SPME-GC-MS 結合多元統計方法探究冷萃與熱萃對咖啡萃取液香氣的影響

陸羽霜，施政廷，楊震南

（杭州味全食品有限公司，浙江杭州 310018）

咖啡作為僅次于水的第二大最常飲用的飲料，在70 多個國家均有種植，具有廣闊的市場和較高的經濟價值[1]，因其獨特且宜人的風味受到消費者的歡迎。而咖啡的風味質量主要由化學成分決定，包括有助于香氣特性的揮發性化合物和影響味道的非揮發性化合物。這些風味化合物會受到許多復雜因素的顯著影響，如加工方法、烘焙程度和沖泡方法[2]。

近年來，沖泡過程作為最接近咖啡消費的最后一步，越來越引起食品制造商的興趣。提取參數對咖啡的感官品質和風味感知起著關鍵作用，如咖啡粉粒度、提取時間、溫度和壓力[3]。按沖泡溫度分為經典熱沖泡咖啡和最近較為流行的冷沖泡咖啡。一般來說，高溫增加了水分子的動能，這有利于化合物從咖啡粉浸出。同時，高溫會影響咖啡中揮發性化合物的釋放，從而改變感官感知[4]。

氣相色譜-質譜法（GC-MS）常被用于檢測和鑒定不同咖啡不同處理條件下的揮發性化合物，固相微萃?。⊿PME）的優勢為樣品使用量少且處理簡單以及可對食品中釋放的揮發物進行實際測量，當兩者結合使用時，SPME-GC-MS 是分析來自咖啡基質中頂空釋放香氣的有效技術[5]。蘇雨馨[6]通過GC-MS對咖啡冷萃和熱萃后的香氣物質進行了比較與分析。朱曉紅[7]對不同萃取溫度下的哥倫比亞咖啡萃取液進行了香氣物質分析，三種萃取溫度萃取液的香氣成分基本一致，含量有所不同。Córdoba 等[8]通過對哥倫比亞中等烘焙度的阿拉比卡冷萃咖啡和熱萃咖啡揮發物的對比研究，發現冷萃咖啡的總呋喃和吡喃豐度高于熱萃咖啡。在以往的感官研究中，也經常報道熱萃咖啡和冷萃咖啡之間存在顯著差異[3,9]。但到目前為止，國內外關于導致熱萃咖啡和冷萃咖啡之間感官差異的化合物的研究報道非常有限。

香氣是決定咖啡品質最重要的關鍵因素之一，然而目前關于咖啡香氣的研究較多關注于不同產地或品種之間的比較，以及冷萃與熱萃間香氣成分差異的相關報道較少。本研究的目的是通過固相微萃取-氣相色譜-質譜（SPME-GC-MS）和氣味活性值（OAV）計算比較熱萃咖啡和冷萃咖啡中的芳香活性化合物，再結合多元統計分析將感官品評得分和香氣物質含量結合起來，首次探討了西達摩和云南咖啡豆經冷萃和熱萃后不同香氣成分與感官屬性之間的潛在相關性，旨在為冷萃與熱萃咖啡萃取液的研究開發、改進與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西達摩/云南咖啡豆（2022） 由廣東順大食品有限公司統一烘焙，中深度烘焙并密封保存于牛皮紙單向閥包裝袋中；1,2-二氯苯（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司產品；正構烷烴（C8～C40 標準品） 上海創賽科技有限公司產品。

TRACE 1310-TSQ 9000 氣相色譜-質譜聯用儀美國Thermo Scientific 公司；萃取頭（50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷） 美國Supelco公司；PRE 1 Z 咖啡豆烘焙機 德國Probat 儀器公司；VTA-6S3 咖啡豆研磨機 德國MAHLKONIG儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 冷萃方法：30 g 樣品研磨粉，使用60 g 0 ℃水浸濕后，以每3 秒1 滴的速度來冰滴萃取6 小時。熱萃方法：94±2 ℃萃取10 min。豆水比1:9（w:w）。參考工業加工，將熱萃和冷萃咖啡稀釋至2%總溶解固體（TDS）進行感官和隨后的儀器分析。每個實驗重復三次咖啡制備。

1.2.2 香氣成分測定 頂空固相微萃取條件：將處理好的咖啡萃取液樣品5 mL 轉移到20 mL 的專用樣品瓶中，然后加蓋密封。將樣品在60 ℃下平衡40 min，然后在相同溫度下萃取吸附30 min；將揮發性化合物解吸5 分鐘，然后通過分流進樣（進樣口溫度250 ℃；分流比5:1）進樣到GC-MS 系統中。

氣相色譜條件：在TG-5 MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）上進行分離。氦氣以1 mL/min的恒定流速用作載氣。升溫程序：40 ℃保持5 min，以1 ℃/min 升至90 ℃，再以3 ℃/min 升溫至110 ℃，最后以8 ℃/min 升至210 ℃，保持10 min。

質譜條件：以電子碰撞（EI）電離模式（70 eV）運行，掃描范圍為35～450 m/z；傳輸線溫度設置為240 ℃；離子源溫度設置為280 °C。所有樣品均用GC-MS 隨機分析。

定性定量方法：根據文獻[10-14]，通過與譜庫（NIST 14.0）檢索比較，選擇匹配度大于80%的物質；相同色譜條件下，用C8～C40 的正構烷烴對各化合物的保留指數（RI）進行計算，并與現有數據庫數據比較。

式中：RI 為待測物質保留指數；n 表示待測物質的碳數；RT（x）為待測物質的保留時間；RT（n）為待測物質流出前正構烷烴的保留時間；RT（n+1）為待測物質流出后正構烷烴的保留時間。

結合各色譜峰的峰面積進行香氣相對含量分析，并根據檢測出的各香氣成分峰面積與內標（1,2-二氯苯）峰面積的比值進行相對定量。

1.2.3 揮發性風味成分的OAV 值計算 OAV 按式（2）計算：

式中：Ci表示揮發性成分的質量濃度（μg·kg-1）；OTi表示任一組分在水中的香氣閾值（μg·kg-1）。

1.2.4 感官特征評價 感官評價在室溫下進行?？Х葮悠窂谋渲腥〕?，室溫下放置至20±3 ℃進行品嘗。由10 名專業訓練的不分年齡、性別的咖啡品鑒師（Q grader）評估熱萃和冷萃咖啡的香氣感官屬性強度。根據文獻[9]并配合實際形成咖啡的香氣感官描述評價，最終確定的詞匯包括：青香、堅果香、爆谷物香、熏烤香、果香、焦甜香，強度評分范圍為1～9 分。

1.3 數據處理

利用NIST 14 標準質譜庫結合賽默飛質譜數據處理系統對各化合物進行檢索，通過匹配度并參照相關文獻[2-5]報道綜合確定其化學成分；使用SPSS進行顯著性檢驗；使用Excel 進行數據分析和繪制感官雷達圖；通過SIMCA 14.1 和Origin Pro 9.0 軟件進行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）和熱圖聚類分析，可視化熱萃和冷萃咖啡的差異。

2 結果與分析

2.1 冷萃與熱萃對咖啡揮發性物質的影響

2.1.1 冷萃與熱萃咖啡揮發性物質的種類、含量及OAV 值 如表1 所示，在冷萃與熱萃咖啡液中共鑒定出69 種揮發性化合物，包括呋喃類化合物13 種，酮類化合物10 種等，吡嗪類化合物9 種，醛類化合物8 種，酯類化合物6 種，酚類化合物6 種，吡咯類化合物6 種，吡啶類化合物4 種及7 種其他類化合物。為了進一步評價香氣化合物對咖啡風味譜的貢獻，測定了OAV 值。一般認為，當揮發性化合物的OAV ≥1 時對整體香氣的貢獻較大，揮發性化合物的OAV＞10 時則被確定為重要香氣成分[15]。由表1可知，咖啡萃取液中共有39 種揮發性化合物的濃度均超過了各自的閾值，即OAV＞1。

表1 冷萃與熱萃咖啡揮發性物質的含量及OAV 值Table 1 Content and OAV of volatile compounds in cold brew and hot brew coffee

呋喃類化合物是4 種咖啡萃取液中種類及含量最多的物質，主要是由碳水化合物在咖啡烘烤熱降解時形成以及在脂質熱氧化過程中通過硫胺素的降解和核苷酸的分解形成[16]。由表1 可知，在西達摩和云南這兩種咖啡豆萃取中，冷萃中的呋喃類化合物總含量均高于熱萃中的含量，約為1.5 倍，X-Cold（ 474.38 mg/kg） ＞X-Hot（ 348.83 mg/kg） ， Y-Cold（507.20 mg/kg）＞Y-Hot（301.23 mg/kg）。雖然呋喃在咖啡中含量豐富，但由于呋喃的識別閾值較高，對咖啡香氣的貢獻有限，由表1 的OAV 值可知，13 種呋喃類化合物中只有5 種呋喃的OAV＞1（乙酸糠酯、2-正丁基呋喃、糠醛、糠醇和5-甲基-糠醛）。冷萃中這幾種物質的OAV 值均高于熱萃中，其中差異最為顯著的為乙酸糠酯，冷萃中的OAV 值約為熱萃中的2～3 倍，乙酸糠酯的香氣屬性常被描述為甜香及果香[17]。其次差異較為明顯的為2-正丁基呋喃和糠醛，冷萃中的OAV 值約為熱萃中的1.2 倍，2-正丁基呋喃的香氣屬性常被描述為溫和的甜香、酒香及果香，糠醛則被描述為甜香和類似烤面包的焦糖香[17]?？反己?-甲基-糠醛的OAV 值在冷萃和熱萃中差異不顯著。

吡嗪類化合物在4 種咖啡萃取液中含量也較為豐富，它主要由還原糖和氨基酸或蛋白質之間的美拉德反應形成[18]。由表1 可知，在西達摩和云南這兩種咖啡豆萃取中，冷萃中的吡嗪類化合物總含量也均高于熱萃中的含量。在西達摩咖啡萃取液中，冷萃的總含量約是熱萃的1.4 倍：X-Cold（173.51 mg/kg）＞X-Hot（123.63 mg/kg）；在云南咖啡萃取液中，冷萃的總含量約是熱萃的2 倍：Y-Cold（207.47 mg/kg）＞YHot（115.38 mg/kg）。吡嗪的閾值較低，在咖啡風味中起著至關重要的作用，由表1 的OAV 值可知，共有6 種呋喃的OAV＞1（2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、2-乙基-3-甲基砒嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪和2-乙基吡嗪）。其中差異最為顯著的為2,3-二乙基-5-甲基吡嗪，西達摩冷萃中的OAV 值約為熱萃中的5 倍，云南冷萃中的OAV 值約為熱萃中的10 倍，2,3-二乙基-5-甲基吡嗪的氣味屬性常被描述為堅果香及烤土豆味[19]。其次差異較為明顯的為3-乙基-2,5-甲基吡嗪，冷萃中的OAV 值約為熱萃中的2～3 倍，3-乙基-2,5-甲基吡嗪的香氣屬性常被描述為可可及烤堅果味[19]。2-乙基-3-甲基砒嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪和2-乙基吡嗪差異不顯著。

醛酮類化合物雖然在4 種咖啡萃取液中含量不高，但因其閾值較低，對咖啡的香氣也起著比較重要的作用。從表1 中可以看出，冷萃中的醛類和酮類化合物總含量也均高于熱萃中的含量。在測得的所有醛類化合物中（2-甲基丁醛、異戊醛、異丁醛、己醛、苯乙醛、2,5-二甲基苯甲醛、苯甲醛、2-甲基-2-丁烯醛），其OAV 值均大于1。其中，2-甲基丁醛、異戊醛、異丁醛和己醛在冷萃和熱萃中均存在差異，且冷萃的OAV 值大于熱萃。2-甲基丁醛主要提供可可、堅果、谷物、麥芽香，異戊醛、異丁醛和己醛主要提供青香、果香[20]。共有5 種酮類物質的OAV＞1（2,3-戊二酮、2-壬酮、丁二酮、3-己酮和2-戊酮），其中2,3-戊二酮、2-壬酮和3-己酮在冷萃和熱萃中差異較為顯著，2,3-戊二酮和2-壬酮提供黃油、奶油、焦糖香氣，并帶有烤堅果底香，3-己酮帶有甜香、果香及朗姆酒香[21-22]。

在酯類化合物中，冷萃中的總含量也高于熱萃，6 種酯類化合物中有4 種的OAV＞1（異戊酸甲酯、丁酸乙酯、壬酸乙酯和丙酸乙烯酯）。其中，異戊酸甲酯、丁酸乙酯和壬酸乙酯在冷萃和熱萃中均存在差異，且冷萃的OAV 值大于熱萃。異戊酸甲酯、丁酸乙酯和壬酸乙酯的氣味屬性常被描述為果香，異戊酸甲酯和丁酸乙酯偏向蘋果和菠蘿樣果香，壬酸乙酯則偏向葡萄樣果香，且有一定的玫瑰香氣[23]。

吡啶和吡咯類化合物都與葫蘆巴堿或者羥基氨基酸等前體物質有關[24]，在總含量上，冷萃的吡啶和吡咯類化合物也都高于熱萃。在香氣活性值方面，2-乙酰吡啶、吡啶和1-糠基吡咯的OAV＞1，吡啶類大多呈現谷物香、爆米花香及堅果香等，1-糠基吡咯回呈現果蔬味和榛子味等[25]。

酚類化合物咖啡烘焙末段干餾的產物，如4-乙基愈創木酚、4-乙烯基愈創木酚和愈創木酚是綠原酸在烘焙過程中降解產生的?？Х壤漭秃蜔彷椭蟹宇惢衔锏淖兓厔莶煌椒雍陀鷦撃痉拥暮績烧卟町惒伙@著，冷萃中的2-乙酰間苯二酚和含量高于熱萃中的，而4-乙基愈創木酚、2,4-二叔丁基苯酚和對乙烯基愈創木酚的變化趨勢為：熱萃＞冷萃。 苯酚、愈創木酚、4-乙基愈創木酚和對乙烯基愈創木酚的OAV＞1，這些物質會有一些香草、香料、木香及煙熏等風味屬性[26]。

除上述物質外，芳樟醇在冷萃和熱萃中的差異也比較顯著，其OAV 值也遠大于1，對咖啡的風味有較大的貢獻度，其風味屬性常被描述為柑橘香和花香。因多數萜烯醇都具有香氣活性高、閾值低的特點，使它成為了大多數茶葉的關鍵呈香組分，特別是芳樟醇類化合物[27]，而其體現出的花果香在咖啡中也能帶來令人愉悅的感受。由實驗結果可知，冷萃能保留更多的芳樟醇，在萃取時可注意溫度來提升咖啡的花果香。

一般情況下，高溫使飽和蒸汽壓升高，從而使揮發性化合物的損失增加[28]。這可以用來解釋冷萃咖啡中呋喃、吡嗪、醛酮、吡咯和吡啶等化合物的含量比熱萃中高，這與之前的研究是一致的[8]。熱萃和冷萃咖啡中酚類化合物的變化趨勢不同，可能是沖泡方式通過提取溫度和時間對酚類化合物濃度產生不同程度的影響，后續可進行深入研究。

2.1.2 冷萃與熱萃咖啡揮發性風味物質的熱圖分析

將上述咖啡萃取液中OAV 值＞1 的重要揮發性物質繪制成熱圖見圖1。從熱圖聚類分析層面可以看出，不同咖啡豆的熱萃聚為一類，冷萃聚為另一類，說明冷熱萃取對咖啡揮發性物質含量的影響顯著。從圖1 中還可以看出，絕大部分的揮發性化合物的含量變化趨勢：冷萃＞熱萃，這主要是由于一般情況下高溫使飽和蒸汽壓升高，化合物的揮發損失量增加[28]，這與Córdoba 等[8]的研究是一致的。而咖啡冷萃和熱萃中酚類化合物的變化趨勢不同，可能還與萃取時間有關，造成了熱萃中4-乙基愈創木酚、2,4-二叔丁基苯酚和對乙烯基愈創木酚的含量高于冷萃中。

圖1 不同咖啡萃取液重要揮發性物質熱圖Fig.1 Heat maps of important volatile substances in different coffee extracts

2.2 特征香氣感官評定

感官品評人員比較了冷萃與熱萃后咖啡萃取液的香氣特征差異，表2 歸納了香氣感官評定結果的平均得分，按照其得分可繪制圖2。

圖2 不同咖啡萃取液的香氣雷達圖Fig.2 Aroma radar map of different coffee extracts

表2 咖啡特征香氣評定結果Table 2 Evaluation results of coffee characteristic aroma

結合表2 和圖2，可以直觀的看出，無論是西達摩咖啡豆還是云南咖啡豆，冷萃的青香、果香、堅果香得分都明顯高于熱萃，其中，最顯著的是青香：XCold（4.70）＞X-Hot（4.00），Y-Cold（4.50）＞Y-Hot（3.70）。而熱萃的熏烤香得分高于冷萃：X-Cold（7.20）＜XHot（7.60），Y-Cold（7.00）＜Y-Hot（7.30），這一結果與陳仲娜等[19]對云南阿拉比卡冷萃與熱萃的感官研究結果一致。在爆谷物香及焦甜香方面，冷萃的得分也略高于熱萃。綜上所述，咖啡豆冷萃在香氣上呈現的是青香明顯，堅果香濃郁，果香環繞，略帶焦甜香，可能是由于其具有果香的乙酸糠酯及芳樟醇含量更高，具有烘烤堅果甜香的吡嗪類物質種類和含量更豐富；咖啡豆熱萃在香氣上呈現的是熏烤香濃郁，可能是因為其揮發性酚類物質的種類和含量更多。

2.3 香氣感官評價與揮發性物質的相關性分析

冷萃和熱萃的香氣感官得分與OAV 值＞1 的揮發性風味物質通過利用SIMCA14.0 分析軟件進行偏最小二乘法分析（PLS），其分析圖如圖3。由圖3可知，圖中包括2 個變量，分別為揮發性物質和香氣的感官特征，二者的距離越相近，表明其相關性越好，解釋性越強[29-30]。

圖3 冷萃與熱萃咖啡氣味特征與揮發性風味物質的PLS 分析圖Fig.3 PLS analysis diagram of odor characteristics and volatile flavor compounds of cold brew and hot brew coffee

揮發性物質與感官指標之間存在不同程度的正相關和負相關，說明多種揮發性物質構成香氣的感知[31]。其中，與熏烤香相關性較高的物質為對乙烯基愈創木酚和4-乙基愈創木酚，張豐等[26]對這兩個物質的香氣描述為香草、香料、木香及煙熏等，實驗結果與其較為一致。果香和青香的位置較近，異戊酸甲酯、2-正丁基呋喃、壬酸乙酯、己醛和丁酸乙酯與其相關性較高，其中，異戊酸甲酯和丁酸乙酯偏向蘋果和菠蘿樣果香，壬酸乙酯則偏向葡萄樣果香[23]，2-正丁基呋喃的香氣屬性常被描述為溫和的甜香、酒香及果香[17]，己醛常被描述成青香、果香等風味屬性[20]，所以，異戊酸甲酯、2-正丁基呋喃、壬酸乙酯和丁酸乙酯對實際果香貢獻率較高，己醛則對青香貢獻率較大。與堅果香相關性最高的物質為2,3-二乙基-5-甲基吡嗪，常被描述為堅果香、榛子味及烤土豆味[19]，它也是前述冷萃熱萃中差異最顯著的物質。焦甜香、爆谷物香和堅果香位置接近，圍繞在周圍的大多為吡嗪、吡啶類物質，這可能與風味物質之間的相互影響有關。

3 結論

利用SPME-GC-MS 結合多元統計分析方法從感官和香氣物質方面分析了云南和西達摩咖啡豆經冷萃和熱萃后萃取液的特征風味。共有69 種揮發性成分在不同萃取液中被鑒定出，其中有39 種物質的OAV 值＞1，冷萃中的呋喃類、吡嗪類、醛酮類及酯類等大部分物質含量高于熱萃中，熱萃中含量高于冷萃的物質為4-乙基愈創木酚、2,4-二叔丁基苯酚和對乙烯基愈創木酚。感官分析表明，冷萃的青香、果香、堅果香得分高于熱萃，而熱萃中的熏烤香得分更高。進一步利用PLS 將感官結合香氣物質分析發現，對乙烯基愈創木酚和4-乙基愈創木酚對熏烤香貢獻較大，己醛則對青香貢獻率較大，異戊酸甲酯、2-正丁基呋喃、壬酸乙酯和丁酸乙酯對果香貢獻率較大，2,3-二乙基-5-甲基吡嗪對堅果香貢獻率較大。本研究利用SPME-GC-MS 結合多元統計方法初步探討了不同香氣成分與感官屬性之間的潛在相關性，為冷萃與熱萃咖啡萃取液的研究開發、改進與應用提供了一定的理論依據，而在相關感官風味與風味物質聯系機制方面有待進一步研究，也需增加GC-O 進行深入檢測分析。