耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌血流感染的臨床特征及耐藥分子分析

張澤智 徐佳

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是廣泛分布于自然界的腸桿菌科一類中最重要的革蘭氏陰性桿菌，其侵入人體后可在泌尿、呼吸、胃腸系統等部位定植，當宿主免疫力低下及免疫抑制時，KP 會大量繁殖并引起多種感染[1，2]。近年來，隨著激素和廣譜抗生素的廣泛應用，加之臨床侵入性操作、器官移植的增多，KP血流感染的病例逐年增多，已成為繼大腸埃希菌后血流感染的第二大血流感染病原菌，也是醫院感染的重要病原菌之一[3]。中國細菌耐藥監測（2005～2022 年）結果顯示，在此期間，KP 對美羅培南和亞胺培南的耐藥率從2.9%、3.0%上升至27.4%、26.0%，主要原因是由于近年來耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的檢出率逐年升高，檢出的主要人群是接受介入治療的惡性腫瘤及免疫功能低下患者，由于CRKP 高檢出率大大增加了該檢查群體的死亡率，使其已成為全球重大的公共衛生問題[4]。CRKP 的耐藥機制十分復雜，由于其毒力強，感染患者往往病情較重，加之缺乏敏感的抗生素治療，患者的死亡率高達60%，因此CRKP的耐藥性是目前臨床面臨的難題之一[5]。目前國內關于CRKP 血流感染的臨床特征及耐藥機制的研究較少，為此，本研究進行了相關方面的分析，旨在為CRKP 血流感染患者的早期治療和經驗性用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及鑒定經承德醫學院附屬醫院醫學倫理委員會批準，選擇2019～2022 年該院兩院區住院患者為研究對象。納入標準：體溫＞38℃，血液標本培養分離出KP，并有以下癥狀之一：①有遷徙病灶或入侵門戶；②肝脾腫大，有出血點或皮疹，外周血中性粒細胞增多伴核左移，但除血流感染外無其他原因解釋；③無明顯感染灶，但有全身中毒癥狀。排除標準：非血培養陽性標本，非KP 感染的血培養陽性標本。共納入2 054 例KP 血流感染患者的病原菌標本，采用VITEK 2-Compact 全自動細菌鑒定儀，質控菌株為ATCC 700603，參照美國2019年實驗室標準化協會改良Hodge 試驗進行表型驗證。排除重復菌株后有238 株 KP 確定為CRKP（CRKP 組），其中惡性腫瘤51 例，ICU 重癥43 例，老年病47 例，其他疾病97 例。以性別、年齡1:1配對，選擇238 例碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌（Carbapenem sensitive klebsiella pneumoniae，CSKP）感染患者作為對照組，其中惡性腫瘤48 例，心血管疾病43 例，腦血管疾病53 例，其他疾病94 例。

1.2 臨床特征收集收集兩組患者的臨床資料，包括性別、年齡、基礎疾病、采集標本前30d 是否有侵入性操作及留置導管（氣管插管/氣管造瘺、留置導尿管、中心靜脈置管）、采集標本前30d 抗生素使用情況（單藥、聯合用藥、碳青霉烯類抗生素、第三/四代頭孢菌素）、臨床轉歸（痊愈、好轉/轉院、死亡）。

1.3 藥敏試驗采用微量肉湯稀釋法檢測11 種抗菌藥物，包括慶大霉素、左氧氟沙星、頭孢西丁、阿米卡星、美羅培南、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、氨曲南對CRKP 的最低抑菌濃度。

1.4 碳青霉烯酶基因檢測采用改良Hodge 試驗篩選產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌表型。利用聚合酶鏈反應（PCR），以CRKP 基因組DNA 為模板，擴增菌株中碳青霉烯酶基因blaKPC、blaOXA-48、blaIMP、blaVIM、blaNDM。擴增產物雙向測序后與GenBank 數據庫進行比對，確定CRKP菌株攜帶的碳青霉烯酶基因。

1.5 多位點序列分型根據巴斯德研究所多位點序列分型（MLST）網站，分別以CRKP 菌株基因組DNA 為模板，擴增phoE、gapA、infB、mdh、pgi、rpoB、tonB七個管家基因后進行MLST。

1.6 統計學方法應用SPSS 19.0 軟件，計數資料以n 和%表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征兩組性別、年齡構成比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。CRKP 組患者入住ICU 的比例高于對照組，侵入性操作中留置尿管、留置引流管、手術、氣管插管機械通氣、中心靜脈置管率高于對照組，使用抗生素類型中碳青霉烯類、β-內酰胺和 β-內酰胺酶抑制劑、糖肽類、替加環素使用率高于對照組，兩種及以上抗生素聯用率高于對照組，第三、四代頭孢菌素使用率高于對照組，伴隨心腦血管疾病、惡性腫瘤、感染性休克、腎臟疾病、燒傷患者的比例高于對照組，死亡率高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者臨床特征比較 [n（%）]

2.2 耐藥情況CRKP 組238 株菌株均為多重耐藥菌，對慶大霉素、頭孢西丁、美羅培南、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、氨曲南的耐藥率均為100.00%，對阿米卡星、左氧氟沙星的耐藥率最低，但也達81.09%、83.61%，對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松的耐藥率為89.92%、98.32%；耐藥率均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組菌株對抗生素的耐藥情況[n（%）]

2.3 碳青霉烯類基因檢測238 株CRKP 菌 株Hodge 試驗結果顯示：陽性質控菌ATCC BAA 1705為227 株，占95.38%；陰性質控菌株ATCC BAA 1796 為11 株，占4.62%。227 株陽性質控菌ATCC BAA 1705 中162 株攜帶blaKPC-2基因，占71.37%；35 株攜帶blaNDM-1基因，占15.42%；11 株攜帶blaNDM-2基因，占4.85%；10 株攜帶blaOXA-48基因，占4.41%；9 株同時攜帶blaKPC-2基因與blaNDM-1基因，占3.96%；未檢出攜帶blaIMP、blaVIM基因的菌株。

2.4 多位點序列分型按碳青霉烯酶基因比例選擇79 株CRKP 菌株進行MLST 分型，共檢測出13種ST 分型，其中ST11 分型最多，占62.03%，其次為ST15、ST1731、ST2230，分別占7.59%、6.33%、5.04%。分型占比情況見表3。

表3 79 株CRKP 菌株多位點序列分型構成

3 討論

本研究結果顯示，CRKP 組患者中入住ICU的比例高于對照組，接受侵入性操作中留置尿管、留置引流管、手術、氣管插管機械通氣、中心靜脈置管率高于對照組；接受兩種及以上抗生素聯用率高于對照組，碳青霉烯類、β-內酰胺和 β-內酰胺酶抑制劑、糖肽類、替加環素使用率高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。在疾病構成方面，CRKP 血流感染患者的心腦血管疾病、惡性腫瘤、感染性休克、腎臟疾病、燒傷比例高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。說明這些因素是導致CRKP 檢出率升高的重要原因。CRKP 血流感染患者的死亡率（53.78%）高于CSKP 血流感染患者（10.50%），差異有統計學意義（P＜0.05），提示CRKP 血流感染會大大增加患者的死亡率。CRKP與CSKP 菌株的藥敏試驗結果顯示，CRKP 組238株菌株均為多重耐藥菌，對慶大霉素、頭孢西丁、美羅培南、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、氨曲南的耐藥率均為100.00%，提示CRKP 多重耐藥情況十分嚴重。在11 種抗生素中，耐藥率最低的是阿米卡星和左氧氟沙星，但耐藥率也達81.09%、83.61%，對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松的耐藥率為89.92%、98.32%，較高的耐藥率會給治療造成極大的困難。提示該院在疑似CRKP 血流感染患者抗生素經驗性用藥的選擇上應規避耐藥率高的抗生素。

產碳青霉烯酶是一類由基因編碼合成的可分解碳青霉烯類抗生素，包括厄他培南、亞胺培南、美羅培南等的β 內酰胺酶[6～8]。本研究結果顯示，238 株CRKP 菌株中227 例產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌表型陽性，說明產碳青霉烯酶是該院CRKP 耐藥的重要原因。CRKP 攜帶的碳青霉烯酶基因具有地域差異，有研究顯示，在重慶、陜西、湖南分離的CRKP 多攜帶blaNDM基因[6～8]。本研究結果顯示，該院就診患者中CRKP 菌株攜帶的碳青霉烯酶基因比例最高為blaKPC-2基因，占71.37%；而blaNDM-1基因僅占15.42%；9 株同時攜帶blaKPC-2基因、blaNDM-1基因，占3.96%；未檢出攜帶blaIMP、blaVIM基因的菌株，與報道的重慶、陜西、湖南CRKP 攜帶碳青霉烯酶基因不同。分析原因可能是大多數blaKPC-2基因位于質粒上，可在多種人類最常見的病原微生物中播散耐藥性，所以其能迅速傳播的特性可能是檢出率最高的重要原因之一。目前，已發現的KP 對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制有：①水解碳青霉烯類藥物、產碳青霉烯酶；在碳青霉烯酶基因中最主要的是NDM-1、KPC-2、OXA-48。有報道[9～11]，在中國blaKPC-2ST11中流行主要與IncF 質粒介導的水平轉移有關。②高親和位點青霉素結合親和力下降或蛋白數量不足。③高水平產頭孢菌素酶/超廣譜β-內酰胺酶同時合并外膜孔蛋白表達量不足或缺失[12～14]。④形成生物被膜。本研究多位點序列分型顯示，ST11 分型最多，占62.03%，與國內CRKP 的主流克隆型一致，提示目前本地CRKP 菌株在遺傳上相對保守[15]。除ST11 外，本研究還檢出了ST15、ST1731、ST2230 等12 種ST 分型，雖然構成比例不高，但也可通過耐藥質粒的傳播產生耐藥，因此，應對ST 型散發分型給予關注。

綜上所述，CRKP 血流感染患者具有侵入性操作、伴隨心腦血管疾病、惡性腫瘤及聯合使用抗生素等特征。因CRKP 多重耐藥情況嚴重，且對臨床常用的抗生素高度耐藥，所以給治療造成極大的困難。CRKP 菌株主要為blaKPC-2基因型，ST11 是主要的流行克隆株，需要引起關注。