CircRNA作為骨質疏松癥生物標志物的研究進展

彭晨健 孫海濤 王軍 魏偉 劉岸龍 儲旭東 錢衛慶 馬勇, 郭楊 王禮寧*

1.南京中醫藥大學附屬南京中醫院骨傷科,江蘇 南京 210022 2.無錫市惠山區人民醫院骨科,江蘇 無錫 214100 3.南京中醫藥大學附屬醫院骨傷科,江蘇 南京 210001 4.南京中醫藥大學骨傷修復與重建新技術實驗室,江蘇 南京 210023 5.南京中醫藥大學中醫學院·中西醫結合學院,江蘇 南京 210022

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種老年人尤其是絕經后婦女常見的全身性代謝障礙性骨病,以骨組織微觀結構退化、單位體積骨量減少、骨脆性增加為特征[1-2]。隨著人口老齡化的加快,骨質疏松癥的發病率也越來越高,大多患者在發生骨質疏松性骨折后才獲得明確診斷,從而使得骨質疏松癥的診斷存在不同程度地滯后性,成為嚴重危害健康的公共衛生問題,給患者和社會帶來了沉重的負擔[3-4]。

目前臨床上對骨質疏松癥的診斷主要通過骨密度檢測(bone mineral density,BMD)來實現,但是骨密度變化緩慢具有一定的局限性和滯后性。骨代謝相關生化指標可反映骨代謝狀態,并作為協助診斷和鑒別診斷指標,但在疾病發展早期的敏感性仍顯不足。因此,積極發現并探索潛在的OP早期診斷相關生物標志物,提前干預防止骨質疏松癥嚴重并發癥的發生,具有重要的臨床價值及社會意義。

環狀RNA(circRNA)是一組非編碼RNA,具有較強的穩定性和組織特異性,在細胞功能中起著重要作用。隨著人們對表觀遺傳學研究的深入,大量研究證明了circRNA通過多種途徑參與調控成骨細胞和破骨細胞分化及功能,從而影響骨形成和骨吸收,與骨質疏松癥發生發展密切相關,具有作為潛在臨床生物標志物的潛能[5-6]。

綜上,本文擬通過文獻綜述circRNA在骨代謝中的作用,以及circRNA作為生物標志物在骨質疏松癥早期診斷中的研究進展。

1 骨質疏松癥的生物標志物

生物標志物是指能被客觀測量和評價,反映生理或病理過程,以及對暴露或治療干預措施產生生物學效應的指標。生物標志物不僅可從分子水平探討發病機制,而且在準確、敏感地評價早期、低水平的損害方面有著獨特的優勢,可提供早期預警,很大程度上為臨床醫生提供了輔助診斷的依據。

臨床技術發展至今,仍是以骨密度作為診斷骨質疏松癥、預測骨質疏松性骨折發生風險、評估抗骨質疏松藥物治療效果的主要指標。但由于骨密度需憑借雙能DXA儀器進行測量,變化過程緩慢,不能反映短期內骨質的變化情況,常需結合骨代謝指標進行動態監測觀察[7]。在OP的診斷過程中不同的生物標志物均發揮著相應的作用,骨代謝的動態情況可通過骨代謝生物標志物反映,而circRNA被研究發現在OP早期診斷中發揮著潛在作用。

骨形成和骨吸收是骨代謝的基本活動,骨形成與骨吸收的動態平衡是維持骨量和骨穩定性的基礎[8]。成骨細胞在骨形成過程中起著關鍵作用,骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,B-ALP)、骨鈣素(osteocalcin,OC)可反映成骨細胞的活性從而直接反映骨形成的狀態。同時成骨細胞所合成的I型原膠原可分解釋放Ⅰ型原膠原N末端前肽(procollagen type I amino-terminal propeptide,PINP)和Ⅰ型原膠原C末端前肽(procollagen type I carboxy-terminal propeptide,PICP)也可作為反映骨形成狀態的生物標志物。骨硬化蛋白(sclerostin) 作為成骨細胞的特異性表達蛋白可作為調控骨形成的生物標志物。骨保護素(osteoprotegerin,OPG)可抑制破骨細胞前體細胞向成熟破骨細胞分化,從而減少骨吸收增加骨形成,是一種新型骨形成標志物。

骨吸收的代謝產物和體現破骨細胞活性的物質通常被用來作為骨吸收的生物標志物。抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrated resistant acid phosphatse,TRAP)、Ⅰ型膠原交聯C-末端肽( cross linked C-telopetide of collagen type I,CTX)、Ⅰ型膠原交聯 N-末端肽( cross linked N-telopetide of collagen type I,NTX)、吡啶啉(pyridinoline,PYD)和脫氧吡啶啉(deoxypyridinoline,DPD)與破骨細胞活性成相關,可作為反映骨吸收狀態的生物標志物。羥脯氨酸(hydroxyproline,HOP)和組織蛋白酶K(cathepsin,Cat K)作為骨吸收的代謝產物也可作為骨吸收的生物標志物,但HOP可來源于皮膚等其他組織,故缺乏特異性。現有的這些骨代謝生物標志物(表1)多為骨代謝的生化產物,可從體液中檢出,具有安全、便捷、快速、經濟的特征,但這些骨代謝生物標志物一般只能從單一角度反映骨代謝的現狀,僅可用于骨平衡情況的監測,并不能直接用于骨質疏松癥的診斷[9]。因此尋找更具特異性和靈敏度的生物標志物,在骨質疏松癥早期診斷上發揮更大作用是今后的研究重點。

表1 骨形成與吸收的骨代謝生物標志物

2 circRNA作為骨質疏松癥生物標志物

circRNA作為一種具有穩定環狀結構的ncRNA,穩定存在于血液及各類體液中,可在基因層面調控骨質疏松癥的發生發展,因此其具備了成為骨質疏松癥早期診斷生物標志物的潛能[10]。

2.1 circRNA的生物學特性及功能

作為目前非編碼RNA領域研究的熱點,circRNA可在多種生物體中表達,具有穩定的環狀結構,可防止外切核酸酶介導進行降解,使其成為疾病中特殊的分子標記物[11-13]。研究表明,circRNA可通過不同的機制在疾病的發生、發展及演變過程中發揮重要的調控作用[14-17]。目前已有大量相關研究發現circRNA在神經系統疾病、心血管疾病、腫瘤疾病的發生發展和治療中起著重要作用,可作為疾病診斷及判斷預后重要的生物標志物,也可作為治療的分子靶標,具有非常重要的研究意義及臨床應用價值[18-20]。

2.2 circRNA調節成骨細胞與骨形成

成骨細胞作為骨形成過程中的重要細胞,可通過骨礦化、分泌生物活性因子及參與骨基質合成等多方面調控骨形成過程。對于成骨細胞分化活動,Qian等[21]通過使用RNA測序技術檢測BMP-2誘導鼠成骨細胞分化過程中circRNA的差異性表達發現,circ_19142、circ_5846 和circ_10042在高分化的成骨細胞中表達水平顯著升高。并通過實驗發現BMP2通過circ_19142/circ_5846 靶向 miRNA-mRNA 軸誘導MC3T3-E1細胞成骨分化。而Huang等[22]在研究YAP1促進BMSCs和MC3T3-E1的成骨分化的機制中發現,circ_0024097可通過miR-376b-3p/YAP1軸和Wnt/β-catenin通路促進BMSCs和MC3T3-E1成骨分化以促進骨形成。對于成骨分化相關生長因子方面的研究,骨橋蛋白( osteopontin,OPN)和膠原蛋白α-1(COL15A1)可調節 MC3T3-E1和MDPC23細胞的分化和礦化,而經驗證這一過程是circ_003795通過miR-1249-5p/COL15A1軸實現的[23]。也有實驗研究表明,沉默circ_ 009056可以增加miR-22-3p的表達,并降低BMP7、Runx2 的表達水平[24]。因此circ_009056可作為miR-22-3p的海綿,調節降鈣素基因相關肽誘導的細胞成骨過程。關于circ_0062582國內學者研究有著不同的研究發現,Li等[25]研究得出circ_0062582可通過靶向miR-145/CBFB軸來促進BMSCs的成骨分化,并上調OSX、OCN和COL1等成骨分化相關蛋白的水平;而Chen等[26]則研究發現circ_0062582也可通過海綿化miR-197-3p上調Smad5的表達,從而促進BMSCs增殖和成骨分化。通過不同方法對不同種類的成骨細胞進行研究分析發現,circRNA可反映成骨細胞在不同骨形成階段對于分化、增殖等多方面的調控作用。

2.3 circRNA調節破骨細胞與骨吸收

隨著人們對circRNA研究不斷的深入,越來越多的研究表明circRNA通過不同機制參與破骨細胞的成熟、分化、凋亡等過程。關于破骨細胞的增殖,Miao等[27]發現circRNA_009934作為miR-5107的ceRNA,調節其下游TRAF6靶基因的表達,促進破骨細胞的生成。在破骨細胞的分化研究中,Chen等[28]通過微陣列分析發現骨髓單核細胞巨噬細胞 (BMM) 分化中circ_28313的差異化表達,同時生物信息學分析表明circ_28313、miR-195a和CSF1形成一個ceRNA網絡,circ_28313通過miR-195a 間接調控靶基因CSF1的表達,從而調節BMM細胞向破骨細胞分化。而Liu等[29]通過生物信息學分析和熒光素酶報告揭示了circ_Hmbox1/miR-1247-5p/Bcl6的相互作用的機制。circ_Hmbox1主要通過與miR-1247-5p結合來抑制RANKL誘導的破骨細胞分化,miR-1247-5p可靶向bcl6調控破骨細胞分化和成骨細胞分化,以參與骨代謝的調節。也有學者通過分析絕經后骨質疏松癥患者中不同表達水平的circRNA發現circ_0007059在骨質疏松癥患者和人骨髓基質細胞破骨分化過程中表達上調。進一步研究發現circ_0007059可通過miR-378/BMP-2軸在破骨細胞形成中發揮重要作用,circ_0007059過表達可抑制BMSCs向破骨細胞的分化[30]。

3 circRNA與骨質疏松癥的早期診斷

目前,骨質疏松癥的診斷仍是以骨密度作為主要指標,但由于其檢測具有局限性及不便性,往往不能對骨質疏松癥進行早期診斷。circRNA可穩定并廣泛存在于人體的體液、血液及其他組織標本中,且在不同時期、不同組織的表達水平不同,具有時序性和組織特異性,使得circRNA成為現階段研究的熱點[31]。大量臨床及實驗研究證實circRNA在骨質疏松癥患者的外周血、骨髓干細胞或骨組織中表達均存在顯著差異,因而circRNA具備作為早期診斷生物標志物的潛能。

3.1 血清及血漿中的circRNA

血清及血漿作為血液的重要組成部分,含有多種蛋白質、脂類物質、維生素、無機物、核酸衍生物等分子成分,作為常用的臨床檢驗檢測標本,具有獲取簡便、質量穩定等特點,近年來也廣泛用于circRNA的研究。Yao等[32]對20例合并有椎體壓縮性骨折的骨質疏松癥患者的血清進行circRNA測序,共檢測出884個差異表達的 circRNA,其中上調554個,下調330個。Huang等[33]通過芯片技術研究發現circ_0006873和circ_0002060在老年性骨質疏松癥患者的血清表達中顯著升高,且circ_0006873和circ_0002060的表達量與BMD和T值呈顯著相關。ROC曲線顯示circ_0002060(AUC=0.746,P<0.05,靈敏度78%,特異性69%)對骨質疏松癥具有潛在的診斷價值,具有進一步開發作為骨質疏松癥生物標志物的作用。Han等[34]研究發現circ_0076690作為骨質疏松癥的診斷價值(ROC曲線顯示AUC = 0.829 9,P< 0.001,靈敏度為 79%,特異性為 85%)后,通過生物信息學分析和實驗驗證進一步發現circ_0076690可通過海綿化miR-152靶向Runx2以調節BMSCs的成骨分化,因此認為circ_0076690可以通過調節成骨分化影響骨代謝,從而作為骨質疏松癥診斷的潛在生物標志物。

3.2 外周血單核細胞中的circRNA

外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)作為破骨細胞前體細胞可以被誘導分化為破骨樣細胞,這使得外周血單核細胞與骨質疏松癥關系密切,且外周血循環中單核細胞的RNA表達穩定,具備成為生物標志物的良好潛力。Guan等[35]從外周血單核細胞中探究潛在的生物標志物,通過芯片測序及qPCR驗證發現circ_0021739在絕經后骨質疏松癥患者外周血單核細胞中表達顯著升高,ROC分析提示(AUC=0.849,P<0.001,靈敏度100%,特異性42.9%)circ_0021739具有作為PMOP診斷生物標志物的潛能。進一步研究發現circ_0021739可靶向miR-502-5p以調控破骨細胞生成,為開發骨質疏松癥的早期預防和診斷方法提供了新的途徑。Zhao等[36]用同樣的方法對58例絕經后骨質疏松癥患者及41例絕經后老年健康對照組志愿者的外周血單核細胞進行研究發現,circ_0001275存在差異性表達,其表達量與T值呈負相關,ROC曲線顯示circ_0001275具有顯著的診斷價值(AUC=0.759,P<0.001),所以circ_0001275可作為絕經后骨質疏松癥的潛在生物標志物。

3.3 血清外泌體中的circRNA

外泌體(eosomes)是直徑在30～150 nm的盤狀囊泡,攜帶有大量生物學信息如蛋白質、核酸及轉錄因子等,在進入靶細胞后可以對細胞發揮調節作用。此外,外泌體的脂質雙層可以保護RNAs不被核糖核酸酶降解,從而保留它們的功能活性,有利于標志物樣本的采集和儲存。Zhi等[37]在對以血清外泌體為檢測標本的一項對照研究中發現,骨質疏松癥患者外泌體中的circ_0006859上調,ROC曲線分析表明,circ_0006859可將骨質疏松癥患者與健康對照組區分開(AUC=0.897 4,P< 0.000 1,靈敏度93.1%,特異性93.33%),進一步生物信息學和實驗探究發現circ_0006859可通過海綿化miR-431-5p上調ROCK1抑制骨生成并促進脂肪生成,導致骨質疏松癥發生。且對患者進行9個月的抗骨質疏松治療后,血清外泌體中circ_0006859的表達水平也顯著下調,這進一步驗證了circ_0006859作為骨質疏松癥生物標志物的巨大潛力。

3.4 骨髓間充質干細胞及骨組織中的circRNA

骨髓間充質干細胞作為骨代謝過程的重要細胞,可促進骨修復和促進骨發育,與骨質疏松癥的發生發展也有密切關系。骨髓間充質干細胞中的circRNA不少都可作為治療骨質疏松癥的潛在新靶點。在對骨質疏松癥患者BMSCs進行研究上,Qiao等[38]發現circ_0048211的表達與miR-93-5p呈負相關,與BMP2呈正相關。circ_0048211可負向靶向miR-93-5p以上調BMP2,以減緩絕經后骨質疏松癥的進展。Wen等[39]通過對骨質疏松癥患者的骨組織標本進行研究發現circ_0076906通過海綿化miR-1305上調OGN的表達以促進BMSCs的成骨分化,減緩骨質疏松癥的發展。Long等[40]研究發現circ_0016624可通過海綿化miR-98,增強BMP-2的表達,加強成骨誘導因子的生成從而改善骨代謝預防骨質疏松癥發生。同時Liu等[41]研究證明circ_0007059可直接靶向miR-378,而miR-378又靶向BMP-2,circ_0007059過表達可抑制BMSCs向破骨細胞的分化,因而靶向circ_0007059/miR-378/BMP-2軸可能是治療骨質疏松的新思路。Ji等[42]研究新發現circ_0006215 通過競爭性結合miRNA-942-5p可調節BMSCs中RUNX2和VEGF的表達,以促進成骨分化及血管新生。同時體內實驗又通過敲低和過表達circ_0006215在皮質骨缺損模型驗證了其骨修復的作用,所以circ_0006215具有成為治療老年性骨質疏松癥的新靶點的巨大潛能。見表2。

表2 不同樣本中circRNA作為骨質疏松癥生物標志物的機制和潛能

4 總結與展望

綜上所述,眾多circRNA已被證實可通過多種機制參與骨代謝的調節,并影響成骨細胞、破骨細胞及骨髓間充質干細胞的增殖、分化及凋亡,調控骨形成與骨吸收過程。circRNA由于其特殊的穩定的環狀結構,且具備時空特異性和組織細胞特異性等特征,可在血清、細胞、外泌體、組織等中穩定表達,已逐漸顯現出了成為骨質疏松癥診斷生物標志物的出色潛能。

目前對于circRNA作為骨質疏松癥生物標志物的研究,大多通過微陣列或circRNA測序技術分析篩選臨床樣本中差異化表達的circRNA,并與骨質疏松癥臨床特征相關聯,通過ROC分析曲線篩選具備生物標志物潛能的候選circRNA。后續根據實驗驗證circRNA 作為生物標志物的可靠性和靈敏度,同時生物信息學及轉錄組學研究也可分析論證其在骨質疏松癥發生發展中的作用機制。但就目前已有的研究報道,circRNA大多通過形成circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA網絡引起骨代謝調控失常,從而影響骨質疏松癥的疾病進展,但其精確的作用靶標往往難以尋找。相信隨著生物信息學技術及基因測序技術的發展,骨質疏松癥中有關circRNA作為診斷標志物的研究也將更加深入。

作為生物標志物,必須有性質穩定、重復性好、采集方便、便于重復檢測動態觀察其表達水平等特質。現有研究中,相同來源的不同組織樣本作為研究對象往往會得出不同的研究結果。因此,樣本的來源和處理、保存、測定方法便顯得尤為重要。血清、外周血單核細胞及血清外泌體作為標本均具有上述優勢,后續的保存加工也相對簡單。如何從這幾類樣本中選取合適的類別作為骨質疏松癥早期診斷生物標志物也是亟需關注的問題。

同時,由于現有研究的樣本量往往較少,研究結論差異性較大。未來隨著轉錄組學、基因組學、影像組學的不斷發展,可以嘗試進行多種生物診斷標志物的聯合應用,如體液標志物和影像標志物的聯合。另外可通過進行多中心大樣本量的人群研究,對具有巨大生物標志物潛力的circRNA進行進一步的體內實驗驗證及隨訪觀察,以實現circRNA作為診斷生物標志物在骨質疏松癥中的臨床應用,為骨質疏松癥的早期診斷提供有效手段。