長鏈非編碼RNA ARAP1-AS1 在卵巢癌中的表達及作用機制研究

董冰 李翠萍 徐瀟萌 王妍 李躍文 李興媚

在女性生殖系統疾病中，卵巢癌是一種最常見的惡性腫瘤，由于疾病早期缺乏明顯的影像學及生物學診斷指標，大部分患者在確診時已進入晚期，且有研究證實卵巢癌的5 年生存率低于30%[1]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是存在于細胞核或細胞質中并且長度超過200 個核苷酸的一組非編碼RNA，主要功能是協助調控相關基因的表達。已有研究證明，lncRNA 的不同表達水平與各類腫瘤的生長或轉移存在不同程度的相關性[2，3]。多項研究表明，不同的lncRNA 通過各自特定的信號通路參與多種腫瘤的發生、發展及侵襲[4，5]。有研究指出，lncRNA 的異常表達可通過相關信號通路定向調控與其相關的靶基因，從而參與卵巢癌的發病過程[6]。lncRNA ARAP1 反義AS1（ARAP1-AS1）是lncRNA家族中的一員，并且多項研究證明，在多種惡性腫瘤患者的血清中檢測出ARAP1-AS1 表達水平異常，且與腫瘤惡性程度和病理分型均存在相關性[7，8]，因此本研究多種試驗方法對卵巢癌的病理分型及治療預后進行分析，為卵巢癌的臨床診斷及靶向治療提供參考。本研究自2019 年1 月開始，于2021 年7 月結束，所有實驗均在我院實驗室進行并完成。

1 材料與方法

1.1 組織樣本獲得、培養及傳代購買人正常卵巢表面上皮系細胞（IOSE-80）和4 個人卵巢癌細胞系（A2780、OVCAR3、CP70 和SKOV3），將細胞接種于RPMI1640 培養基，將上述細胞系放置于特定培養基，在37℃培養箱內進行培養，達到標準后，再經過消化、離心后繼續培養。

1.2 細胞轉染及MTT 測定使用特定試劑進行細胞轉染，進一步建立ARAP1-AS1 或多態腺瘤樣蛋白2（PLAGL2）敲除模型、miR-47353p 模擬物、抑制劑以及相應的對照。轉染48h 后，完成細胞接種，在培養結束時，添加MTT 試劑，用微孔板分光光度計在570nm 處測定其吸光度。

1.3 逆轉錄-定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）完成RNA 分離后再將RNA 逆轉錄成cDNA。RT-qPCR采用SYBR 高級ExTaq Ⅱ輕型Cycler480 儀器，比較基因表達。驗證人卵巢癌腫瘤組織及人正常卵巢上皮組織中ARAP1-AS1 表達差異。

1.4 細胞計數試劑盒-8（CCK-8）實驗完成細胞轉染后，進行細胞同步接種，再行恒溫培養，加入CCK-8 后，測定各組細胞在450nm 處的吸光度值。

1.5 Transwell 遷移及侵襲實驗用20μL 吸管尖端進行人工劃痕，細胞培養后進行監測，刮痕采用跨孔膜法評價卵巢癌細胞的侵襲能力。將細胞轉染并培養后，經4%多聚甲醛固定，蘇木精染色，顯微鏡計數。

1.6 蛋白質印跡法（Western blot）用緩沖液提取細胞總蛋白，轉移到PVDF 膜上。將蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，在4℃下加入抗PLAGL2 的一抗體處理膜孵育過夜，采用電化學發光試劑盒檢測條帶信號的灰度值。

1.7 統計學方法所有計量資料均以均數±標準差（）表示，所有實驗重復進行3 次。使用SPSS 13.0 軟件進行統計分析，采用矯正t檢驗和單因素變量方差分析法分別對兩組內或兩組間的結果進行比較分析。采用Pearson 進行相關性分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ARAP1-AS1 和PLAGL2 在卵巢癌細胞系中的表達情況為了探究 ARAP1-AS1 和PLAGL2 在正常卵巢上皮細胞和卵巢癌細胞中的表達是否存在差異，我們采用 RT-qPCR 法檢測發現，與正常卵巢上皮細胞IOSE-80 相比，ARAP1-AS1 在多種卵巢癌細胞系（A2780、OVCAR3、CP70 和SKOV3）中的表達水平均顯著上調（見圖1A）。同樣，PLAGL2 也在卵巢癌細胞系中的表達水平顯著上調（見圖1B）。

圖1 ARAP1-AS1 和PLAGL2 在卵巢癌細胞系中的表達注：與IOSE-80 比較，*P＜0.05，**P＜0.01

2.2 沉默ARAP1-AS1 抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲RT-qPCR 實驗證實ARAP1-AS1 表達沉默成功（見圖2A）；MTT 實驗表明，ARAP1-AS1 的沉默導致了A2780 和OVCAR3 細胞活力顯著下降（見圖2B）；集落形成實驗結果顯示，抑制 ARAP1-AS1 可抑制A2780 和OVCAR3 細胞的增殖（見圖2C）；由于ARAP1-AS1 的敲除，A2780 和OVCAR3細胞的遷移能力受到了抑制（見圖2D）；侵襲實驗表明，ARAP1-AS1 下調導致卵巢癌侵襲細胞數量減少（見圖2E）。

圖2 沉默ARAP1-AS1 抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲

2.3 ARAP1-AS1 可 與miR-4735-3p/PLAGL2 相 互結合敲低ARAP1-AS1 后 PLAGL2 的表達水平明顯下調（見圖3A）。亞細胞定位發現，ARAP1-AS1在A2780 和 OVCAR3 兩種細胞系的細胞質中呈現高表達狀態（見圖3B），表明ARAP1-AS1 主要定位于細胞質中。利用DIANA 和starbase 數據庫進行生物信息學預測發現，ARAP1-AS1 和PLAGL2 與同一個miRNA 具有相互調節關系（見圖3C）。熒光素酶報告實驗顯示，ARAP1-AS1 可結合miR-4735-3p，同時miR-4735-3p 可與PLAGL2 相互結合（見圖 3D）。通過抗Ago2 和抗IgG RIP 實驗進一步證明上述結論（見圖3E）。

圖3 ARAP1-AS1 可與miR-4735-3p/PLAGL2 相互結合

2.4 ARAP1-AS1 通過miR-4735-3p 調節PLAGL2的表達進一步實驗表明，抑制miR-4735-3p 的表達可以明顯上調PLAGL2 的表達，同時對ARAP1-AS1 進行敲減發現可以抵消部分miR-4735-3p 抑制物的作用，下調PLAGL2 的表達（見圖4A）。進一步通過Western blot 實驗對PLAGL2 的蛋白水平進行驗證，結果與mRNA 水平保持一致。表明miR-4735-3p 可以調節PLAGL2 的表達，同時 ARAP1-AS1 可進一步對miR-4735-3p/PLAGL2 通路進行調節（見圖4B）。

圖4 ARAP1-AS1 通過miR-4735-3p 調節PLAGL2 的表達

2.5 ARAP1-AS1 通過miR-4735-3p/PLAGL2 通路在卵巢癌中發揮致癌作用我們敲低OVCAR3 細胞中ARAP1-AS1 的表達，抑制miR-4735-3p 的表達，同時進一步敲低PLAGL2，并通過RT-qPCR 分析驗證了轉染效率（見圖5A）。MTT 實驗顯示，miR-4735-3p 抑制物逆轉了sh-ARAP1-AS1 對細胞增殖的抑制作用，并在PLAGL2 沉默后恢復（見圖5B）。集落形成實驗表明，抑制miR-4735-3p 的表達可以增強OVCAR3 細胞的增殖能力，同時敲低 ARAP1-AS1 后OVCAR3 細胞的增殖能力下降（見圖5C）。同樣，抑制miR-4735-3p 的表達可以增強OVCAR3 細胞的遷移和侵襲能力，同時敲低ARAP1-AS1 后OVCAR3細胞的遷移和侵襲能力下降（見圖5D）。

圖5 ARAP1-AS1 通過miR-4735-3p/PLAGL2 軸在卵巢癌中發揮致癌作用

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統中最常見的腫瘤之一，也是全球女性癌癥死亡的主要原因[9]。據報道，卵巢癌的死亡率在所有婦科癌癥中排名第一[10]。大多數卵巢癌患者由于術后復發率高、預后較差等因素，造成晚期卵巢癌療效不理想[11，12]。近年來，針對卵巢癌的發病情況及診療特點，有學者發現lncRNAs 在表觀遺傳、轉錄或轉錄后水平上調控基因的表達[13]，同時異常表達的lncRNAs 在腫瘤發生和進展中扮演致癌基因或腫瘤抑制因子的角色[14]。lncRNAs 可以調控基因表達，進而影響許多重要的生理過程，可以作為染色質修飾因子以及轉錄調節因子和轉錄后調節因子等。本研究發現ARAP1-AS1 在卵巢癌細胞中高表達。

經過RT-qPCR 檢測ARAP1-AS1 在卵巢癌細胞系和正常卵巢內皮細胞系中的表達水平，結果顯示，ARAP1-AS1 在卵巢癌中的表達水平明顯高于正常細胞，提示ARAP1-AS1 可能在卵巢癌中扮演著促癌角色。前期有研究證實lncRNA ARAP1-AS1 被認為是膀胱癌的促癌因子[15]。同時，TCGA數據庫和實驗也證實lncRNA ARAP1-AS1 在宮頸癌和子宮癌中表達上調[16]。在泛癌種中的研究表明，ARAP1-AS1 可能在腫瘤的發生發展中扮演著至關重要角色，基于此，靶向 ARAP1-AS1 可能是一種有效抑制腫瘤的治療策略。我們通過MTT 及Transwell 實驗表明，敲低ARAP1-AS1 對卵巢癌細胞增殖具有明顯的抑制作用。

PLAGL2 具有高度保守的結構，可使轉錄因子PLAGL2 促進特異性基因轉錄的激活[17]。多個學者研究也證明，PLAGL2 在多種惡性腫瘤中表現出致癌功能，如結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、膠質瘤和卵巢癌[18～20]。在此，本研究結果揭示了PLAGL2在卵巢癌細胞中的表達水平高于正常卵巢內皮細胞系。ARAP1-AS1 主要分布在細胞質中，由于ARAP1-AS1 和PLAGL2 均在卵巢癌細胞中高表達，表明ARAP1-AS1 可能通過 ceRNA 機制在卵巢癌中發揮作用。結合生信分析和實驗驗證，揭示了ARAP1-AS1 通過受體化miR-4735-3p 來提高PLAGL2 水平，在卵巢癌中起致癌作用。具體為抑制miR-4735-3p 削弱了敲除ARAP1-AS1 所導致的增殖抑制作用，同時敲除PLAGL2 可以減弱上述效應。敲除 ARAP1-AS1 可以減弱miR-4735-3p 抑制物導致的促增殖和遷移作用。同樣的調控關系也在膀胱癌中得到證實，即ARAP1-AS1 可以通過ceRNA 機制調節miR-4735-3p/NOTCH 軸的表達[15]。

綜上，通過本項研究我們闡明了ARAP1-AS1通過靶向miR-4735-3p/PLAGL2 通路誘導卵巢癌細胞的惡性行為，這為ARAP1-AS1 可能作為卵巢癌治療的新靶點提供了強有力的證據。