HBV DNA聚合酶在介導HBV相關肝細胞癌腫瘤細胞免疫逃逸中的作用

李鴻俠， 孫一萌， 張鴻濤， 韓樹旺， 張德林， 尚海濤， 郭 午， 劉軍艦， 李忠廉

1 天津市中西醫結合醫院肝膽胰外科， 天津 300100； 2 天津醫科大學研究生院， 天津 300070

肝細胞癌（HCC）是一種常見且致命的實體惡性腫瘤［1］，其發病率居世界第六位，死亡率居世界第四位［2-5］。目前HBV 感染是導致HCC 的主要致病因素，全球50%～80%的HCC 都是由HBV 感染引起的［6-7］。HBV 屬于嗜肝DNA 病毒科，其基因組共編碼7 種蛋白，包括參與病毒復制的DNA 聚合酶Pol［8-10］；介導病毒進入的三種表面抗原（HBs），即小（S）、中（M）和大（L）表面抗原［11］；組成病毒衣殼結構的核心抗原（HBcAg）；分泌到血清中的e 抗原（HBeAg）［11-13］以及具有轉錄調節功能的HBx抗原［14-17］。其中，HBV DNA聚合酶是唯一具有酶活性的蛋白質。研究［18-19］表明，HBV DNA聚合酶是一種多功能蛋白質，除了參與病毒復制和病毒包裝之外，還具有促進肝癌細胞生長和免疫調節［20-24］等多種生物學功能。然而HBV DNA 聚合酶是否也參與了肝癌細胞的免疫逃逸，尚不清楚。

本研究旨在闡明HBV DNA 聚合酶是否參與介導了T 淋巴細胞的功能衰竭并進而引起了HBV 相關HCC 腫瘤細胞的免疫逃逸，以及在此基礎上進一步闡明分子機制，這將有助于HBV 相關HCC 腫瘤細胞免疫逃逸機制的完善，或許可以為臨床提供新的思路以建立新的免疫治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒 本研究所用的空載體質粒為pcDNA3.1（+），購自Invitrogen，其余質粒均在此基礎上應用PCR技術進行構建。所用引物序列見表1。

1.1.2 細胞系 人肝癌細胞系Huh7、HepG2 和人T淋巴細胞白血病細胞系Jurkat 購自ATCC 細胞庫。Huh7 和HepG2 細胞使用DMEM 完全培養基（Gibco?）進行培養，Jurkat 細胞使用RPMI-1640 完全培養基（Gibco?）進行培養，所有培養基均含10%胎牛血清（Gibco?）、100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素。細胞的培養環境為含有5% CO2的37 ℃恒溫培養箱。

1.1.3 抗體和試劑 小鼠抗人Flag 抗體購自Sigma-Aldrich，兔抗人GAPDH 抗體、兔抗人ICAM1 抗體、兔抗人STAT3 抗體、兔抗人p65 抗體和兔抗人p50 抗體購自Abcam。辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的抗小鼠和抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。刀豆素A（Con A）購自Solarbio，放線菌素D、環己酰亞胺、G418 購自Sigma-Aldrich，所有試劑均以DMSO 溶解使用。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞共培養和細胞轉染 將穩轉細胞系或對照細胞與Jurkat 細胞以3∶1 的比例接種于24 孔細胞培養板中進行48 h 的培養，所用培養基為RPMI-1640完全培養基。然后將Jurkat 細胞分離出來，通過添加10 μg/mL ConA 刺激24 或48 h 以進行后續實驗。使用lipofectamine 2000（Invitrogen）按照制造商的說明進行細胞轉染。

1.2.2 MTT法細胞增殖實驗 將Jurkat細胞以105/孔接種在96孔細胞培養板中，每組設置5個復孔。在培養24 或48 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT（Sigma）溶液10 μL，于37 ℃恒溫培養箱中繼續培養4 h。此后吸出培養基，加入100 μL 的DMSO（Sigma）溶液，搖床避光5 min，之后用紫外分光光度計（Bio Tek）在490 nm（A490）處讀取吸光度。

1.2.3 實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR） 使用RNAiso Plus試劑（Takara）提取細胞總RNA。cDNA是根據制造商的實驗方案使用PrimeScript? RT Master Mix（Takara）生成的。使用實時熒光定量PCR儀器（LC480Ⅱ）和SYBR綠色PCR預混液（Takara）對cDNA進行實時PCR定量，相對定量表示為2-?Ct。Real-time引物如下：ICAM1上游及下游引物分別為5′-CAAGGCCTCAGTCAGTGTGA-3′和5′-CCTCTGGCTTCGTCAGAATC-3′；HBV-P 上 游 及 下 游引 物 分 別 為5′-CTCTCTTTACGCGGACTCCC-3′和5′-TCTTCTAGGGGACCTGCCTC-3′；GAPDH 上 游 及 下 游引 物 分 別 為5′-CAAAATGGTGAAGGTCGGTGT-3′和5′-TGATGTTAGTGGGGTCTCGCT-3′。

1.2.4 酶聯免疫吸附測定（ELISA）實驗 收集細胞上清液，根據制造商的說明用人IFN-γ ELISA 試劑盒（Solarbio）進行檢測，并通過Curve Expert1.4 分析結果。

1.2.5 蛋白質免疫印跡（Western Blot）實驗 收獲細胞，用RIPA 裂解緩沖液（1 mmol/L MgCl2，10 mmol/L Tris-HCl pH=7.4，0.1% SDS，1% NP-40）提取蛋白質，然后通過Western 印跡分析蛋白質表達，如前所述［25］，GAPDH 作為內參。所用抗體比例如下：抗ICAM1 抗 體（1∶1 000）、抗Flag 抗 體（1∶3 000）、抗STAT3 抗體（1∶500）、抗p65 抗體（1∶500）、抗p50 抗體（1∶500）、抗GAPDH 抗體（1∶3 000）、HRP 偶聯的抗小鼠二抗（1∶3 000）和HRP偶聯的抗兔二抗（1∶2 000）。

1.2.6 RNA-seq 從穩定轉染Flag-HBV-P 的細胞系中提取總RNA，由北京百邁客生物科技有限公司進行轉錄本分析。數據生成和標準化后分析HCC 細胞中HBV DNA聚合酶調節的基因表達數據。

1.3 統計學方法 所有數據均使用GraphPad Prism 6.0 軟件進行分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 穩定表達HBV DNA 聚合酶的人HCC 細胞會抑制Jurkat 細胞的功能 與對照組比較，實驗組細胞（Huh7、HepG2）的 增 殖（Huh7：t24=11.27，t48=11.75，HepG2：t24=11.37，t48=15.42，P值均<0.001）（圖1a、b）、活化（t值分別為5.921、6.211，P值均<0.01）（圖1c、d）和細胞因子分泌均降低（t值分別為7.761、8.564，P值均<0.01）（圖1e、f）。

圖1 穩定表達HBV DNA聚合酶的人HCC細胞抑制了Jurkat細胞的增殖、CD69表達和IFN-γ分泌Figure 1 Human HCC cells stably expressing HBV DNA polymerase inhibit proliferation， CD69 expression and IFN-γ secretion in Jurkat cells

2.2 HBV DNA 聚合酶下調ICAM1 的表達 與對照組相比，實驗組細胞中上調的基因有771 個，下調的基因有144 個（圖2a）。GO 富集分析（圖2b、c）尋找到下調的免疫相關分子ICAM1 且TIMER 數據庫（圖2d）顯示肝癌中的ICAM1 表達與腫瘤免疫細胞浸潤水平呈正相關（P值均<0.05）。與對照組相比，實驗組細胞（Huh7、HepG2）中ICAM1 的mRNA 表達水平（t值分別為4.959、5.091）和蛋白表達水平（t值分別為5.102、4.831）均明顯降低（P值均<0.01）（圖2e、f）。

2.3 網站預測ICAM1 啟動子區域可能結合的轉錄因子 UCSC 數據庫預測了ICAM1啟動子區域可能結合的轉錄因子，并初步篩選錨定了3 種轉錄因子NFKB1、RELA（參與NF-κB 信號通路）和STAT3（參與STAT 信號通路）（圖3a）。JASPAR 數據庫預測了ICAM1 啟動子區域中NFKB1、RELA 和STAT3 結合的可能區域位點及序列，將可信區間調到90%后，在ICAM1啟動子區域存在5個篩選的轉錄因子結合區域（圖3b、c）。

2.4 HBV DNA 聚合酶通過抑制NF-κB 的表達下調ICAM1 水平 與對照組相比，實驗組細胞（Huh7、HepG2）中的p50 和STAT3 蛋白水平沒有明顯變化（P值均>0.05）（圖4a、b），但p65 的蛋白表達水平明顯降低（t值分別為12.67、11.66，P值均<0.01）（圖4c）。與對照組相比，實驗組細胞（Huh7、HepG2）過表達p65后，ICAM1 蛋白表達水平明顯升高，降表達p65 后，ICAM1蛋白表達水平明顯降低（P值均<0.01）（圖4d）；挽救實驗中過表達p65 后，對照組與實驗組細胞的ICAM1表達水平無明顯差異（P值均>0.05）（圖4e）。

圖4 HBV DNA聚合酶通過抑制NF-κB表達而下調ICAM1水平Figure 4 HBV DNA polymerase downregulates ICAM1 levels by inhibiting NF-κB expression

2.5 過表達ICAM1 可以部分緩解HBV DNA 聚合酶對免疫細胞功能的抑制 與對照組相比，實驗組細胞（Huh7、HepG2）的增殖（圖5a、b）、活化（圖5c、d）和細胞因子分泌（圖5e、f）均無明顯差異（P值均>0.05）。

圖5 ICAM1的過量表達部分緩解了HBV DNA聚合酶對免疫細胞功能的抑制Figure 5 Overexpression of ICAM1 partially alleviates the suppression of immune cell function by HBV DNA polymerase

3 討論

在目前的研究中確定ICAM1可以被HBV DNA聚合酶下調。具體來說，HBV DNA 聚合酶通過抑制NF-κB中p65 的表達來調節ICAM1 的轉錄，從而使ICAM1 在惡性肝細胞上表達減少，導致ICAM-1/淋巴細胞功能相關抗原-1（lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1）軸介導的腫瘤免疫逃逸，最終促進HCC 的發展。

HCC 被認為是一種高度異質性的疾病，在腫瘤和鄰近組織之間有不同的免疫微環境［26］。腫瘤微環境中的免疫細胞大多受到功能抑制，尤其是T 淋巴細胞，常常表現出功能衰竭，這使得腫瘤細胞可以逃避免疫系統的監視并促進腫瘤的進展。基于此，筆者研究了HBV DNA聚合酶對Jurkat細胞增殖、活化和細胞因子分泌的影響，發現HBV DNA 聚合酶抑制了Jurkat細胞的免疫功能。結果表明，HBV DNA 聚合酶可能在T淋巴細胞衰竭中發揮重要作用，從而導致HBV 相關HCC 腫瘤細胞的免疫逃逸。為了進一步探尋具體機制，同時進行了轉錄本的分析，尋找到了免疫相關分子ICAM1。

ICAM1 是一種細胞表面糖蛋白和黏附受體，又稱為CD54，屬于免疫球蛋白超家族［27］。ICAM1 在免疫細胞、內皮細胞和上皮細胞中以較低的基礎水平表達，但在炎癥刺激下表達上調［28］，其最為人知的功能是調節白細胞從循環到炎癥部位的募集［29-30］。隨著研究的進展，作為生物傳感器的ICAM-1 已經成為許多基本細胞功能的主要調節者。ICAM-1 的受體有LFA-1和巨噬細胞分化抗原-1。其中，LFA-1是ICAM-1的主要受體，ICAM-1/LFA-1的相互作用被證明是白細胞遷移和T 淋巴細胞活化的關鍵步驟［31］。在腫瘤細胞中，它們的相互作用會產生腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）反應［32］，從而啟動抗腫瘤免疫過程。而腫瘤細胞中ICAM-1 表達的減少會阻止CTL 與腫瘤細胞的有效結合，在一定程度上有助于腫瘤逃避宿主免疫監視。研究［33］表明，ICAM-1/LFA-1 的相互作用也能刺激NK 細胞的細胞毒活性。另外，ICAM-1 的表達降低也顯示與各種癌癥的不良預后有關，如黑色素瘤、乳腺癌、結直腸癌和卵巢癌等。本研究中HCC 細胞實驗表明，HBV DNA 聚合酶降低了ICAM1 mRNA和蛋白的表達水平。為了進一步明確HBV DNA 聚合酶對ICAM1的下調發生在何種水平，進行了mRNA 和蛋白半衰期實驗，結果表明HBV DNA 聚合酶的過表達不會影響ICAM1 的半衰期。這些數據表明，HBV DNA 聚合酶對ICAM1 的下調是由于抑制了其轉錄。然而，目前似乎并沒有HBV DNA 聚合酶參與轉錄調控的相關研究。因此，筆者將研究方向轉移到了尋找HBV DNA 聚合酶可能調控且可以調控ICAM1 表達的轉錄因子上。通過網站預測初步篩選了3 種轉錄因子，Western Blot實驗表明p65可以正調控ICAM1的表達，挽救實驗中過表達p65 后，HBV DNA 聚合酶對ICAM1 的下調得到恢復，證明HBV DNA 聚合酶可以下調NF-κB 中p65 的表達并通過此方式下調ICAM1的表達。

此外，功能實驗表明，HBV DNA 聚合酶在一定程度上影響了T 淋巴細胞的免疫抑制，并且在ICAM1 過表達之后這種作用被逆轉，證實了HBV DNA 聚合酶通過下調ICAM1的轉錄在HCC中起免疫抑制作用。

綜上所述，本研究揭示了HBV DNA聚合酶可以作為一個重要的調控因子來控制ICAM1 的表達以介導抗癌免疫逃逸，這不僅深入了解了HBV DNA聚合酶的生物學功能、揭示了ICAM1 的新調控機制，而且為改進肝癌的臨床治療提供了新的思路和策略。但是目前的研究并沒有深入探索HBV DNA 聚合酶是如何下調NF-κB中p65的表達的，這也將是未來的研究重點。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：李忠廉、李鴻俠負責設計論文框架，起草論文；孫一萌、郭午負責實驗操作，研究過程的實施；尚海濤、張鴻濤負責數據收集，統計學分析，繪制圖表；韓樹旺、張德林負責論文修改；李忠廉、劉軍艦負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。