蠶豆細(xì)胞器基因組密碼子的使用情況分析

包國(guó)媛，祁樂萍，馬 娟，楊鑫光，王久利，2

（1.青海民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院，西寧 810007；2.青海民族大學(xué)青藏高原資源化學(xué)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810007）

蠶豆（Vicia faba.L）在世界豆類中占有重要地位，具有較高的食用價(jià)值.蠶豆果實(shí)富含淀粉和蛋白質(zhì)，氨基酸種類齊全，還含有豐富的礦物質(zhì)鎂、磷、硒等，同其他植物性食物相比，蠶豆中脂肪含量較少且可提供人體生活所需的多種元素.傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為蠶豆具有健脾、降血脂的功效，蠶豆葉可用于止血和解毒[1].蠶豆由于具有較高的單寧和Vc 含量，其營(yíng)養(yǎng)水平和加工品質(zhì)受到一定程度的限制.農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上通過育種可提高蠶豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]，常用育種方法有純合品系法、人工雜交育種、生態(tài)育種等，目前研究發(fā)現(xiàn)，線粒體和葉綠體工程育種也是可行的途徑[3-4].

葉綠體和線粒體都是綠色植物細(xì)胞中的半自主細(xì)胞器[4]，具有能量轉(zhuǎn)化的功能[5]，在遺傳上都具有相對(duì)獨(dú)立的穩(wěn)定性，含有少量DNA，并且與細(xì)胞質(zhì)遺傳有關(guān)，具有能獨(dú)立遺傳的基因組.與其他細(xì)胞器相比，葉綠體基因組相對(duì)較小，通常只有幾十至幾百個(gè)基因[6]，葉綠體基因組在進(jìn)化過程中的變化速率相對(duì)較快，但也具有較高的結(jié)構(gòu)保守性[7]. 線粒體基因組具有重排進(jìn)化快、葉綠體DNA 插入等結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[8].相對(duì)于植物全基因組和葉綠體基因組，植物線粒體基因組的密碼子使用模式研究尚不充分[9].近年來細(xì)胞器基因組的密碼子使用情況引起了廣泛關(guān)注，已針對(duì)石竹屬（Dianthus）[10]、蘋果屬（Malus）[11]、玉蘭屬（Yulania）[12]、癩屑化松蘿（Usnea lapponica）[13]、萵苣（Lactuca sativa）[14]等進(jìn)行了深入研究.密碼子是自然界中遺傳信息準(zhǔn)確識(shí)別和傳遞的基本載體[15]，編碼同一種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（synonymous codon）[16]，在遺傳和變異的過程中密碼子偏好性在自然界中起著重要作用[15].在蛋白質(zhì)翻譯過程中，每個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的某一同義密碼子的使用頻率高于其他同義密碼子的使用頻率，即為密碼子偏好性（codon usage bias）[17].翻譯過程中，每個(gè)氨基酸相對(duì)應(yīng)同義密碼子的使用頻率不同，物種存在著自身特有的進(jìn)化方式，根據(jù)該方式偏向于使用某一特定密碼子，從而形成該物種特有的使用模式[18]，密碼子使用模式會(huì)影響特定基因的表達(dá)水平和功能[19].密碼子偏性強(qiáng)，說明該物種趨向于使用特定的密碼子，這可能會(huì)導(dǎo)致其生物體中的某些基因具有更高的表達(dá)水平.由于特定密碼子在翻譯過程中的結(jié)合能力更強(qiáng)，因此它們?cè)诜g過程中的翻譯速率和效率也更高，可能會(huì)導(dǎo)致更高的表達(dá)水平[20].隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，許多生物的基因組序列逐漸被揭示出來.對(duì)這些序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明生物的密碼子使用模式受多種因素的影響，包括堿基突變、自然選擇等[19，21].在長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化過程中，這些因素可能會(huì)導(dǎo)致一些物種出現(xiàn)密碼子偏好性的變化，從而影響到相關(guān)基因的表達(dá)和功能.因此，深入研究密碼子的使用規(guī)律對(duì)于理解生物進(jìn)化和遺傳的調(diào)控機(jī)制具有重要意義.

本研究對(duì)蠶豆線粒體和葉綠體基因組密碼子的使用模式及使用偏好性進(jìn)行了比較和分析，篩選出最優(yōu)密碼子.研究旨在為蠶豆線粒體和葉綠體基因組研究提供參考，并有助于優(yōu)化其基因表達(dá)和工程設(shè)計(jì).

1 材料與方法

1.1 蠶豆細(xì)胞器基因組序列的獲取

從NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中下載蠶豆線粒體基因組和葉綠體基因組序列（GenBank登錄號(hào)分別為KC189947.1 和KF042-344.1[22]），基因組序列全長(zhǎng)分別為588 000 bp 和123 722 bp.為了提高密碼子偏好性分析的準(zhǔn)確性，從完整序列中提取編碼序列（coding sequence，CDS）或開放閱讀框（open reading frame，ORF），剔除長(zhǎng)度小于300 bp 的序列，保留重復(fù)基因中的一個(gè)，去除非ATG 作為起始密碼子的序列，刪掉異常終止密碼子和CDS 內(nèi)部存在終止密碼子的序列. 將篩選后得到的線粒體基因組的129 個(gè)CDS（或ORF）和葉綠體基因組的49 個(gè)CDS 序列作為后續(xù)分析的樣本.

1.2 密碼子堿基組成分析

分別將符合條件的序列整合到一個(gè)fasta 文件中，利用Codon W 1.4.2 軟件和CUSP 在線軟件對(duì)篩選后的蠶豆CDS 序列進(jìn)行分析，根據(jù)perl 腳本計(jì)算每個(gè)基因的密碼子數(shù)量（codon number，CN）、GC 含量（分別為GC1、GC2、GC3、GC3s）及3 位堿基的GC 平均含量（GCall）、有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENC）、同義密碼子相對(duì)使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）.采用SPSS 18.0 軟件對(duì)密碼子偏好性相關(guān)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析.

1.3 中性（neutrality plot）繪圖分析

以蠶豆細(xì)胞器基因組GC1和GC2的平均值（GC12）為縱坐標(biāo)，以GC3為橫坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，其中每個(gè)散點(diǎn)代表1 個(gè)基因，以此判斷密碼子使用偏好性受自然選擇和突變壓力影響的程度[23].若GC3與GC12呈顯著相關(guān)關(guān)系，說明堿基組成無差異，突變是其主要影響因素；反之則說明基因組中GC 含量有較高保守性，自然選擇對(duì)密碼子使用偏好性有較大影響[24].

表1 ENC 比值分布表Tab.1 Distribution of ENC ratio

1.4 ENC-plot 分析

ENC-plot 繪圖分析包含散點(diǎn)圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，標(biāo)準(zhǔn)曲線代表無選擇壓力存在時(shí)密碼子偏好性完全由突變決定，即完全由核酸序列組成決定密碼子偏性[25]. 根據(jù)公式（1）計(jì)算ENC 期望值（ENCexp），以GC3為橫坐標(biāo)、ENCexp為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.根據(jù)公式（2）計(jì)算ENC 比值，可以更直觀地判斷密碼子偏性的主要影響因素.ENC 的取值范圍為20～61，數(shù)值越接近20 偏性越強(qiáng)，ENC 值為61 時(shí)說明每個(gè)密碼子被均勻使用[26].

式（2）中：ENCobs為ENC 實(shí)際值.

1.5 PR2-plot 分析

分析各密碼子第3 位上的A、T、C、G 含量，以G3/（G3+C3）為橫坐標(biāo)、A3/（A3+T3）為縱坐標(biāo)進(jìn)行PR2-plot分析，衡量第3 位堿基組成的使用偏性.當(dāng)?shù)? 位堿基使用頻率A=T、C=G 時(shí)，密碼子無使用偏性；若偏離中心，由中心點(diǎn)（A=T，G=C）發(fā)出的矢量表示該密碼子偏移的程度和方向[27].

1.6 最優(yōu)密碼子的確定

以蠶豆每個(gè)基因的ENC 值為參考，分別從兩端各選取10%的基因建立高低偏性庫，將高低偏性庫之間同義密碼子相對(duì)使用度的差值（ΔRSCU）≥0.08 的密碼子作為高表達(dá)密碼子，將RSCU 值＞1 的密碼子作為高頻密碼子，同時(shí)滿足上述2 個(gè)條件的定義為最優(yōu)密碼子[28].

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆密碼子特征分析

使用Codon W 1.4.2 和CUSP 軟件分析蠶豆線粒體基因組密碼子偏性相關(guān)參數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，考慮所有ORF 時(shí)，所有CDS 密碼子的平均GC 含量為46.48%，GC1、GC2、GC3、GC3s 的GC 含量分別為48.89%、45.12%、45.43%、45.63%；不考慮所有ORF 時(shí)，所有CDS 密碼子的平均GC 含量為42.55%，GC1、GC2、GC3、GC3s 的GC 含量分別為47.25 %、42.51%、37.89%、38.14%. 對(duì)葉綠體基因組密碼子偏性相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有CDS 密碼子的平均GC 含量為37.16%，GC1、GC2、GC3、GC3s 的GC 含量 分 別為46.11%、38.27%、27.10%、7.07%.由此可知，蠶豆細(xì)胞器基因組的GC 含量均小于50%.共有146 條序列的ENC ＞45，其中，線粒體121 條，葉綠體25 條.線粒體ENC 的平均值為53.75，介于40.40～61.00 之間；葉綠體ENC 的平均值為45.06，介于38.11～51.65 之間.

對(duì)蠶豆細(xì)胞器基因組中的密碼子參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖1 所示.

圖1 密碼子各位置GC 含量、數(shù)量與ENC 的相關(guān)性Fig.1 Correlation analysis of GC content，quantity and ENC value at each codon location

由圖1（a）可知，蠶豆線粒體基因組的GCall與GC1、GC2、GC3極顯著相關(guān)（P＜0.01），GC1與GC2、GC3極顯著相關(guān)（P＜0.01），GC2與GC3極顯著相關(guān)（P＜0.01）；ENC 與GC1極顯著相關(guān)（P＜0.01），與GC2不相關(guān)（P＞0.05），與GC3顯著相關(guān)（P＜0.05），說明ENC 與密碼子第1 位堿基組成密切相關(guān)，與密碼子數(shù)不相關(guān)，即基因序列長(zhǎng)度對(duì)密碼子使用偏好性的影響很小.由圖1（b）可知，蠶豆葉綠體基因組的GCall與GC1、GC2、GC3極顯著相關(guān)（P＜0.01），GC1與GC2極顯著相關(guān)（P＜0.01），GC1與GC3相關(guān)性不顯著（P＞0.05），GC2與GC3相關(guān)性不顯著（P＞0.05）；ENC 與GC3極顯著相關(guān)（P＜0.01），ENC、GC1、GC2、GC3、GCall與密碼子數(shù)的相關(guān)性均不顯著（P＞0.05）.這些結(jié)果表明，蠶豆線粒體和葉綠體基因組密碼子的使用偏好性受到GC 含量、ENC 和密碼子第1 位堿基的影響.其中，蠶豆線粒體基因組密碼子的使用偏好性與GC 含量密切相關(guān)，而葉綠體基因組密碼子的使用偏好性則與ENC 和GC3密切相關(guān).

蠶豆細(xì)胞器RSCU 分析結(jié)果如圖2 所示. 由圖2可以看出，無論是線粒體基因組還是葉綠體基因組，RSCU 最大的密碼子均為編碼亮氨酸Leu 的UUA，RSCU 最小的密碼子也均為編碼亮氨酸Leu 的CUG.雖然2 個(gè)基因組的同義密碼子RSCU 略有不同，但是差異不大. 除了編碼甲硫氨酸Met 的AUG 和編碼色氨酸Trp 的UGG 外，其他氨基酸都有多個(gè)密碼子. 其中，線粒體有29 個(gè)密碼子RSCU ＞1，以A/U 結(jié)尾的各23 個(gè)，C/ G 結(jié)尾的有6 個(gè)；葉綠體有30 個(gè)密碼子RSCU ＞1，以A/U 結(jié)尾的有29 個(gè)，C/ G 結(jié)尾的有1個(gè)，表明蠶豆細(xì)胞器基因組更偏好以A 和U 結(jié)尾.

圖2 蠶豆細(xì)胞器各氨基酸的RSCU 分析Fig.2 RSCU analysis of amino acids in organelles of V.fabca

2.2 中性繪圖分析

蠶豆細(xì)胞器基因組各基因的中性繪圖分析結(jié)果如圖3 所示.由圖3（a）可以看出，蠶豆線粒體基因組中，GC12的取值范圍為35.91%～61.17%（若不考慮ORF 則為36.81%～51.84%），GC3的取值范圍為27.78%～64.29%（若不考慮ORF 則為34.59%～61.03%）.GC12與GC3之間的相關(guān)系數(shù)為0.374，回歸系數(shù)為0.255，相關(guān)性不顯著，表明蠶豆線粒體基因組密碼子第1、2 位堿基的突變模式不同于第3 位的突變模式，密碼子使用偏性受自然選擇影響要大于堿基突變.由圖3（b）可以看出，蠶豆葉綠體基因組中，GC12的取值范圍為32.32～53.6，GC3的取值范圍為19.51～34.61.GC12與GC3之間的相關(guān)系數(shù)為0.145，回歸系數(shù)為0.327，相關(guān)性也不顯著.所有基因也落于對(duì)角線上方，說明GC12和GC3兩個(gè)變量之間的相關(guān)性很弱，細(xì)胞器基因組中密碼子第3 位的GC 含量較低，密碼子偏好性主要受自然選擇的影響.

圖3 中性繪圖分析Fig.3 Neutral plot analysis

2.3 ENC-plot 分析

蠶豆線粒體和葉綠體基因組的ENC-plot 分析結(jié)果如圖4 所示.

圖4 ENC-plot 繪圖分析Fig.4 Analysis of ENC-plot

由圖4 可以看出，與線粒體基因組相比，葉綠體基因組的部分基因與標(biāo)準(zhǔn)曲線距離較遠(yuǎn)，說明線粒體基因組的ENC 實(shí)際值和預(yù)期值要比葉綠體基因組更接近，意味著線粒體基因組密碼子偏好性更易受到堿基突變影響；而葉綠體基因組中大部分基因偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線，即ENC 實(shí)際值和預(yù)期值之間存在較大差異，說明葉綠體基因的堿基突變并不是影響密碼子偏好性的主要因素，可能還受自然選擇等因素的影響.對(duì)于蠶豆線粒體基因組，大多數(shù)基因偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線，ENC 比值分布在[-0.05，0.05）區(qū)間外的基因多達(dá)86 個(gè)（表1）.對(duì)于蠶豆葉綠體基因組，大多數(shù)基因也偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線，ENC 比值分布在[-0.05，0.05）區(qū)間之外的基因多達(dá)41 個(gè)（表1），這些基因與ENC 預(yù)期值較遠(yuǎn)，同線粒體基因組相比，葉綠體基因組更易受到自然選擇的影響.雖然線粒體基因組部分基因要比葉綠體基因組更易受到堿基突變的影響，但總體來說蠶豆細(xì)胞器密碼子偏好性的影響因素還是以自然選擇為主，受堿基突變的影響較弱.

2.4 PR2-plot 分析

利用PR2-plot 分析蠶豆細(xì)胞器基因組密碼子偏好性的影響因素，結(jié)果如圖5 所示.

圖5 PR2-plot 繪圖分析Fig.5 PR2-plot plot analysis

如果密碼子偏好性完全受突變而不是受選擇的影響，那么4 種堿基的使用頻率均衡.由圖5 可以看出，蠶豆線粒體和葉綠體中各基因不均勻地分布在4個(gè)不同區(qū)域.

蠶豆線粒體基因組總體表現(xiàn)為密碼子第3 位堿基在使用頻率上T ＞A、G ＞C，表明線粒體基因組密碼子使用偏好性受堿基突變、自然選擇等多種因素共同影響.葉綠體基因組中大部分基因位于平面圖的下半部，尤其是右下區(qū)域的基因最多，說明在堿基使用頻率上U ＞A、G ＞C，表明選擇對(duì)密碼子使用偏好性的影響比隨機(jī)漂移更為顯著.由此可見，在諸多影響因素當(dāng)中，蠶豆基因組密碼子偏好性不僅受到了選擇的影響，同時(shí)也受到了突變的影響.

2.5 最優(yōu)密碼子確定

通過Codon W 1.4.2 軟件構(gòu)建蠶豆線粒體和葉綠體的高表達(dá)基因庫和低表達(dá)基因庫，計(jì)算2 個(gè)基因庫中的RSCU 值，結(jié)果如表2 所示.由表2 可知，高表達(dá)基因庫和低表達(dá)基因庫中的RSCU 值存在差異.其中，蠶豆細(xì)胞器基因組共有47 個(gè)密碼子的ΔRSCU≥0.08，將這47 個(gè)密碼子均認(rèn)定為高表達(dá)的優(yōu)越密碼子（表中以*、**或***標(biāo)注）.在高表達(dá)基因庫中，線粒體基因組的優(yōu)越密碼子以A/U 結(jié)尾的有17 個(gè)，以C/G結(jié)尾的有9 個(gè)；葉綠體基因組的優(yōu)越密碼子以A/U 結(jié)尾的有15 個(gè)，以C/G 結(jié)尾的有6 個(gè).蠶豆細(xì)胞器基因組的密碼子中共有39 個(gè)既滿足高頻率也滿足高表達(dá)的條件，可視為最優(yōu)密碼子，其中，葉綠體16 個(gè)，線粒體23 個(gè)，在最優(yōu)密碼子中僅有GUA 為線粒體和葉綠體共有的最優(yōu)密碼子.

3 討論

密碼子偏好性是生物基因組進(jìn)化的一個(gè)重要特征，它與GC 含量、tRNA 豐度、基因表達(dá)水平和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等因素相關(guān)[29]. 研究密碼子偏好性有利于闡明生物進(jìn)化關(guān)系，提高基因表達(dá)效率[30].在影響密碼子偏好性的諸多因素中，突變和自然選擇為主導(dǎo)因素，自然選擇可使植物在翻譯中優(yōu)先編碼最優(yōu)密碼子，突變會(huì)導(dǎo)致植物中出現(xiàn)部分非偏好性密碼子[31-32].密碼子第3位堿基的同義突變雖不會(huì)影響所編碼的氨基酸，但仍被認(rèn)為是決定氨基酸類型的重要特征，對(duì)研究密碼子偏好性具有重要意義[33].本研究中蠶豆細(xì)胞器CDS 的GC 含量在密碼子的不同位置呈現(xiàn)不同的分布頻率，第1 位、第2 位的GC 含量均大于第3 位的GC 含量，線粒體基因組的GC 含量大于葉綠體基因組的含量，且大多數(shù)堿基都偏好以T（U）/A 結(jié)尾，表明蠶豆線粒體基因比葉綠體基因的第3 位堿基更偏向以A/T（U）結(jié)尾，這與同科植物蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）[34]和紫花苜蓿（Medicago sativa）[8]以及茄科（Solanaceae）[35]等高等植物的密碼子3 個(gè)位置GC 含量的比較趨勢(shì)一致.在密碼子第3 位堿基的使用上，還表現(xiàn)出T 的使用頻率高于A 的頻率，并且G 的使用頻率高于C 的頻率，這種偏好特征與秈稻（Oryza sativa）[36]和籽粒莧（Amaranthus hypochondriacus）[37]一致，說明蠶豆細(xì)胞器基因組密碼子的使用受到了自然選擇的影響.

采用中性繪圖分析顯示，蠶豆細(xì)胞器GC12和GC3之間的相關(guān)性較弱，密碼子第1、2 位堿基的突變模式與第3 位不同，說明蠶豆細(xì)胞器基因組密碼子使用模式主要受自然選擇的影響，且葉綠體基因組更易受到選擇影響.ENC-plot 分析發(fā)現(xiàn)蠶豆細(xì)胞器的大部分基因偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線，ENC 實(shí)際值和預(yù)期值之間存在較大差異，說明堿基突變并不是影響其密碼子偏好性的主要因素，可能還受自然選擇等因素的影響. 采用PR2-plot 分析蠶豆細(xì)胞器基因組密碼子的偏好性，發(fā)現(xiàn)只有少部分基因的密碼子偏性是由突變主導(dǎo)，而更多的受自然選擇影響，且密碼子偏好性較弱. 線粒體基因組總體表現(xiàn)出密碼子第3 位堿基使用頻率上T ＞A、G ＞C，表明線粒體基因組密碼子使用偏好性更易受堿基突變、自然選擇等多種因素共同影響. 這與玉米（Zea mays）[38]、大豆（Glycine max）[9]、金柑（Fortunella japoonica）[39]等植物的研究結(jié)果一致.意味著在這些植物的進(jìn)化過程中，自然選擇通過調(diào)控密碼子的使用來優(yōu)化基因表達(dá)，這在植物進(jìn)化中十分普遍. 楊樹（Populus przewalskii）[40]和擬南芥（Arabidopsis thaliana）[41]中葉綠體基因組密碼子偏好性則主要受突變的影響，表明不同植物密碼子偏好性的影響因素也不相同.

本研究基于RSCU 和ENC 值篩選出蠶豆線粒體基因組與葉綠體基因組最優(yōu)密碼子分別為23 個(gè)和16個(gè)，密碼子偏性較弱，且最優(yōu)密碼子以NNA 或NNU模式為主，可以優(yōu)先選用以A 或U 堿基結(jié)尾的最優(yōu)密碼子提高外源基因的表達(dá)率.分別計(jì)算蠶豆細(xì)胞器基因組的129 條和49 條基因的RSCU 值，線粒體有29個(gè)密碼子的RSCU ＞1，葉綠體有30 個(gè)密碼子的RSCU ＞1，這與張揚(yáng)等[14]和李顯煌等[42]的研究結(jié)果一致.比較基因組的ENC 值，線粒體ENC 的平均值為53.75，葉綠體ENC 的平均值為45.06，線粒體基因組的值要高于葉綠體基因組，說明蠶豆葉綠體基因組所有基因編碼序列的密碼子使用偏好性比線粒體強(qiáng).此研究結(jié)果為后續(xù)蠶豆遺傳多樣性分析和蠶豆品種選育提供了科學(xué)依據(jù)，通過分析蠶豆細(xì)胞器基因組的密碼子偏好性，可以更好地了解蠶豆基因的表達(dá)規(guī)律，為育種提供更適合的方向和策略.