腫瘤熱療、抗血管治療與免疫微環境重塑

吳稚冰

隨著分子生物學的進展，腫瘤組織與正常組織在血管和免疫微環境上的不同特性逐漸為人所揭示。熱刺激可以誘導細胞壞死或凋亡，并且在破壞腫瘤血管的同時激活機體免疫系統，從而調節腫瘤微環境的免疫狀態，由此衍生出熱療輔助治療。熱療是一種利用發熱生物熱效應和非電離輻射的物理因素來加熱組織，從而促進腫瘤細胞凋亡或壞死的物理療法。腫瘤血管發育不完整、分布較為散亂，阻礙正常CD8+T 細胞進入腫瘤組織。血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）也會抑制樹突狀細胞（Dendritic cells，DCs）的成熟并誘導CD8+T 細胞耗竭。腫瘤血管生成及免疫環境相互干預的作用使得抗血管治療聯合免疫治療成為一種有潛力的治療策略。我們從熱療及抗血管治療的機制出發，討論腫瘤熱療、抗血管治療與免疫治療聯合的治療模式，為免疫治療耐受的腫瘤患者探索新的治療方向。

1 腫瘤細胞重編程

1.1 提高細胞熱休克蛋白及損傷相關分子模式信號表達腫瘤熱療通過提高腫瘤細胞熱休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）、高遷移率族蛋白 B1（High mobility group box protein1，HMGB1）和程序性細胞死亡因子配體-1（Programmed cell death-Ligand 1，PD-L1）表達來增加腫瘤細胞免疫抗原性，抑制其增殖和遷移。HSPs 由熱休克蛋白基因在細胞受熱及在其他理化因素（如病毒感染、創傷、缺氧、缺血、重金屬離子、紫外線照射等）刺激下啟動而選擇性合成。HSPs 為一組高度保守性的蛋白質，近年來研究發現其在腫瘤免疫微環境（Tumor microenvironment，TME）中發揮著重要作用。針對小鼠骨肉瘤模型的研究證實熱療對耐藥細胞系和原代成瘤細胞系均有殺傷作用且使兩種細胞系均表現出HSP70 表達升高[1，2]。研究證明，腫瘤細胞HSP70 及90 的表達上調，促進MHCI 類分子介導的腫瘤抗原肽成熟，進而增強腫瘤細胞免疫原性[3]。

熱刺激也會促使細胞表達與分泌一系列損傷相關分子模式信號（Danger associated molecular patterns，DAMPs）。熱療可在誘導腫瘤細胞凋亡的同時，促進其表達與分泌包括HMGB1 在內的DAMPs。HMGB1 通 過HMGB1/TLR4/MyD88 通 路激活腫瘤細胞免疫抗原性，使腫瘤細胞被吞噬細胞有效識別、殺傷、吞噬，進一步誘導CD8+T 細胞活化、增殖，促進抗腫瘤免疫效應[4]。

1.2 促進腫瘤細胞凋亡及死亡細胞生存需要適合的條件，溫度是其中之一。溫度變化可以使細胞膜的流動性與通透性發生改變。相較正常細胞，腫瘤細胞膜流動性較強，更易受溫度變化影響。熱療利用腫瘤細胞這一特性，使鑲嵌在細胞膜脂質雙層中的抗原決定簇暴露，從而增加腫瘤細胞的抗原性。同時腫瘤細胞流動性增強，還可以使化療藥物更易進入細胞，增強化療療效。根據加熱溫度可將熱療分為溫熱治療（41℃～45℃）和熱消融（＞55℃），溫熱治療條件下細胞死亡以凋亡為主[5，6]。研究表明溫熱治療通過激活Caspase 家族誘導不可逆的細胞凋亡[7]。熱消融溫度下以壞死為主，與細胞凋亡不同，細胞壞死時細胞膜結構被破壞。

免疫原性細胞死亡（Immunogenic cell death，ICD）是一種由某些化療藥物、溶瘤病毒、物理化學療法、光動力療法和放射療法引發的腫瘤細胞死亡。死亡細胞由非免疫原性轉化為免疫原性，引起免疫應答，使抗腫瘤免疫反應增強。細胞受到刺激發生ICD 時，可產生新的抗原表位并釋放DAMPs。DAMPs 包括細胞表面暴露的鈣網蛋白（ecto-CRT）、HMGB1、HSP70 和三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP），能夠和抗原提呈細胞（Antigen presenting cell，APC）結合（如與DCs 結合），使其識別、吞噬死亡細胞抗原，將抗原呈遞給T 細胞，激活適應性免疫應答[8]。研究證明，熱療誘導的細胞凋亡一定程度上促進ICD 的發生，其中產生的凋亡、壞死的細胞碎片也可作為抗原，從而誘導特異性抗腫瘤免疫反應[8，9]。一項鼠三陰性乳腺癌4T1 細胞模型上的研究結果顯示，與臨床上外源性熱療不同，磁熱療（Magnetic hyperthermia，MH）將氧化鐵納米劑作為加熱源，外加交變磁場加熱細胞內區域，直接刺激細胞ICD 的發生[9]。

在腫瘤的發生、發展過程中，腫瘤細胞的轉移現象始終存在。熱療可直接作用于腫瘤細胞或間接提高機體的抗腫瘤免疫，抑制腫瘤細胞轉移[10]。此外，全身熱療或熱療聯合化療可以有效協同殺滅轉移的癌細胞。因此，熱療與放療或化療結合可提高放化療療效。

1.3 改善缺氧和誘導活性氧產生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）由機體內氧原子在捕捉電子后形成，在細胞的生長、分化和增殖過程中發揮重要作用，其水平在正常細胞中處于一個較為穩定的范圍。相較于正常細胞，腫瘤細胞中的ROS 產生更多，ROS 通過使原癌基因激活、抑癌基因失活、線粒體功能受損以及代謝水平升高等方式在腫瘤發生、發展、分化、轉移等各個階段發揮不同的作用。Hou等[11]研究證實，隨著熱療時間增加，細胞內ROS 含量升高。應激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路是實現細胞凋亡的重要通路之一，其活性升高會誘導細胞凋亡發生[12]。熱療通過誘導ROS 產生，繼而激活JNK 信號轉導通路和抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）通路活化，誘導細胞凋亡，是腫瘤治療的新思路[13]。ROS 也為引起蛋白變性的常見物質[14]，可引起蛋白質主鏈斷裂、蛋白質羰基化及蛋白質-蛋白質交聯從而使其失去活性導致細胞功能異常。

2 腫瘤免疫微環境重編程

腫瘤免疫微環境（Tumor microenvironment，TME）是由免疫細胞、成纖維細胞等細胞與細胞外基質及各類信號分子等組成的復雜網絡系統，是腫瘤發生及生長的微環境。見表1。腫瘤細胞和周邊微環境之間的相互交流和作用是腫瘤生長、進展、轉移的重要因素[15～18]。研究表明，39℃～40℃熱刺激可以調節CD4+T 細胞的分化和成熟，糾正其功能失調，可抑制T 細胞向Th2 和調節性T 細胞（Treg）分化，促進T 細胞向Th1 和Tc1 細胞分化成熟。同時熱刺激下IL-6 因子分泌升高促進Treg 分化為Th17[19]。也有研究證明熱療促進記憶T 細胞的產生增多[20]，CD8+記憶T 細胞通過識別腫瘤細胞上的特定抗原并刺激免疫反應來殺死腫瘤細胞。記憶免疫的長期作用有助于控制腫瘤復發和延長生存期。在熱刺激的作用下，誘導腫瘤細胞表面DAMPs 的表達增多[21]。在DAMPs 作用下，TME 中免疫激活亞型的免疫細胞數量和NK 細胞的腫瘤殺傷能力顯著增強。

表1 腫瘤免疫微環境的組成

2.1 固有免疫反應固有免疫是機體抵御常見病原體的第一道防線，在抗腫瘤免疫中也發揮監測作用。固有免疫細胞主要包括DCs、巨噬細胞和自然殺傷細胞（Natural killer cell，NK 細胞）。NK 細胞是固有免疫系統中發揮細胞毒性作用的淋巴細胞，而NKG2D 是NK 細胞上最重要的活化性受體之一，可識別靶細胞表面的配體NKG2DL 對靶細胞發揮殺傷作用。NKG2DL 從腫瘤細胞表面脫落是腫瘤免疫逃逸的一種關鍵機制[22]。

MICA/B 是一類常見的NKG2DL，屬于組織相容性復合體（Major histocompatibility complex，MHC）I 類多肽相關蛋白，在正常細胞中不表達或低表達（如腸上皮細胞），主要在受損、感染或轉化的細胞（如乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、黑色素瘤細胞等腫瘤細胞）表面表達，可以與NKG2D 結合，調控NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性作用，是腫瘤免疫治療的潛在靶點[23]。研究證明，HSP70 和MICA 可以協同激活NK 細胞的細胞毒性效應功能。腫瘤細胞MICA 的表達上調，同時熱應激引發HSP70 上調[24]，共同激活NK 細胞[25]。熱應激也會上調DCs 及巨噬細胞上Toll 樣受體4（TLR4）并誘導細胞因子、趨化因子和NO 的釋放，誘發炎癥反應，從而促進適應性免疫反應[26]。

2.2 適應性免疫反應熱刺激主要通過激活T 細胞促進適應性免疫反應，主要通過以下幾條路徑：①熱刺激可上調lmp2、lmp7[27]的表達，增強免疫酶體蛋白依賴性表位的表達，提高腫瘤免疫原性[28]，并且誘導未折疊蛋白反應，增加HSPs 在腫瘤細胞[29]中的表達。HSPs 與APC 上的HSP 受體相互作用，生成HSP+外泌體和HSP -肽復合物從腫瘤細胞中釋放出來，并通過HSP 受體[30]被APC 識別并攝取。最后通過MHC 在APC 上呈遞腫瘤抗原性肽以刺激T 細胞。②熱刺激也上調MHC-I 及APC 上的MHC-II、CD80、CD86、CD40 的表達并增強APC向淋巴結遷移，從而激活T 細胞[31]。③熱刺激還通過增加c-FLIP 的消耗來控制淋巴細胞的持久性并誘導高內皮微靜脈上的ICAM-1 和CCL21 的表達，可促進T 細胞向外周組織的運輸[32]。

3 腫瘤血管基質細胞重編程

腫瘤的生長與轉移除了與腫瘤細胞分化程度有關，也與血管對周細胞（Pericytes，PCs）的募集作用有關[33]。PCs 為一種血管周基質細胞，與血管的穩定性密切相關。包括血小板衍生生長因子（Platelet-derived growth factor subunit B，PDGF-B）、促血管生成素1（Angiopoietin-1，Ang-1）在內的多種因子會促進血管對PCs 的募集。但這些腫瘤血管PCs 仍然缺失或分離，并不能與血管壁穩定結合[34]。Ang-1/Tie2 為促進PCs 募集的重要信號。PCs 參與Ang-1 的產生，而通過Ang-1/Tie2 可抑制內皮細胞的活動從而促進血管的穩定。研究證明內皮細胞可分泌促血管生成素2（Ang-2），競爭性結合Tie2拮抗Ang-1 的作用[35]。Ang-2/Tie 2 可促使內皮細胞與PCs 之間的連接變得疏松，從而使腫瘤的轉移能力增強。有研究證明通過抑制Ang-2 通路，可促進血管對PCs 的募集，從而抑制腫瘤的生長、轉移[36]。

未經治療的腫瘤血管較正常組織血管有PCs分離、血管直徑大、密度異常等特點，其異常主要由VEGF 和Ang-2 水平升高所致。VEGF 在正常組織中可維持血管內皮與PCs 的穩定。也有研究表明，VEGF 的過表達使血管通透性增高，阻斷其受體VEGFR-2 可以維持血管靜水壓力梯度，加強藥物在腫瘤中的滲透[37]。

VEGF 為抗血管靶向藥物貝伐珠單抗、舒尼替尼、帕唑帕尼的共同靶點。一方面抑制腫瘤血管生成，另一方面促進腫瘤血管基質細胞重編程。而腫瘤血管基質細胞重編程是促進血管正常化的細胞學基礎，可以改善血管形態，促進腫瘤間質壓力恢復正常。血管正常化過程包括血管PCs 覆蓋增加、血管灌注改善、血管通透性降低、缺氧減輕，從而抑制腫瘤的進展。研究證明，在人卵巢癌小鼠異種移植模型（SKOV-3）中，與安慰劑相比，貝伐珠單抗可增加血管周細胞覆蓋，誘導血管正常化[38]。通常腫瘤的血管滲漏會導致腫瘤組織間質液壓（Interstitial fluid pressure，IFP）增加。一項針對人小細胞肺癌54A、人多形性膠質母細胞瘤U87 裸鼠模型的研究顯示，DC101 作為一種抗VEGFR-2 單克隆抗體，可促進內皮細胞在基底膜上分布，增加血管壁新生，促進血管形態正常化；同時降低IFP，促進血管功能正常化[39]。在病理性血管組織中，抗血管生成藥物可改善血管形態，促進IFP 恢復正常，由此可增加藥物在腫瘤組織中的分布，其與化療藥物聯合可相輔相成，如VEGF 單抗增加伊立替康在腫瘤組織中的分布，并顯著增加腫瘤灌注；過表達PDGF-D 促進血管正常化也可增加化療藥物在腫瘤組織中的分布[40]。

4 基于免疫治療聯合治療模式探索

4.1 免疫檢查點抑制劑免疫治療已成為晚期惡性腫瘤的重要治療方式，程序性細胞死亡蛋白-1（Programmed cell death-1，PD-1）與腫瘤細胞上的配體PD-L1 結合，抑制T 細胞作用和功能，從而使腫瘤細胞回避免疫應答，逃過免疫殺傷效應，在腫瘤的宿主免疫逃逸機制中發揮重要作用。免疫檢查點抑制劑（Immune checkpoint inhibitors，ICIs）為腫瘤免疫治療的重要組成部分，ICIs 已經用于非小細胞肺癌、腎細胞癌及黑色素瘤等腫瘤的一線治療[41～43]。臨床常用的ICIs 是PD-1/PD-L1 單抗及CTLA-4 單抗。目前新靶點也在不斷研究之中，而主要在激活的T 細胞、B 細胞和NK 細胞表面表達的LAG-3 是最受關注的靶點之一。靶向LAG-3 的瑞拉利單抗（Relatlimab）已被批準用于晚期黑色素瘤的治療，特別是用于治療PD-L1＜1%和/或LAG 3 ≥1%的患者，其PFS 有顯著改善[44]。

但是單一的ICIs 在臨床治療中的治療效果有限，總體的臨床反應率為15%～60%[45]，并且由于腫瘤復雜的免疫逃逸機制，ICIs 僅對部分患者有效，其療效與腫瘤微環境密切相關。低應答率和免疫相關不良事件（irAEs）限制了 ICIs 的臨床應用[46]。

4.2 熱療聯合治療模式PD-1/PD-L1 為ICIs 的主要靶點。研究證明，較單用放療，放療聯合熱療的乳腺癌細胞在39℃、41℃和44℃熱刺激120h 后，PD-L1、PD-L2 和HVEM 表達均顯著增加。證實熱療可提高腫瘤PD-L1 表達，從而提高對ICIs 的應答[47]。也有研究表明，熱療可以顯著改變腫瘤的免疫微環境：熱療產生的ICD 效應可以增加細胞對ICIs 敏感性[48]。目前，許多使用熱療結合ICIs 治療的基礎實驗和臨床研究在進行中，并顯示出克服上述ICIs 局限性的可能性，展現出極大的應用前景。

熱刺激對血管的作用在于對血管的破壞和抑制血管的再生。熱刺激作用于腫瘤血管內皮細胞抑制其合成及分泌VEGF，從而抑制腫瘤血管形成，控制腫瘤生長。血管內皮細胞較腫瘤細胞不易突變，因而很少產生耐藥性。此外熱療還具有放大效應。通過人體正常的熱調解作用，正常組織加熱以后能夠很快散熱，而腫瘤組織的血管分布較為雜亂，加熱后熱度并不能像正常組織一樣快速分散，而持續存在，這樣熱刺激得以持續發揮作用。通過化療、精準放療、免疫治療與熱療相聯合，形成熱療聯合多學科診療模式，使治療療效持續作用于腫瘤組織。目前基于納米材料的微波熱療平臺也取得了有效進展，經過CmHSP70 修飾的金納米顆粒靶向聚集于腫瘤，可高效轉化熱能，使光熱療法更精準、更可控、更高效，也降低了對正常組織的損傷[49]。

4.3 抗血管藥物聯合治療模式抗血管酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosine kinase inhibitors，TKI）單用可促進腫瘤血管正常化，抗血管TKI 組治療9 天PCs覆蓋增多，無明顯內皮細胞彌散。抗血管TKI 聯合PD-1 抗體治療至21 天，PCs 覆蓋仍保持，無明顯內皮細胞彌散[50]。安羅替尼作為多靶點TKI，可抑制三種主要的促血管生成因子受體（VEGFR、PDGFR 和FGFR）[51]，不僅可以顯著抑制腫瘤新生血管，還可以改變腫瘤血管基質，促進血管正常化，從而改善血管形態和腫瘤血液灌注，使得血管滲漏減少，缺氧緩解，促進腫瘤間質液壓恢復正常，進而增加化療藥物在腫瘤組織中的分布，進一步加強抗腫瘤效果。

抗血管藥物與免疫治療聯合也可增加抗體藥物在腫瘤組織中的分布，如使用阿昔替尼后，纖維蛋白外滲區域在腫瘤內更為豐富[52]。VEGFR-TKI特異性遞送PD-1 單抗至腫瘤組織，且不會增加派安普利單抗在正常組織中的分布[53]。

有研究證實抗血管藥物與化療聯合可增加化療藥物在腫瘤組織中的分布，如VEGF 單抗增加伊立替康在腫瘤組織中的分布，并顯著增加腫瘤灌注[54]。貝伐珠單抗可增加拓撲替康、依托泊苷在腫瘤組織中的分布[55]。舒尼替尼可增加替莫唑胺在腫瘤組織中的分布[56]。沙利度胺可增加環磷酰胺在腫瘤組織中的分布[57]。

5 總結與展望

熱療可以抑制腫瘤生長和轉移，增強免疫細胞浸潤，調節抗腫瘤/促腫瘤免疫細胞比例和細胞因子水平；抗血管藥物可抑制腫瘤血管生成，通過促進腫瘤血管基質細胞重編程，促進血管正常化。綜上所述，熱療和抗血管治療均可改善腫瘤組織缺氧，聯合免疫治療可協同增效；均可降低腫瘤組織間質壓力，增加藥物在腫瘤組織中的分布；均可改善腫瘤組織缺氧，協同免疫治療，提升療效。雖然他們均可以有效抑制腫瘤生長，但是并不能完全作為治療腫瘤的獨立方案。聯合治療模式仍有很多問題有待解決：①缺乏有效的療效預測指標，以精準確定目標人群；②如何選擇合適的聯用方案（單用/聯用）；③如何確定合適的治療時機及模式（同時/序貫、每天/每周、全身/局部）。對此我們仍需要開展更多的基礎及臨床研究，探究有效的療效預測生物標志物，以明確目標人群，確定最佳聯合療法及用藥最佳時間、最佳劑量。