時(shí)雙肺可見網(wǎng)格影及部分區(qū)域內(nèi)呈蜂窩樣改變,考慮符合纖維化改變,給予DAPT抑制劑干預(yù)后可延緩纖維化形成(見圖3)。

圖3 三組大鼠間肺部影像學(xué)表現(xiàn)

三、α-SMA、TGF-β1及Notch信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)結(jié)果

與Ctrl組比較:α-SMA纖維化期M組患者α-SMA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增高(P<0.05);TGF-β1纖維化期M組患者TGF-β1表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增高提示大鼠纖維化型飼鴿者肺造模成功;給予DAPT抑制劑后TGF-β1蛋白表達(dá)水平較纖維化期降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而α-SMA蛋白表達(dá)量較纖維化期下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。M組與Ctrl組比較:纖維化型過敏性肺炎大鼠肺組織Notch信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白配體DLL1、DLL4、JAG1、JAG2及受體Notch1、Notch2的蛋白表達(dá)水平增高;應(yīng)用DAPT抑制Notch信號(hào)通路后DLL4、JAG1、JAG2及受體Notch1均下降(P<0.05);而DLL1、Notch2蛋白表達(dá)水平下降,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2及圖4)。

表2 α-SMA、TGF-β1及Notch信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)結(jié)果

圖4 三組大鼠間a-SMA、TGF-β1及Notch信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)

四、M1型巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記基因的mRNA表達(dá)結(jié)果

M組與Ctrl組比較:纖維化型過敏性肺炎大鼠肺組織巨噬細(xì)胞M1型標(biāo)記基因TNF-α、iNOS mRNA表達(dá)量下降;巨噬細(xì)胞M2型標(biāo)記基因Mrc2、Arg-1 mRNA表達(dá)量升高(P<0.05),應(yīng)用DAPT抑制Notch信號(hào)通路后TNF-α、iNOS基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量升高,Mrc2、Arg-1 基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)(見表3和圖5)。

表3 M1型、M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記基因 mRNA表達(dá)水平

討 論

前期已在新疆喀什地區(qū)“新疆新投鴿葉有限公司”鴿舍內(nèi)收集的鴿子脫落物成功制作了纖維化型過敏性肺炎動(dòng)物模型。本研究按照前期研究使用鴿子糞、羽毛、皮屑等脫落提取物制作凍干粉蛋白溶于生理鹽水中,每周一次氣道滴入制作的大鼠動(dòng)物模型HE染色細(xì)支氣管壁增厚纖維化明顯,血管周圍見小灶肉芽腫,腺體增生,肺泡間隔增寬;Masson染色提示肺間質(zhì)纖維化明顯,橋狀纖維化形成,細(xì)支氣管管壁明顯增生纖維化,肺泡腔塌陷,部分消失;文獻(xiàn)提示纖維化型過敏性肺炎通常以細(xì)支氣管為中心,可以出現(xiàn)橋接纖維化、小葉周圍或肺膜下纖維化及顯微鏡下蜂窩肺區(qū)域。研究表明TGF-β1 和 α-SMA 是關(guān)鍵致纖維化因子[8],本研究中纖維化期α-SMA、TGF-β1表達(dá)水平增高,表明在成纖維細(xì)胞持續(xù)性分化增殖的過程中二者協(xié)同參與肺纖維化的形成,證實(shí)纖維型飼鴿者肺造模成功。

Notch信號(hào)通路是高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在肺的穩(wěn)態(tài)、損傷和修復(fù)中起著關(guān)鍵作用[9]。研究發(fā)現(xiàn):纖維化型過敏性肺炎大鼠肺組織Notch信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白配體DLL1、DLL4、JAG1、JAG2及受體Notch1、Notch2的蛋白表達(dá)水平增高;應(yīng)用DAPT抑制Ntoch信號(hào)通路后DLL4、JAG1、JAG2及受體Notch1均下降;而DLL1、Notch2蛋白表達(dá)水平下降,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示Notch信號(hào)通路在纖維化飼鴿者肺中起作用。在文獻(xiàn)中報(bào)道巨噬細(xì)胞的活化及分化總伴隨著Notch1、Notch2受體表達(dá)的增加;在一定范圍內(nèi),Notch 信號(hào)通路激活促進(jìn)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng),而巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)或自身Notch信號(hào)通路激活可以使 Notch受體、配體表達(dá)增加[10-12]。Notch信號(hào)的抑制因子DAPT能夠以一種時(shí)間和劑量依賴模式抑制CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖,阻斷肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),延緩肺纖維化發(fā)生、發(fā)展。

不同的病理?xiàng)l件下,Notch通路可以決定巨噬細(xì)胞的M1/M2激活模式[13]。本研究結(jié)果表明:纖維化型過敏性肺炎大鼠肺組織巨噬細(xì)胞M1型標(biāo)記基因TNF-α、iNOS mRNA較正常對(duì)照組比較表達(dá)量下降;巨噬細(xì)胞M2型標(biāo)記基因Mrc2、Arg-1 mRNA表達(dá)量升高(P<0.05),表明予以致敏原刺激后,大鼠纖維化型飼鴿者肺中巨噬細(xì)胞向M2方向極化,應(yīng)用DAPT抑制劑后TNF-α、iNOS基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量升高,Mrc2、Arg-1 基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低,表明M2型極化發(fā)生了減少,巨噬細(xì)胞向M1型方向極化;表明Notch信號(hào)通路存在使巨噬細(xì)胞易于向M1型分化,當(dāng)DAPT抑制劑阻斷信號(hào)通路時(shí),抑制巨噬細(xì)胞向M2型分化;而我們?cè)陲書澱叻卫w維化型大鼠動(dòng)物模型中也發(fā)現(xiàn)了這一特點(diǎn),與Ye C,Li H等人在急性肺損傷中研究的巨噬細(xì)胞極化方向結(jié)果一致[14]。表明M2巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生促纖維化介質(zhì),促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞增殖[15]。而本研究中大鼠已經(jīng)處于肺纖維化狀態(tài),且表現(xiàn)出巨噬細(xì)胞向M2型極化增多的現(xiàn)象,表明飼鴿者肺纖維化型的大鼠動(dòng)物模型中巨噬細(xì)胞向M2型極化受Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT的影響。

從本實(shí)驗(yàn)我們看到Notch信號(hào)通路可能調(diào)控巨噬細(xì)胞極化參與大鼠纖維化型飼鴿者肺發(fā)生發(fā)展,實(shí)驗(yàn)研究本就是在摸索中前進(jìn),后期我們會(huì)探討巨噬細(xì)胞敲除后纖維化型飼鴿者肺的關(guān)系進(jìn)一步闡明纖維化型過敏性肺炎的免疫學(xué)機(jī)制。