地黃飲對特應性皮炎模型小鼠的藥效作用研究*

林 麗，馬雪寧，任宇坤，楊素清，閆景東，安月鵬

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040）

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是臨床常見的一種慢性、瘙癢性、炎癥性皮膚病，亦稱異位性濕疹。其病情遷延纏綿，給患者的生活造成嚴重影響[1]。AD的病因多與遺傳因素、環境因素、免疫因素及皮膚功能障礙相關[2]，現許多學者認為輔助型T細胞1（helper T cell 1，Th1）/輔助型T細胞2（helper T cell 2，Th2）炎癥漂移是其免疫因素中的關鍵機制[3]。臨床上常應用糖皮質激素、免疫抑制劑及生物制劑等對AD進行治療，但存在一定的不良反應且容易復發，在臨床應用中受到一定的限制[4]。中醫學認為AD發病與血熱密不可分，且在血熱的基礎上，又經風邪襲表，入里化熱，成血熱風燥之勢[5]。地黃飲出自《醫宗金鑒》，由生地黃、熟地黃、玄參、當歸、白蒺藜、牡丹皮、紅花、僵蠶、陳皮、甘草組成。全方養血活血，祛風止癢，與AD的病機吻合[6]。本研究采用2，4-二硝基氯苯（2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB）反復刺激的方法誘導AD小鼠模型，觀察地黃飲對模型小鼠的皮損炎癥程度、臟器指數、病理變化、肥大細胞浸潤情況的調控作用，同時檢測血清IgE、Th1型細胞因子IFN-γ及Th2型細胞因子IL-4水平并對其與皮損炎癥程度的相關性進行分析，以探尋地黃飲對AD小鼠的藥效作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SPF級雌性BALB/c小鼠36只，體質量（20±2）g，6周齡，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，動物生產許可證號：SCXK（遼）2020-0001。小鼠飼養環境空氣流動，12 h/12 h明暗交替，溫度（22±2）℃，相對濕度50%～70%，自由飲水進食，食用標準飼料，適應性飼養7 d。本次實驗通過黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院動物倫理委員會批準（批準號：20200911-06）。

1.2 試劑與藥物 地黃飲（方藥組成：制何首烏10 g，生地黃25 g，熟地黃15 g，玄參15 g，當歸15 g，白蒺藜20 g，牡丹皮15 g，紅花5 g，僵蠶15 g，陳皮20 g，甘草10 g），購自黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院草藥局，由王萍主任藥師鑒定藥材為正品。潤燥止癢膠囊（批號：2206032）購自國藥集團同濟堂（貴州）制藥有限公司；石蠟（批號：2203167）購自Leica公司；無水乙醇（批號：B221117-1）購自天津永大化學試劑有限公司；蘇木素伊紅染色試劑盒（批號：081622221111）購自Beyotime公司；甲苯胺藍（批號：20220721）購自Solarbio公司；DNCB（批號：P2067548）購自damas-beta公司；小鼠免疫球蛋白E（IgE）酶聯免疫試劑盒（批號：11/2022-YJ037602）、小鼠白介素-4（IL-4）酶聯免疫試劑盒（批號：11/2022-YJ063156）、小鼠γ 干擾素（IFN-γ）酶聯免疫試劑盒（批號：11/2022-YJ002277）均購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3 儀器 4 ℃冰箱（海爾集團電器有限公司，型號：SC-320D）；-80 ℃冰箱（日本Panasonic公司，型號：MDF-382E）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司，型號：SW-CJ-ZFD）；電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，型號：ME104E）；高壓蒸汽滅菌器（日本Panasonic公司，型號：MLS-3751L-PC）；純水系統（美國Millipore公司，型號：TANKPE0600）；移液槍（德國Eppendorf公司，型號：3120000）；顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號：BX53）；制冰機（常熟雪科電器有限公司，型號：IMS-50）；脫水機[科迪制冷設備（昆山）有限公司，型號：KD-TS3A]；輪轉式切片機（德國Leica公司，型號：HistoCore MULTICUT）；生物組織攤烤烘片機[科迪制冷設備（昆山）有限公司，型號：KD-TI]；冷凍包埋機[科迪制冷設備（昆山）有限公司，型號：KD-BMIII]；恒溫振蕩器（上海一恒科技有限公司，型號：THZ-98AB）；低溫離心機（美國Thermo公司，型號：SORVALL ST8/8R）；酶標儀（美國Thermo公司，型號：Mulitiskan FC）。

1.4 分組及造模 36只小鼠采用隨機數字表法分為空白組、模型組、對照組、地黃飲低劑量組、地黃飲中劑量組、地黃飲高劑量組，每組6只。參考文獻建模方法[7-8]，將小鼠背部3 cm×2 cm區域進行脫毛處理，除空白組外，其余各組第1、4、7天用移液槍向背部涂抹150 μL 1%DNCB溶液進行致敏激發皮損，并于第15、17、19、21、23、25、27天用移液槍向背部涂抹150 μL 0.5% DNCB溶液維持皮損；空白組在相同時間節點、相同位置涂抹等劑量的基質[V（丙酮）：V（橄欖油）=1:4]。實驗共28 d，于第29天取材。若模型組小鼠背部出現水腫剝脫、糜爛滲液或干燥鱗屑，且皮損炎癥程度評分與空白組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），則造模成功。

1.5 藥物制備及給藥 地黃飲每劑藥量為155 g，加入8倍蒸餾水并浸泡40 min，冷凝回流1 h提取藥液并濾出；再加入6倍蒸餾水，冷凝回流40 min提取藥液并濾出。將2次濾液合并混勻，于70～80 ℃恒溫水浴箱中濃縮至1 g/mL，存于4 ℃冰箱中備用。對照組予潤燥止癢膠囊，將3 g潤燥止癢膠囊與5 mL 0.5%CMC-Na共同放入研缽，研磨至不會堵塞灌胃針即可，將溶液轉置于10 mL量瓶后定容搖勻備用。于第15～28天每日09:00:00—10:00:00進行灌胃，1次/d。按照人與大鼠體表面積比例計算大鼠給藥劑量，地黃飲低、中、高劑量組劑量分別為10.08、20.15、40.30 g（/kg·d）（劑量約為體質量70 kg成年人正常用量的0.5、1、2倍）；對照組劑量為780 mg/kg（劑量約為體質量70 kg成年人正常用量的1倍）；空白組、模型組予等體積生理鹽水灌胃，3.42 mL（/kg·d）。

1.6 觀察指標

1.6.1 皮損炎癥程度評分 從第1天起每日拍照記錄小鼠背部皮損變化。參照臨床EASI評分方法，于實驗第7、14、21、28天進行皮損嚴重程度評分，包括紅斑、水腫/丘疹，表皮剝脫/抓痕，鱗屑/干燥4個方面，每項評分按0～3分的4級評分法，分值越大則皮損炎癥程度越高，評分標準見表1。

表1 皮損炎癥程度評分表

1.6.2 臟器指數 第28天給藥后禁食12 h，第29天稱取小鼠體質量，以1%戊巴比妥鈉腹腔注射（50 mg/kg）麻醉小鼠，眼球目內眥取血后處死，摘取脾臟及胸腺，稱量質量，并計算臟器系數。臟器系數=臟器質量/體質量。

1.6.3 皮膚組織病理變化 將各組小鼠受損皮膚組織置于4%多聚甲醛溶液中固定后，制備成4 μm皮損組織石蠟切片，經二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及梯度乙醇脫蠟，蘇木素染色5 min，伊紅染色2 min后梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察組織病理學變化并采集圖像進行分析。

1.6.4 肥大細胞浸潤情況 將各組小鼠受損皮膚組織切片、脫蠟，甲苯胺藍染色5min，蒸餾水沖洗5min，95%乙醇分化2min，分別浸入無水乙醇Ⅰ、Ⅱ及二甲苯Ⅰ、Ⅱ各2 min，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察肥大細胞浸潤情況并采集圖像進行分析統計。

1.6.5 血清IgE、IFN-γ、IL-4水平 采用ELISA法檢測小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4水平，將各組小鼠的血液置于2 mL圓底離心管，在4 ℃、3 000 r/min、離心半徑138 mm的條件下離心10 min分離血清。設置標準品孔和樣本孔，標準孔加不同濃度標準品50 μL，樣本孔先加樣品稀釋液40 μL，再加待測樣品10 μL，每孔加入酶標試劑100 μL（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同），37 ℃溫育60 min，洗滌，每孔先后加入顯色劑A、B各50 μL，37 ℃避光顯色15 min，加終止液50 μL終止反應，450 nm波長依序測量各孔OD值。繪制標準曲線并計算IgE、IFN-γ、IL-4含量。

1.7 相關性分析 分別將血清IgE、IFN-γ、IL-4與皮損炎癥程度評分進行雙變量回歸分析，計算出相應的回歸曲線方程和相關系數（r），探討其與皮損之間的相關性。

1.8 統計學方法 通過SPSS 26.0及GraphPad Prism 8.0.2軟件進行處理，計量資料以“均數±標準差”（）表示。應用單因素方差分析進行組間比較，LSD-t檢驗進行兩兩比較，重復測量計量資料采用重復測量資料的方差分析，雙變量線性回歸分析進行相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠皮損炎癥程度評分比較 所有小鼠不同時間皮損炎癥程度評分比較，差異有統計學意義（P＜0.01），即存在時間效應。各組小鼠皮損炎癥程度評分總體比較，差異有統計學意義（P＜0.01），即存在分組效應。空白組小鼠背部未出現皮損，整體狀態良好；模型組小鼠背部出現水腫剝脫及糜爛滲液，部分可見干燥鱗屑及苔蘚樣變，與AD典型表現相符，皮損炎癥程度評分高于空白組（P＜0.05），說明DNCB能夠有效誘導AD，造模成功。經治療后，與模型組比較，其余各組皮損均呈不同程度改善。第21、28天，對照組及地黃飲低、中、高劑量組小鼠皮損炎癥程度評分均低于模型組（P＜0.01或P＜0.05）；地黃飲中、高劑量組皮損炎癥程度評分低于對照組（P＜0.05）。時間因素與分組因素存在交互效應（P＜0.01），即各組小鼠皮損炎癥程度評分降低幅度不一致。（見表2，圖1～2）

圖1 各組小鼠皮損圖

圖2 皮損炎癥程度評分交互效應輪廓圖

表2 各組小鼠皮損炎癥程度評分比較 （，分）

表2 各組小鼠皮損炎癥程度評分比較 （，分）

注：F時間主效應=9.501，P時間主效應=0.000；F分組主效應=34.486；P分組主效應=0.000；F交互效應=3.767；P交互效應=0.000；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與對照組比較，dP＜0.05。

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2.2 各組小鼠臟器指數比較 模型組小鼠脾臟指數高于空白組（P＜0.05）；對照組及地黃飲中、高劑量組胸腺指數低于模型組（P＜0.01）；對照組及地黃飲低、中、高劑量組脾臟指數均低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）；地黃飲高劑量組脾臟指數低于對照組及地黃飲低、中劑量組（P＜0.01）。（見表3）

表3 各組小鼠臟器指數比較 （，mg/g）

表3 各組小鼠臟器指數比較 （，mg/g）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與對照組比較，dP＜0.05。

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2.3 皮膚組織病理變化 空白組小鼠皮膚表皮較薄，表皮與真皮交界清晰，無水腫及淋巴細胞浸潤；模型組小鼠表皮較厚，角質層存在角化過度或不全，棘層肥厚、水腫，真皮層較厚且伴有大量炎癥細胞浸潤，提示造模成功；對照組及地黃飲低、中、高劑量組表皮及真皮輕度肥厚，存在少量炎癥細胞浸潤。（見圖3）

圖3 各組小鼠皮膚組織形態 （HE，×200）

2.4 肥大細胞浸潤情況 空白組小鼠皮膚真皮層中可見零星肥大細胞；模型組小鼠皮損部位真皮層肥大細胞數量高于空白組（P＜0.05），部分呈脫顆粒狀態；對照組及地黃飲低、中、高劑量組肥大細胞浸潤程度較低，肥大細胞數量低于模型組（P＜0.01）。（見表4，圖4）

圖4 各組小鼠皮膚真皮層中肥大細胞浸潤情況（免疫組化，×200）

表4 各組小鼠皮膚組織中肥大細胞數目比較 （，個）

表4 各組小鼠皮膚組織中肥大細胞數目比較 （，個）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.01；與對照組比較，cP＜0.05。

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2.5 各組小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4水平比較 模型組小鼠血清IgE、IL-4水平高于空白組（P＜0.05），血清IFN-γ水平低于空白組（P＜0.05）；對照組與地黃飲低、中、高劑量組小鼠血清IgE、IL-4水平均低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），血清IFN-γ水平均高于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。（見表5）

表5 各組小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4 水平比較 （）

表5 各組小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4 水平比較 （）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與對照組比較，dP＜0.05。

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2.6 相關性分析 通過對治療后模型組、對照組及地黃飲低、中、高劑量組小鼠血清中IgE、IFN-γ、IL-4水平與各組小鼠皮損炎癥程度評分進行雙變量回歸分析，求得直線回歸方程：Y=0.981bX+12.521（r=0.552，P＜0.05）；Y=-61.337bX+1214.837（r=-0.568，P＜0.05）；Y=7.865bX+204.306（r=0.558，P＜0.05），差異有統計學意義。（見圖5）

圖5 血清IgE、IFN-γ、IL-4 含量與小鼠皮損炎癥程度評分相關性分析散點圖與直線擬合

3 討論

AD是一種全身炎癥性疾病，常在兒童期初發，可持續至成年，嚴重影響患者的生活質量[9-10]。現代醫學認為該病與機體免疫功能、遺傳基因和皮膚屏障等因素相關，但具體發病機制尚不明確[11]。目前西醫治療特應性皮炎多采用糖皮質激素、抗組胺藥、鈣調磷酸酶抑制劑、光療和生物制劑等手段[1]，雖可以取得確切治療效果，但其療效持續時間較短，易產生藥物依賴現象，停藥后易反彈，且費用較高，導致患者接受度有限。中醫藥治療AD可顯著減輕皮損與瘙癢程度，減少遷延，在緩解癥狀及降低復發率方面具有一定的優勢。

中醫藥治療AD經歷了長期的臨床實踐。《醫宗金鑒·外科心法要訣》記載：“血風瘡證生遍身，粟形搔癢脂水淫，肝肺脾經風濕熱，久郁燥癢抓血津。”“此證由肝、脾二經濕熱，外受風邪，襲于皮膚，郁于肺經，致遍身生瘡。形如粟米，瘙癢無度，抓破時，津脂水浸淫成片。”風濕熱邪侵襲肝、脾、肺經，郁久化風，內外風邪共盛，耗血生火，灼燒陰津，瘙癢難耐，而致本病遷延難愈。本病患者內受濕熱之邪，外感風邪，為本虛標實之證，與機體脾氣不盛，正氣不足相關[12]。故中醫學認為AD患者平素稟賦不耐，脾土運化不利，濕熱內生，又外感風邪，入里化熱，而成血熱風燥之勢，治宜涼血活血，搜風止癢[13-14]。地黃飲出自《醫宗金鑒》。方中生地黃、熟地黃滋陰養血為君藥。熟地黃偏補血，生地黃偏涼血，兩者同用補而不燥[15-16]。何首烏生于春氣，為風木之化而通肝經，生用重補益，制用重養血，臨床實際應用時因其存在肝腎毒性，可酌情去之[17]。三者共為君藥。當歸補血活血，紅花活血調經，兩者助熟地黃養血活血之力。玄參濡潤，既能滋陰，又能降浮火，與熟地黃相合攻補兼施。當歸、紅花、玄參共為臣藥。僵蠶、白蒺藜祛風止癢平肝，牡丹皮清熱涼血，陳皮順氣燥濕，共為佐藥。甘草為使藥，起調和之用。全方涼血活血，疏風止癢，補而不燥，涼潤以滋養一身之肌表，攻補兼施，調理脾氣，標本同治。藥理學研究表明，生地黃、熟地黃、何首烏均具有調控免疫系統作用。目前，地黃飲已廣泛應用于特應性皮炎的臨床治療，臨床療效佳，但其治療AD的作用機制研究較為少見。基于此，本研究擬制備AD小鼠模型，以地黃飲進行干預，探討地黃飲治療AD的效果，并基于Th1/Th2免疫失衡機制進一步探索其可能作用機制。

免疫失衡為AD發生發展過程中最為重要的病理環節，尤以Th1/Th2失衡為主。兩者失去動態平衡并向以Th2型細胞為主的免疫環境傾斜[18-19]。Th2型細胞能夠產生大量IgE及IL-4等炎癥細胞因子[20-21]，IL-4亦可間接活化肥大細胞[22]。活化的肥大細胞可產生一系列炎癥因子，與B淋巴細胞、T細胞等相互作用，進一步引起炎癥級聯反應[23-24]。同時，大量分泌的Th2型細胞因子與以IFN-γ為主的Th1型細胞因子形成拮抗[25]。此外，經上述反應后，效應T細胞在外周血中呈高表達狀態，可誘導Th1型細胞凋亡并使Th2型細胞含量上升[26-27]。因此，抑制Th2型細胞因子表達、調控肥大細胞活化、減輕炎癥反應在抑制AD的發生發展中至關重要。本研究結果顯示，在DNCB的刺激下，小鼠真皮層增厚并伴大量炎癥細胞浸潤，皮損炎癥程度評分升高，肥大細胞數量增加，脾臟指數上升，小鼠血清IgE、Th2型細胞因子IL-4水平上升，Th1型細胞因子IFN-γ水平下降，說明DNCB能夠加速肥大細胞脫顆粒進程，促進其活化，并同時對Th1/Th2炎癥平衡造成影響。結果顯示，地黃飲可改善小鼠皮膚組織炎炎癥細胞浸潤情況，降低皮損炎癥程度評分，減少肥大細胞數量，降低小鼠血清IgE、IL-4水平而升高IFN-γ水平，說明地黃飲能夠減輕肥大細胞活化，并可能通過影響脾臟功能而降低淋巴細胞的募集，促進傾斜于Th2型細胞的免疫環境回正，改善炎癥反應。且地黃飲高劑量組的效果較優。同時，血清IgE、IL-4與小鼠皮損炎癥程度評分呈正相關關系，IFN-γ與小鼠皮損炎癥程度評分呈負相關關系，亦證明地黃飲可能通過調控Th1/Th2免疫平衡環境而對AD起到治療作用。

綜上所述，地黃飲能夠明顯減輕AD小鼠的皮膚炎癥細胞浸潤，改善皮膚病理情況，降低淋巴細胞募集、B細胞的產生及肥大細胞活化，降低血清IgE水平并調控炎癥環境。地黃飲可能通過減少肥大細胞浸潤，使免疫環境向Th2型細胞偏移的程度降低，減少Th2型炎癥因子分泌而對AD起到治療作用。