不同品種柑橘果皮精油關鍵香氣物質篩選

李 麗，蔣景龍，胡佳樂，師一璇，黃 佩，丁德寬

（1.陜西省催化基礎與應用重點實驗室，陜西理工大學化學與環境科學學院，陜西漢中 723001；2.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723001；3.城固縣果業技術指導站，陜西漢中 723200）

柑橘是世界上第一大水果，我國的種植面積和產量均居世界第一[1]。據國家統計局數據，我國柑橘2021 年產量5595.61 萬t[2]，按照柑橘果皮占柑橘全果重30%～50%計算，年產柑橘果皮超過1600 萬t。然而受深加工技術限制，柑橘加工中大部分皮渣則被當成廢料丟棄[3]，其實柑橘果皮是柑橘精油含量最高的部分，柑橘果皮精油是柑橘加工中的重要副產物，為果皮鮮重的0.5%～2.0%，據估算，全球年產柑橘精油高達4 萬t，是目前產量最大的天然香精油[4-5]。

柑橘精油具有令人愉悅的獨特芳香風味，其組成成分具有抗菌、防腐、消炎及抗癌等多種功效，近年來柑橘香氣物質的研究已成為研究的熱點，涉及香氣物質的提取及檢測、香氣物質的組成及不同品種柑橘香氣物質的比較等[6-8]，對柑橘精油的開發利用已經受到廣泛重視，柑橘精油銷售量占精油總銷售量的40%～50%[4]，被廣泛運用于食品、化妝品和醫療行業中[9-11]。柑橘精油產業發展需要優良香味品質的柑橘品種，香氣性狀由揮發性物質種類或含量決定，由于研究材料的不統一、香氣物質提取、檢測及分析方法的差異，難以系統比較不同種類柑橘果實香氣的特征性組分，哪些物質對不同類型柑橘香氣差異有貢獻，還需要進一步的研究。

本研究以陜南柑橘綜合試驗站種質資源圃相同生境下6 個品種柑橘果皮為研究材料，衢州香橙（Citrus junosQuzhou）原產長江上游，是我國柑橘栽培的重要砧木類型，其果皮香氣濃郁，是以加工為主的品種，因其獨特的香味廣泛應用于食品和烹飪中[12-14]。資陽香橙（Citrus junosZiyang）因其在四川資陽市分布較多而命名，是我國近年主推的柑橘砧木品種,果皮香氣濃郁，其果皮精油方面的研究報道較少[15-16]。青皮（Citri ReticulataePericarpium）為常用中藥，具有疏肝破氣、消積化滯等多種功效，其香氣濃厚、味苦[17]。青皮的成分含量測定文獻報道較多[18]，但漢中地區青皮的成分檢測報道甚少。南豐蜜橘（Citrus reticulataBlanco）是我國柑橘的優良品種，江西省南豐縣特有品種，果皮香氣濃，近年來南豐蜜桔副產物的開發也受到廣泛重視[19]。金秋砂糖橘（Jinqiu Shatangju）是中國農業科學院柑橘研究所由砂糖橘和愛媛30 號雜交育成的品種（中柑所5 號），是本世紀中國第一個擁有自主知識產權的優質雜柑新品種，果皮香氣濃[20]。紅美人（Citrus‘Hongmeiren’）是日本用‘南香’和‘天草’育成的橘橙類雜交品種，果香濃郁，該品種商業化生產的效益非常可觀，我國部分地區已經有了大面積的設施種植[21]。本研究采用頂空固相微萃取技術對相同生境下具有獨特香味的6 種柑橘果皮精油中揮發性成分進行了萃取富集，然后采用氣相色譜-質譜聯用技術對其化學組成進行分析，評價不同柑橘種質中揮發性物質，篩選富含揮發性成分的特殊種質及其關鍵香氣成分，為進一步開發和利用柑橘精油提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

衢州香橙、資陽香橙、青皮、南豐蜜橘、金秋砂糖橘、紅美人果實 6 種柑橘果實均于2021 年11 月2 日采自陜西省漢中市城固縣陜南柑橘綜合試驗站，按代表性采樣原則，每種柑橘均選擇樹齡一致、長勢相近的健康植株3 株，于樹冠中部外圍隨機選取大小一致、無病害的果實。

手動固相微萃取裝置和固相微萃取頭（含有50/30 μm CAR/DVB/PDMS） 美國Supelco 公司；7890B-5977B 頂空氣相色譜-質譜聯用儀及20 mL頂空萃取瓶、色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 美國Agilent 公司；EYELA旋轉蒸發儀N-1300D 東京理化；SL-J010 粉碎機 廣東蘇蘭電器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鄭州長城科工貿有限公司；ME104E 電子分析天平梅特勒-托利多。

1.2 實驗方法

1.2.1 6 種柑橘果皮精油提取 將柑橘果實洗凈晾干后，剝下果皮，將果皮的中果皮（白層）去掉后粉碎至4～5 mm，加入2%氯化鈉，混勻，置于5000 mL 圓底瓶中，水蒸氣蒸餾提取48 h，直至揮發油含量不再增加，正己烷萃取，旋轉蒸發濃縮備用。柑橘果皮精油含量（%）=（精油體積×精油比重/柑橘果皮質量）×100，精油比重為0.85[22]。

1.2.2 柑橘果皮精油揮發性成分的萃取富集方法取20 μL 樣品加1 mL 乙醇進行稀釋，置于20 mL 頂空瓶中。用帶有隔墊的瓶蓋密封，置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，在40 ℃條件下孵育15 min 后，使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭頂空吸附40 min 后，將萃取頭插入GC 進樣口，解析5 min[20]。

1.2.3 GC-MS 分析 GC 條件：進樣溫度：250 ℃；分流比：5:1；載氣：氦氣（99.999 %）；流量：1 mL/min；柱溫：35 ℃保持5 min，以3 ℃/min 升至180 ℃，以5 ℃/min 升至240 ℃保持1 min。

MS 條件：接口溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；電離方式：EI+，70 eV；掃描方式：全掃描；質量范圍：m/z 35～350[23]。

1.2.4 定性定量方法 定性分析：檢測出的揮發性物質通過計算機檢索與NIST 05 標準譜庫對照，僅報道正反匹配度大于80%的物質。通過正構烷烴計算各揮發性物質的保留指數（Retention index，RI）[24]。

定量分析：每種揮發性物質的濃度可通過與TMP 峰面積的比率來確定，校準系數均假定為1.00，柑橘果皮中每種揮發性物質的估計濃度計算參考，每個樣品重復 3 次。

1.2.5 相對氣味活度值（Relative Odor Activity Value，ROAV）結合GC-MS 分析6 種柑橘果皮精油關鍵香氣物質 通過計算ROAV，確定揮發性物質對樣品風味的貢獻。一般認為ROAV＞1 的揮發性物質是樣品中的關鍵風味物質，0.1＜ROAV≤1 的揮發性物質是對樣品的總體風味起修飾作用[25]。選取化合物中對樣品風味貢獻最大的ROAV 為100，其余各組分的ROAV 按下式計算：

式中：CA為化合物A 的相對百分含量；TA為化合物A 的香氣閾值，可以通過查閱文獻獲得（mg/kg）；Tstan及Cstan分別為對樣品風味貢獻最大的組分的香氣閾值和相對百分含量。

1.3 數據處理

所有樣品均3 次重復，實驗結果均以平均值±標準偏差（mean±S.D.）表示。采用Excel 計算柑橘果皮精油含量，進行原始數據處理；采用Origin 2019 對6 種柑橘果皮精油中的揮發性成分進行聚類熱圖分析，Graphpad prism 8 繪制物質含量堆積圖。

2 結果與分析

2.1 6 種柑橘果皮精油揮發性物質分析

通過GC-MS 檢測，在衢州香橙、資陽香橙、青皮、南豐蜜橘、金秋砂糖橘和紅美人的果皮精油中分別分離出28、36、26、17、17 和13 個主要色譜峰，6 種柑橘果皮精油成分的總離子流圖能夠明顯區分（圖1）。

6 種柑橘果皮精油共檢測到75 種揮發性物質，包括13 種單萜烯、19 種倍半萜烯、4 種烷烴、16 種醇類，10 種醛類、7 種酯類、4 種酮類、1 種酚類和1 種醚類（表1）。不同品種柑橘果皮精油成分和含量存在明顯差異，衢州香橙、資陽香橙、青皮、南豐蜜橘、金秋沙糖橘和紅美人果皮精油分別檢測到135、151、142、105、113 和95 種化合物，其中鑒定出的化合物分別為51、55、57、46、49 和45 種，鑒定出的成分占檢測出成分的37.78%、36.42%、40.14%、43.81%、43.36%和47.37%。6 種柑橘果皮精油均以單萜烯含量最高，衢州香橙、資陽香橙、青皮、南豐蜜橘、金秋砂糖橘和紅美人單萜烯含量分別占所有化合物總含量的80.41%、73.82%、84.27%、79.32%、84.13%和91.19%，其次是醇類（4.32%～12.63%）、倍半萜烯（1.51%～10.20%）、烷烴（0.07%～4.18%）、醛類（0.04%～2.71%）、酯類（0.01%～0.86%）、酮類（0.03%～0.43%）、酚類（0.00～1.61%）和醚類（0.00～1.17%）（圖2）。這與先前研究對不同產地香橙[12]、南豐蜜橘[22]、青皮[18]、紅美人[21]的其組成成分一致，同時跟柑橘其他品種[8,22-23]果皮精油的主要成分一致，只是這些各具獨特氣息的精油成分以不同的比例搭配在一起，就形成了每種精油獨特的具有辨識度的芳香氣味。

表1 6 種柑橘果皮精油成分及相對含量Table 1 Compounds and relative content in essential oils from six different citrus peels

圖2 6 種柑橘果皮精油揮發性物質占比Fig.2 Proportions of volatile substances in essential oils from six different citrus peels

Lota 等[26]通過柑橘果皮精油化學成分分析，將16 種寬皮柑橘分為3 個重要化學類型：檸檬烯型、檸檬烯/γ-萜品烯型和乙酸芳樟酯/檸檬烯型。Fanciullino 等[27]對15 種寬皮柑橘果皮精油化學成分進行分析，將其分為檸檬烯化學型和檸檬烯/γ-萜品烯化學型2 類，并且前者數量多于后者。6 種柑橘果皮精油中相對含量排前三的揮發性成分別為：衢州香橙、南豐蜜橘和金秋砂糖是D-檸檬烯（58.29%、62.59%、70.82%）、γ-萜品烯（12.57%、8.68%、5.53%）和芳樟醇（6.00%、6.94%、3.52%）；資陽香橙是D-檸檬烯（51.61%）、γ-萜品烯（12.01%）和α-萜品醇（4.99%）；青皮是D-檸檬烯（60.53%）、3-蒈烯（13.13%）和β-月桂烯（3.66%），紅美人是D-檸檬烯（84.48%）、β-月桂烯（4.07%）和芳樟醇（1.71%）。6 種柑橘果皮精油南豐蜜橘、金秋砂糖橘和紅美人以D-檸檬烯為主要成分，其他揮發性成分含量均小于10%，為檸檬烯化學型；衢州香橙和資陽香橙以D-檸檬烯和γ-萜品烯為主要成分，為檸檬烯型/萜品烯化學型；青皮以D-檸檬烯和3-蒈烯為主要成分，為檸檬烯型/蒈烯化學型。

柑橘中最主要的揮發性物質為萜烯類物質，萜烯類物質的共同前體為異戊烯焦磷酸（Isopentenyl diphosphate， IPP），進而被分別催化形成單萜、倍半萜等的直接前體物質牻牛兒焦磷酸、法尼基焦磷酸等萜烯類物質，IPP 主要是通過甲基赤磷酸糖醇（2-C-methyl-d-erythritol 4-phosphate pathway，MEP）和甲羥戊酸（Mevalonate pathway，MVA）途徑合成，直接合成基因是萜烯合酶基因（Terpene synthase，TPS）[28]。大多數TPS 基因在柑橘果實的發育前期都有較高水平的表達，但隨著果實發育進入成熟階段以后，這些TPS 基因的表達水平逐漸降低甚至不表達，而檸檬烯合成酶基因一直保持很高水平的表達，這解釋了柑橘果皮精油中檸檬烯含量很高的原因[29]。

MEP 途徑中最主要的限速酶是脫氧木酮糖-5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphatesynthase，DXS），獼猴桃中研究表明DXS 基因中的DXS1 基因與TPS 共表達可顯著提高單萜物質積累[30]。葡萄中DXS 基因在芳樟醇、香葉醇、香茅醇和α-萜品醇等物質積累中起重要作用[31]。此外，獼猴桃中研究表明NAC 和EIL 轉錄因子可結合Aa TPS1基因的啟動子調控β-月桂烯、α-蒎烯和d-檸檬烯等單萜物合成[28]。黃花蒿G-box 轉錄因子HY5 可結合QH6基因調控β-蒎烯生物合成[32]。薄荷Ms MYB 可負調控Ms GPPS.LSU基因影響單萜物質積累[33]。甜橙中Cit ERF71 可激活CitTPS16調節E-香葉醇（E-Geraniol）積累[34]。后期將從代謝和分子水平對柑橘種質香味形成相關基因進行挖掘和驗證。

2.2 6 種柑橘果皮精油揮發性物質熱圖分析

從聚類熱圖（圖3）可以看出，6 種柑橘果皮精油揮發性物質南豐蜜橘和金秋砂糖橘聚為1 類后依次與紅美人、衢州香橙、資陽香橙聚為1 類、最后與青皮聚為1 類。說明南豐蜜橘和金秋砂糖橘果皮精油揮發性物質差異較小，這二者與青皮果皮精油揮發性物質差異較大。75 種揮發性物質根據變化趨勢的類型可以分為5 類，化合物（Ⅰ）中辛烷、壬烷、癸烷和β-蒎烯在金秋砂糖橘、南豐蜜橘和青皮果皮精油中含量高，其余3 個品種果皮精油中含量較低或未檢測到；辛醇和乙酸辛酯在金秋砂糖橘和紅美人中含量較高，其余4 個品種果皮精油中未檢測到；D-胡椒酮、牻牛兒烯、α-法尼烯和熏衣草醇在南豐蜜橘和金秋砂糖橘果皮精油中含量高，其余4 個品種果皮精油中含量較低或未檢測到；壬醛和癸醛在南豐蜜橘和金秋砂糖橘和資陽香橙果皮精油中含量高，其余3 個品種果皮精油中含量較低或未檢測到；化合物（Ⅱ）在紅美人果皮精油中含量最高，其余5 個品種果皮精油中含量較低或未檢測到；化合物（Ⅲ）在資陽香橙果皮精油中含量最高，其余5 個品種果皮精油中含量較低或未檢測到；化合物（Ⅳ）中乙酸芳樟酯、γ-萜品烯和丁香烯在衢州香橙和資陽香橙含量高，其余4 個品種果皮精油中含量較低或未檢測到；α-萜品油烯僅在衢州香橙中檢測到，含量較高；化合物（Ⅴ）在青皮果皮精油中含量最高，其余5 個品種果皮精油中含量較低或未檢測到。

圖3 6 種柑橘果皮精油揮發性物質聚類熱圖Fig.3 Clustering heat map of volatile substances in essential oils from six different citrus peels

我國柑橘資源豐富，分布范圍廣，彼此之間均能自然雜交等，使得柑橘分類學研究困難，植物精油成分可用于研究柑橘分類學，柑橘的起源等[18]，本研究可通過柑橘果皮精油揮發性成分將寬皮柑橘和甜橙分類。

2.3 6 種柑橘果皮精油揮發性物質比較分析

6 種柑橘果皮精油共有的化合物有23 種，為D-檸檬烯、γ-萜品烯、芳樟醇、α-萜品醇、β-月桂烯、環葑烯、4-萜烯醇、α-水芹烯、β-蒎烯、3-蒈烯、γ-欖香烯、δ-杜松烯、癸醛、β-萜品醇、δ-欖香烯、丁香烯、甘香烯、β-可巴烯、紫蘇醛、薄荷二烯醇、α-蓽澄茄烯、香葉醇和香芹酮，其中單萜烯7 種、倍半萜烯7 種、醇類6 種，醛類2 種和酮類1 種。這23 種化合物在衢州香橙、資陽香橙、青皮、南豐蜜橘、金秋砂糖橘和紅美人中的含量分別占所有化合物總含量的89.24%、80.33%、86.78%、88.84%、90.09%和94.59%，也是其主要的組成成分。

6 種柑橘果皮精油揮發性成分均為D-檸檬烯含量最高，其中紅美人含量最高，達到83.49%。紅美人獨有的化合物為乙酸香葉酯和反式-香葦醇，甜橙醛的含量高于其他品種；衢州香橙和資陽香橙果皮精油中γ-萜品烯、α-萜品醇、α-水芹烯、丁香烯、甘香烯和香葉醇含量高于其他品種，衢州香橙獨有的化合物為α-萜品油烯；資陽香橙獨有的化合物為2-己烯醛，γ-欖香烯、δ-杜松烯、β-可巴烯含量高于其他品種；南豐蜜橘、金秋砂糖橘和青皮果皮精油β-蒎烯含量較高；衢州香橙和南豐蜜橘果皮精油芳樟醇較高；青皮獨有的化合物為己醛，紫蘇醛含量高于其他品種，3-蒈烯含量高于其他品種。

2.4 ROAV 法結合GC-MS 分析6 種柑橘果皮精油關鍵香氣物質

目前多數植物油香氣的研究都采用GC-MS，該方法僅能從化學成分及含量上對其揮發性組分進行闡述，但不是所有揮發性成分對柑橘果皮精油特征香氣有貢獻，有的成分雖然相對含量高，但是因為其氣味閾值高，香氣活度值相應低，不能對整體特征香氣有顯著影響，而有的成分雖然相對含量低，但是因為其氣味閾值極低，所以其所具有的香氣活度值高，對整體特征香氣的貢獻也大，ROAV 法可以結合GCMS 分析結果快速篩選出關鍵香氣化合物。本實驗根據文獻[35-37]得到的香氣閾值計算出柑橘果皮精油揮發性物質ROAV 值，芳樟醇是柑橘果皮精油中風味貢獻最大的物質。一般認為ROAV＞1 的揮發性物質是樣品中的關鍵風味物質[38]。6 種柑橘果皮精油共篩選到關鍵香氣物質27 種（表2），其中衢州香橙果皮精油的關鍵香氣物質共8 種：芳樟醇、α-萜品醇、β-蒎烯、香葉醇、D-檸檬烯、α-萜品油烯、γ-萜品烯和β-月桂烯；資陽香橙果皮精油的關鍵香氣物質共14 種：芳樟醇、α-萜品醇、香葉醇、D-檸檬烯、辛醛、β-蒎烯、γ-萜品烯、紫蘇醛、β-萜品醇、α-水芹烯、β-月桂烯、癸醛、乙酸芳樟酯和3-蒈烯；青皮果皮精油的關鍵香氣成分共11 種：芳樟醇、甲酸異龍腦酯、紫蘇醛、3-蒈烯、β-蒎烯、D-檸檬烯、反式-氧化芳樟醇（呋喃）、香葉醇、β-月桂烯、辛烷和香芹酮；南豐蜜橘果皮精油的關鍵香氣物質共8 種：芳樟醇、β-蒎烯、α-萜品醇、D-檸檬烯、紫蘇醛、γ-萜品烯、辛醛和香葉醇；金秋砂糖橘果皮精油的關鍵香氣物質共13 種：芳樟醇、β-蒎烯、D-檸檬烯、α-萜品醇、乙酸辛酯、紫蘇醛、辛醛、γ-萜品烯、辛烷、β-月桂烯、香茅醛、癸醛和香茅醇；紅美人果皮精油的關鍵香氣物質共18 種：芳樟醇、D-檸檬烯、紫蘇醛、甜橙醛、α-萜品醇、香芹酮、香茅醛、β-月桂烯、香茅醇、辛醛、乙酸辛酯、乙酸香葉酯、乙酸香草酯、β-水芹烯、癸醛、檸檬醛、β-萜品醇和香葉醇。

表2 6 種柑橘果皮精油中關鍵香氣成分Table 2 Key aroma components in essential oils from six different citrus peels

6 種柑橘果皮揮發性成分紅美人果皮關鍵香氣物質種類最多，多為醛類、醇類物質；其次是資陽香橙，主要為單萜類物質；青皮果皮關鍵香氣物質種類多，其中單萜4 種、醇類2 種、醛類1 種、酯類1 種、烷烴1 種、醚類1 種、酮類1 種；金秋砂糖橘多為單萜類、醛類、醇類；南豐蜜橘果皮關鍵香氣物質為醇類、單萜類、醛類，衢州香橙果皮關鍵香氣物質種類最少，為單萜類和醇類。果實香氣的形成可根據香氣合成過程中底物種類的不同，分為萜類代謝途徑、脂肪酸代謝途徑和氨基酸代謝途徑。果實萜烯類物質主要由萜類代謝途徑合成，大部分的醇、醛、酮、酯類物質均以脂肪酸為前體通過脂肪酸代謝途徑形成，支鏈脂肪族醇、醛、酮和酯類等香氣物質主要是通過氨基酸代謝途徑形成，不同的底物和酶活性會生成不同的香氣物質，從而決定了果實的香氣[39]。

3 結論

柑橘精油揮發性成分與遺傳型、起源、氣候、季節以及成熟度等條件有關，不同柑橘類型、不同栽培種類差異較大[40]。柑橘精油的化學成分和含量能夠揭示不同柑橘品種和栽培種的遺傳差異[41]。本研究結果中，相同生境下、相同株齡的衢州香橙、資陽香橙、青皮、南豐蜜橘、金秋砂糖橘和紅美人果皮精油含量具有明顯差異。

6 種柑橘果皮精油共檢測出75 種揮發性成分，其中共有成分23 種，這23 種共有成分占6 種柑橘果皮精油所有化合物總含量的80.33%～94.59%，天然的風味和芳香源于多種化合物的復雜混合物[42]。通過ROAV 法確定精油中的關鍵香氣成分，6 種柑橘果皮精油共篩選到27 種關鍵香氣成分，其中單萜烯8 種、醛類6 種、醇類5 種、酯類5 種、酮類1 種、醚類1 種和烷烴1 種。芳樟醇是6 種柑橘果皮精油中風味貢獻最大的物質。單萜烯β-蒎烯、D-檸檬烯、α-萜品油烯、γ-萜品烯、β-月桂烯、α-水芹烯、β-水芹烯、3-蒈烯和辛烷閾值較高，但在6 種柑橘果皮精油中含量較高，所以這9 種烴類物質對果皮風味貢獻較大，是關鍵風味成分。醛類、醇類和酯類物質普遍具有強烈的氣味特征，因其香氣閾值一般較低，對6 種柑橘果皮風味也做出了較大的貢獻。這些關鍵風味成分和重要修飾成分共同構成了柑橘果皮的特征香氣。

柑橘果皮精油化學成分組成和含量的差異反映了不同品種間的遺傳差異，本研究6 個品種柑橘果皮精油揮發性物質組成顯示南豐蜜桔和金秋砂糖桔相近、衢州香橙和資陽香橙相近，這可能與品種間的遺傳差異有關。本研究分析比較了漢中生境的6 個柑橘種質果皮精油揮發性物質組成并篩選了其關鍵香氣成分，柑橘果皮揮發性成分組成及含量與柑橘品種、產地、樹齡、栽培方式、管理技術、生長階段等多種因素有關，后續將擴大香氣物質的研究范圍、加大樣本量，進一步分析不同柑橘果皮中各特征香氣物質對香氣風味的貢獻程度，這對特殊香氣資源的開發和利用具有重要意義。