六味地黃丸對絕經后骨質疏松癥腎陰虛證的作用

阮紅良 佘冬梅 孫紹裘 陳振華

湖南中醫藥大學第二附屬醫院骨傷科,湖南 長沙 410005

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一種多發于中老年女性的慢性全身代謝性疾病,起病隱匿,無特異性癥狀[1]。其發病機制主要是由于絕經后雌激素及褪黑激素等缺乏,致使骨代謝失衡骨量減少,骨小梁微結構破壞[2-3]。既往研究表明,20%的女性患有PMOP,其中10%的女性有不同部位的骨折,骨質疏松性骨折嚴重影響生活質量[4]。因此,開展PMOP臨床與基礎研究,早期診斷和治療對于預防骨質疏松骨折至關重要。中醫論治PMOP多屬于腎陰虛證,補腎中藥能較好地治療PMOP。有文獻報道,六味地黃丸能提高患者骨密度,改善臨床癥狀。其臨床療效與絕經后腎氣漸虛,腎陰陽失調,人體免疫機能失調有關[5-6]。目前六味地黃丸治療PMOP腎陰虛證作用的分子基礎尚不十分清楚,需進一步探討。近年來研究發現,多種表觀遺傳和轉錄因子表觀參與PMOP的發生發展過程并起著重要調控作用[7-8]。溴結構域蛋白4(BRD4)是表觀調控蛋白BET家族成員[9]。研究發現,BRD4是一種轉錄調節因子,其可以與乙酰化染色質結合,參與細胞分裂循環過程中的基因穩定表達,在成骨細胞分化過程中BRD4也發揮重要作用[10-11]。鑒于BRD4的重要作用使其成為絕經后骨質疏松癥的新興治療靶點。本研究通過去卵巢骨質疏松大鼠模型探討BRD4表達與PMOP關系及六味地黃丸干預,旨在為中西醫防治PMOP提供實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物:SPF級雌性SD大鼠60只,6～8月齡,購自武漢華聯科生物科技有限公司動物中心,動物合格使用許可證號:SYXK(河北省)2021-006。本研究經湖南中醫藥大學動物實驗倫理委員會審批同意實施(202104100009)。

1.1.2主要儀器:Discovery A型骨密度測試儀(Holigic公司),YLS-16A型小動物骨骼強度測定儀(濟南益延公司)。

1.1.3主要試劑:六味地黃丸購自北京同仁堂(國藥準字ZI9993068),阿侖膦酸鈉片購自Merck公司(A4978)。BRD4抗體購自Abcam公司(ab289886)。β-actin抗體購自Abcam公司(ab8227);蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒和超敏ECL化學發光試劑盒均購自杭州碧云天生物技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1模型制備、分組和給藥:參照文獻[12]報道摘除雙側卵巢,建立絕經后骨質疏松癥模型。腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg),無菌條件下腹部正中切口進腹,絲線結扎卵巢并摘除。縫合切口前腹腔內注入萬古霉素10萬單位。手術后大鼠常規單獨飼養,自由飲水和進食。術后2周實驗動物傷口完全愈合后合籠,灌胃給藥,分為假手術組、模型組(生理鹽水,10 mL/kg)、中藥組(六味地黃丸385.7 mg/kg)、西藥組(阿侖膦酸鈉0.893 mg/kg)。觀察大鼠體重、毛發色澤、飲水量、自主活動次數、易激惹表型等。

1.2.2骨密度和骨生物力學測定:完整分離雙側股骨,標本放置于骨密度測試儀平臺上,分析檢測整體股骨的骨密度(g/cm2)。同時,通過小動物骨骼強度測定儀,參照文獻[13]報道采用三點彎曲法測量骨骼強度。

1.2.3骨組織結構觀察:用藥療程結束后,取各組大鼠雙側股骨組織標本,4%多聚甲醛固定24 h,用10% EDTA脫鈣液(pH值8.0)脫鈣15 d后石蠟包埋。切片厚4 μm脫蠟,蘇木素-伊紅(HE)染色30 s,1%濃度鹽酸酒精分化后伊紅復染。

1.2.4BRD4蛋白表達水平檢測:稱取雙側股骨組織約50 mg,用含蛋白酶抑制劑的蛋白提取試劑盒制備蛋白。在10% SDS-PAGE分離膠中進行電泳,然后將分離的蛋白轉移至PVDF膜上。用含0.05% Tween-20和5%脫脂牛奶的Tris緩沖液封閉膜,與一抗4 ℃孵育過夜。一抗BRD4工作濃度為1∶500,內參抗體工作濃度β-actin為1∶2 000,與HRP偶聯的二抗孵育,用PBS洗滌膜后,加入超敏ECL化學發光試劑在暗室曝光洗片。底片掃描用Image J軟件分析灰度值。

1.2.5PMOP中醫證型生物信息學分析:PMOP相關數據集GSE56116從Gene Expression Omnibus(GEO)數據庫下載并用于獲得BRD4信使RNA(mRNA)的差異表達。應用KEGG通路富集分析和GO富集分析預測差異表達的BRD4 mRNA的相關功能。GSE56116數據集按中醫證型將共納入10例PMOP患者,分為3組,腎陰虛者4例,腎陽虛者3例,非腎虛者3例[14-15]。

1.3 統計學方法

統計分析采用SPSS 25.0統計軟件包進行數據處理。組間比較采用單因素方差分析,結果用均數±標準差表示,P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組骨密度、骨強度和骨組織結構的變化

造模12周后,與假手術組比較,模型組大鼠股骨骨密度明顯降低(表1);與模型組比較,中藥組和西藥組均能有效提高模型組大鼠骨密度和骨強度(表1),差異具有統計學意義(P<0.05);中藥組與西藥組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。各組大鼠股骨干組織HE染色結果顯示,假手術組大鼠骨膜完整,骨小梁致密且寬;與假手術組比較,模型組骨小梁稀少且窄,小梁間距加大;中藥組和西藥組治療后的大鼠則觀察骨小梁明顯增加,與模型組大鼠比較(圖1),差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠骨密度、骨組織強度情況

圖1 各組大鼠骨組織HE染色情況

2.2 各組大鼠骨組織中BRD4蛋白表達的變化

Western blot檢測結果顯示,與假手術組比較,模型組BRD4蛋白表達升高,差異具有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,中藥和西藥干預后,BRD4蛋白表達均呈現下降趨勢,差異具有統計學意義(P<0.05)(圖2)。中藥組與西藥組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2 各組大鼠骨組織BRD4蛋白表達情況

2.3 BRD4 mRNA表達與PMOP腎虛分型的分析

將GSE56116測序數據分為PMOP腎陰虛、腎陽虛、非腎虛3組,比較BRD4轉錄水平結果顯示(圖3A),腎陰虛組BRD4 mRNA表達明顯高于腎陽虛組和非腎虛組,差異具有統計學意義(P<0.05)。為進一步研究BRD4在PMOP中的分子作用基礎,將PMOP分為BRD4 mRNA高表達組和低表達組(圖3B)。結果顯示,BRD4 mRNA高表達涉及RHCE、WASF3、LTBP1、SVIP、STMP1等基因表達改變;BRD4 mRNA低表達涉及PCP4、CPN1和ARHGEF35等基因表達改變。提示BRD4 mRNA在腎陰虛PMOP中上調累積系列基因表達事件。

圖3 BRD4 mRNA差異表達分析

2.4 BRD4表達調控相關信號通路及功能的預測分析

使用GSE56116數據對BRD4及其相互分子進行KEGG通路分析和GO功能富集分析。KEGG通路分析結果發現(圖4A),BRD4表達上調涉及5-羥色胺能神經突觸、血小板活性、神經配體受體反應以及鈣離子信號通路;BRD4表達下調涉及細胞因子相互作用、JAK-STAT信號通路。GO富集分析結果發現(圖4B),BRD4表達上調涉及第二信使介導的信號傳導、出凝血信號通路;BRD4表達下調涉及離子跨膜轉運、神經軸突導航等。提示BRD4表達在PMOP局部骨微環境中起重要調控作用。

圖4 PMOP中BRD4表達的富集分析

3 討論

盡管六味地黃丸治療PMOP臨床療效取得肯定,但其作用于PMOP多成分、多靶點間的相互關系及作用機制仍有待深入研究[16]。中醫對PMOP的病因病機、治則治法的認識均認為腎虛為發病的關鍵。本研究結果表明,六味地黃丸干預PMOP動物模型,可下調表觀調控分子BRD4蛋白表達水平;提示六味地黃丸治療PMOP和BRD4蛋白表達下調可能存在內在聯系。公共數據庫中BRD4基因表達與PMOP中醫腎虛癥候的相關性結果提示,BRD4基因表達與腎陰虛型PMOP密切相關。

最近的表觀基因組研究發現,BET蛋白(BRD2、BRD3、BRD4和睪丸特異性BRDT)充當表觀遺傳調控閱讀器,主要識別組蛋白尾部的乙酰化賴氨酸以調節染色質可塑性。研究表明,BRD4的抑制因子JQ1參與PMOP破骨細胞分化和病理性骨丟失的調控。破骨細胞的分化和形成依賴于巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)的激活[10]。RANKL與核因子κB受體活化因子(RANK)的結合會誘導腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)的募集,從而刺激破骨細胞生成所需的下游MAPK和NF-κB信號通路。此外,BRD4可讀取組蛋白的乙酰賴氨酸,從而改變染色質結構以確定干細胞命運和脂肪形成。敲除BRD4表達顯著減輕糖皮質激素介導的對H3K9ac結合Runx2啟動子的抑制、提高骨鈣素和Runx2的表達、礦化基質堆積[11]。一般而言,表觀遺傳調控機制特別是DNA甲基化,可調節多種疾病的基因表達,包括與骨代謝有關的關鍵基因。本研究發現,腎陰虛組BRD4 mRNA表達明顯高于腎陽虛組和非腎虛組,BRD4 mRNA高表達涉及RHCE、WASF3、LTBP1、SVIP、STMP1等基因表達改變;BRD4 mRNA低表達涉及PCP4、CPN1和ARHGEF35等基因表達改變。但是,BRD4是否與這些基因的互作參與腎陰虛型PMOP有待后續體內外實驗予以證實。

綜上所述,BRD4是腎陰虛型PMOP相關基因,其過表達可預測六味地黃丸療效。BRD4調控的RANKL/MAPK/NF-κB信號傳導途徑可能參與PMOP的發生發展,BRD4有望成為PMOP的潛在治療靶點。