苗藥吉祥草配伍余甘子抗Lewis肺癌細胞增殖組分的篩選*

黃興文，劉 煒

（1.廣東云浮中醫藥職業學院，廣東 云浮 527400；2.貴州中醫藥大學第二附屬醫院，貴州 貴陽 550001）

吉祥草和余甘子均收載于《貴州十大苗藥研究》。吉祥草[Reineckia carnea（Andr.）Kunth.]又名小葉萬年青、觀音草等，為百合科吉祥草屬植物。吉祥草味甘，性涼，具有清肺止咳、解毒利咽、涼血止血等作用，為貴州十大苗藥之一[1-2]。吉祥草是苗族人民用于治療肺部疾病（肺燥咳喘、陰虛咳嗽等）的常用藥[3]。余甘子（Phyllanthus emblicaL.）別名橄欖、滇橄欖、油柑子、山油甘、庵摩勒、牛甘子、喉甘子等，為大戟科葉下珠屬植物余甘子的干燥成熟果實[4]，具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳等功效[5-7]，主要用于治療咳嗽、喉痛、口干、血熱血瘀、消化不良等[5]。余甘子系藏族、苗族等民族習用藥材[4,8]。2020年國際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）發布的全球癌癥負擔的最新統計數據顯示，全球肺癌死亡病例約180萬例，居全球癌癥死亡病例的首位[9-10]。我國肺癌的發病率和死亡率也居高不下，2020年中國新發肺癌約82萬例，死亡約71萬例[9]。藏醫學中，早已有以余甘子為主藥的方劑治療肺癌的歷史[11-12]。吉祥草18 g與余甘子9 g配伍，是在邱德文教授分別對兩味藥深入研究并在臨床抗腫瘤應用方面取得成效的基礎上確立的[12]。課題組前期已進行了吉祥草配伍余甘子抗非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer）的藥效學研究[12]。因此本研究將兩種苗族及藏族具有民族特色的治療肺癌的習用藥材配伍在一起，利用方劑配伍原理、膜分離技術有機結合起來，以體外細胞模型作為評價手段，探索兩藥配伍后治療非小細胞肺癌的有效物質，以期為吉祥草配伍余甘子抗腫瘤制劑開發提供實驗依據。

1 材料

1.1 細胞株 Lewis肺癌細胞株（昆明細胞庫，編號：KCB 20781YJ）。

1.2 藥物與試劑 吉祥草：采購于貴州貴陽，經貴州中醫藥大學生藥教研室孫慶文教授鑒定為百合科吉祥草屬植物吉祥草[Reineckia carnea（Andr.）Kunth]。

余甘子：采購于貴州貴陽，經貴州中醫藥大學生藥教研室孫慶文教授鑒定為大戟科葉下珠屬植物余甘子的成熟果實（Phyllanthus emblicaL.）。

康萊特注射液（浙江康萊特藥業有限公司，批號：1706236-1）；DMEM高糖培養基（美國Hyclone公司，批號：SH30021.01B）；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）（美國Hyclone公司，批號：SH30061.01）；雙抗（青鏈霉素混合液）（美國Hyclone公司，批號：SV30064）；四甲基偶氮唑藍（MTT）（美國Solarbio公司，批號：M8180）；二甲基亞砜（DMSO）（美國Amresco公司，批號：0231-500mL）；磷酸鹽緩沖液（美國Solarbio 公司，批號：P1010-2）；胎牛血清（澳大利亞AusGeneX公司，批號：FBS500-S）。

1.3 儀器設備 超濾膜（上海摩速科學器材有限公司，型號：MSC80001，MSC80005，MSC80010，MSC80030）；超濾杯（上海摩速科學器材有限公司，型號：MSC800）；氮氣瓶（山東永安合力特種裝備有限公司，型號：10L）；磁力加熱攪拌器（常州普天儀器制造有限公司，型號：79-1）；板式酶標儀（北京市新風機電技術公司，型號：ZS-2）；8聯排移液器（德國普蘭德有限公司，型號：Transferpette-820-200 μL）；移液器[芬蘭百得實驗室儀器（中國）有限公司，型號：1-ch100 μL]；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司，型號：BHC-1300）；二氧化碳培養箱（日本三洋公司，型號：MCO-175）；奧林巴斯生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號：CKX-41）；25 cm正方透氣蓋斜口細胞培養瓶（美國Corning公司，型號：430639-25 cm）；75 cm正方透氣蓋斜口細胞培養瓶（美國Corning公司，型號：430641-75 cm）；96孔細胞培養板（美國Corning公司，型號：3599）；針頭式濾器（33 mm、0.22 μm PES膜）（美國Millipore公司，型號：SLGP033RB）。

2 方法

2.1 吉祥草配伍余甘子不同組分制備

2.1.1 不同提取方法組分制備 通過鮮藥榨汁、傳統水煎、滲漉等提取方法制得吉祥草配伍余甘子的不同提取物。

水煎液組：稱取干藥材吉祥草36 g，余甘子18 g，即m（吉祥草）∶m（余甘子）=2∶1。按傳統的水煎煮法，加入8倍量的水浸泡30 min，提取2次，每次提取時間1 h，合并兩次提取液，減壓干燥得到提取物，使用時配至所需濃度。

50%乙醇滲漉組：稱取干藥材吉祥草36 g，余甘子18 g，即m（吉祥草）∶m（余甘子）=2∶1。剪碎，50%乙醇潤濕，裝筒，排氣，往滲漉筒加入50%乙醇浸漬12 h后按1 mL/min滲漉速度滲漉，溶劑為藥材質量的15倍，收集滲漉液，減壓干燥得到提取物，使用時配至所需濃度。

95%乙醇滲漉組：稱取干藥材吉祥草36 g，余甘子18 g，即m（吉祥草）∶m（余甘子）=2∶1。剪碎，95%乙醇潤濕，裝筒，排氣，往滲漉筒加入95%乙醇浸漬12 h后按1 mL/min滲漉速度滲漉，溶劑為藥材質量的15倍，收集滲漉液，減壓干燥得到提取物，使用時配至所需濃度。

鮮藥組：稱取新鮮藥材吉祥草36 g，余甘子18 g，即m（吉祥草）∶m（余甘子）=2∶1。剪碎，加定量的水用榨汁機攪拌至碎，壓榨取汁，減壓干燥得到提取物，使用時配至所需濃度。

2.1.2 不同分子量區間段組分制備 按“2.1.1”優選出的最佳提取方法制備組分，并將其減壓濃縮至生藥質量濃度為0.2 g/mL，從超濾杯的加料口加入，通過軟管連接氮氣瓶與超濾杯；將裝好的超濾杯放在磁力攪拌器，打開磁力攪拌器使攪拌轉子以合適的轉速轉動，打開氮氣瓶閥，調整壓力為0.10～0.22 MPa，收集膜分離產物；超濾膜使用順序依次為MWCO 30 KD、MWCO 10 KD、MWCO 5 KD、MWCO 1 KD，得到膜分離產物分子量≥30KD組分、分子量10～30 KD組分（不含10 KD、30 KD）、分子量5～10 KD組分（不含5 KD，含10 KD）、分子量1～5 KD組分（不含1KD，含5KD）、分子量≤1KD組分。不同分子量的膜分離產物用95%乙醇復溶轉移至已恒重的蒸發皿減壓干燥得到不同分子量區間段組分，使用時配至所需濃度。

2.2 接種細胞 取對數生長期的Lewis肺癌細胞株以0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，顯微鏡下計數細胞量，調整至1×105個/mL細胞懸液，接種于96孔細胞培養板上，鋪板過程中需不斷輕搖混懸液使細胞分布均勻。放入37 ℃，5% CO2恒溫培養箱培養，待細胞覆蓋孔底達90%時進行實驗。

2.3 吉祥草配伍余甘子不同組分干預

2.3.1 不同提取方法組分干預 取水煎液組分、50%乙醇滲漉組分、95%乙醇滲漉組分及鮮藥組分用適量的DMSO助溶，之后分別用無血清DMEM培養基按10倍梯度稀釋，DMSO最終含量≤0.1%，用0.22 μm濾器過濾除菌即可用于干預細胞。康萊特注射液（陽性藥）用生理鹽水稀釋15倍后作為母液備用。參考文獻[13]計算，體外實驗藥物質量濃度（μg/mL）=50×D/5 000/50%×103。D為臨床用藥劑量[mg/（kg·d）]。根據預實驗過程中的結果設定始濃度，用無血清DMEM培養基按10倍梯度稀釋。各組設4個濃度，分別將不同提取方法的4種藥物組分及康萊特注射液加入細胞孔板，分別為鮮藥組、水煎液組、50%乙醇滲漉組、95%乙醇滲漉組、康萊特陽性組、0.1% DMSO溶媒劑組、對照組（不含干預藥物，其余步驟一致）、調零孔（不含干預藥物、細胞，其余步驟一致）。每孔100 μL，各組設置3個平行孔，放入37 ℃，5% CO2恒溫培養箱繼續培養24、48 h。

2.3.2 不同分子量區間段組分干預 最佳提取方法組分經膜分離技術得到的不同區間段組分，分子量≥30 KD、分子量10～30 KD、分子量5～10 KD、分子量1～5 KD、分子量≤1 KD，用適量的DMSO助溶，之后分別用無血清DMEM培養基按10倍梯度稀釋，DMSO最終含量≤0.1%，用0.22 μm濾器過濾除菌即可用于干預細胞。康萊特注射液用生理鹽水稀釋15倍后作為母液用，無血清DMEM培養基按10倍梯度稀釋。各組設3個濃度。分別將不同分子量區間段組分及康萊特注射液加入細胞孔板，分別為分子量≥30 KD組、分子量10～30 KD組、分子量5～10 KD組、分子量1～5 KD組、分子量≤1 KD組、康萊特陽性組、對照組（含細胞，不加藥物干預）、調零孔（不含干預藥物、細胞，其余一致）。每孔100 μL，各組設置3個平行孔，放入37 ℃，5% CO2恒溫培養箱繼續培養24 h。

2.4 MTT法呈色及酶標儀檢測 分別于藥物作用24、48 h各取出1批96孔板進行MTT實驗。取出96孔板，棄培養基，每孔加入質量濃度為5 mg/mL的MTT溶液30 μL，避光繼續培養4 h，吸出每孔內上清液，加入DMSO 150 μL，輕輕振蕩至結晶充分溶解，用酶標儀在540 nm波長下測定每孔的吸光度值（A），進行數據整理，實驗重復2次。

2.5 統計學方法 采用SPSS 26.0統計軟件進行數據統計，計量資料以“均數±標準差”（）表示，計量資料符合正態分布且方差齊，采用單因素方差分析進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 不同提取方法組分干預結果 鮮藥組、水煎液組、50%乙醇滲漉組對Lewis肺癌細胞不呈增殖抑制作用。干預24 h，95%乙醇滲漉組3 600.0 μg/mL、360.0 μg/mL、36.0 μg/mL抑制率分別為46.74%、22.35%、10.49%；康萊特陽性組666.700μg/mL、66.670 μg/mL、6.667 μg/mL抑制率分別為47.75%、36.26%、21.40%。干預48 h，95%乙醇滲漉組3 600.0 μg/mL、360.0 μg/mL、36.0 μg/mL抑制率分別為47.54%、21.88%、10.05%；康萊特陽性組666.700 μg/mL、66.670 μg/mL、6.667 μg/mL抑制率分別為52.23%、36.90%、22.28%。干預24 h抑制率與48 h比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表1、圖1～3）

圖1 不同提取方法組分干預24 h 抑制率比較 （，n=6）

圖2 不同提取方法組分干預48 h 抑制率比較 （，n=6）

圖3 95%乙醇滲漉組、康萊特陽性組抑制率曲線圖

表1 不同提取方法的組分OD 值及抑制率比較（，n=6）

表1 不同提取方法的組分OD 值及抑制率比較（，n=6）

注：與對照組比較，aP＜0.01。

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3.2 不同分子量區間段組分干預結果 分子量10～30 KD組：3 600 μg/mL抑制率為24.26%，360 μg/mL抑制率為15.05%；分子量≤1 KD組：3 600 μg/mL抑制率為30.81%，360 μg/mL抑制率為19.95%；康萊特陽性組：666.700 μg/mL抑制率為41.06%，66.670 μg/mL抑制率為19.54%。上述各組OD值與對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（見表2、圖4）

圖4 干預24 h 不同分子量區間段組分抑制率比較（，n=6）

表2 干預24 h 不同分子量區間段組分OD 值及抑制率比較（，n=6）

表2 干預24 h 不同分子量區間段組分OD 值及抑制率比較（，n=6）

注：與對照組比較，aP＜0.01，bP＜0.05。

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分子量≥30 KD組：3 600 μg/mL抑制率為10.12%；分子量5～10KD組：3 600 μg/mL抑制率為10.02%；分子量1～5 KD組：3 600 μg/mL抑制率為10.79%，36 μg/mL抑制率為9.48%；分子量≤1 KD組：36 μg/mL抑制率為8.23%。上述各組OD值與對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（見表2、圖4）

4 討論

吉祥草在苗族地區使用時大多數用鮮品，鮮果嚼服也是余甘子的民間常用用藥形式[4]。本研究參照屠呦呦在研究青蒿素過程中查閱古醫籍的啟示（“青蒿一握，水一升漬，絞取汁服”）及苗族、藏族民間鮮品直接入藥的習慣，結合滲漉提取具有常溫狀態下操作，不容易破壞熱敏性有效成分，能提取完全、節能的優點，在傳統水煎的基礎上同時設計鮮藥榨汁、滲漉法常溫提取藥效成分。不同提取方法組分干預實驗結果表明：鮮藥組、水煎液組、50%乙醇滲漉組對Lewis肺癌細胞不呈增殖抑制作用；95%乙醇滲漉組及康萊特陽性組對Lewis肺癌細胞增殖有抑制作用。這可能預示抑制Lewis肺癌細胞增殖的活性成分極性較小，而鮮藥榨汁、水煎煮及50%乙醇提取的成分極性相對較大。前期對吉祥草配伍余甘子的研究顯示60%、95%乙醇滲漉組分對小鼠非小細胞肺癌有抑制作用，水煎組分無抑制作用[12]。吉祥草的水提組分或水溶性好的成分藥效偏向于止咳、化痰、抗炎[14-16]，而95%乙醇提取組分或在95%乙醇提取組分基礎上用不同溶劑萃取的部位傾向于抗腫瘤的作用[17-24]。余甘子鮮果汁、水提組分以維生素、多糖等極性大的組分為主，含有黃酮類成分和少量的酚酸類成分。其藥效傾向于抗氧化、抗衰老[25]、抗誘導突變[26]、增強免疫力[27]、抗炎[28]。余甘子中的酚酸類成分是其抗腫瘤最主要的活性成分[29-31]。余甘子總酚酸為醇溶性成分，也溶于水，但是95%、70%乙醇組分抑制腫瘤細胞增殖的作用優于水提組分[32]。余甘子中的酚酸類與黃酮類配伍使用，可提高腫瘤抑制率[32-33]。95%乙醇滲漉組及康萊特陽性組的增殖抑制作用呈劑量依賴性，表現為隨著藥物濃度的升高增殖抑制作用增強。本研究結果表明，95%乙醇滲漉組的增殖抑制最低劑量為36 μg/mL，康萊特陽性組的增殖抑制最低劑量為6.667 μg/mL。綜上所述，95%乙醇滲漉組分對Lewis肺癌細胞有明顯增殖抑制作用，優選出提取方法為95%乙醇滲漉法。

本研究根據藥效物質“組合篩選”思路與方法[34]進行了不同分子量區間段組分干預實驗。多種分離技術能最大程度去除無效成分，富集有效成分，并以分離產物為“基本構造單元”研究“基本構造單元”與藥效效應的關系。95%乙醇滲漉組分經不同截留分子量的膜分離得到不同分子量區間段組分，分別為分子量≥30 KD組分、分子量10～30 KD組分、分子量5～10 KD組分、分子量1～5 KD組分、分子量≤1 KD組分。結果表明，各分子量區間段組分對Lewis肺癌細胞呈不同程度增殖抑制作用。分子量≥30 KD組、分子量10～30 KD組、分子量5～10 KD組、分子量1～5 KD組、分子量≤1 KD組最高抑制率分別為10.12%、24.26%、10.02%、10.79%、30.81%；分子量≥30 KD組、分子量5～10 KD組、分子量1～5 KD組增殖抑制最低濃度為3 600 μg/mL；分子量10～30 KD組與分子量≤1 KD組增殖抑制最低濃度分別為360、36 μg/mL；分子量10～30KD組與分子量≤1 KD組的增殖抑制作用呈劑量依賴性，表現為隨著藥物濃度的升高增殖抑制作用增強。黃酮類、生物堿類、皂苷類、蒽醌類、酚酸類等成分是“天然組合化學庫”的主體，其分子量一般小于1 000[35]。綜上所述，分子量10～30 KD組分與分子量≤1 KD組分對Lewis肺癌細胞增殖抑制作用最強；體外細胞模型優選出的最佳分子量區間段組合為分子量10～30 KD與分子量≤1 KD。