益氣活血方對急性心肌梗死大鼠交感神經重構的影響*

杜天慧，郭書文，張宇沁，王 惠，陳 潔，李宇飛，張云舒，李欣怡，盧 洋

（1.北京中醫藥大學中醫學院，北京 102400；2.北京中醫藥大學房山醫院，北京 102400；3.北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京 102400；4.北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 100020）

心肌梗死是最嚴重的心血管疾病之一，嚴重危害人類健康和生存質量。心肌梗死后心臟交感神經會發生形態學和功能學的不均一性重構，進一步加重心肌損傷，極易誘發惡性心律失常甚至心源性猝死[1]。因此減輕心肌梗死后交感神經重構，以降低各種惡性心律失常事件，成為學者們關注的熱點和難點。一方面，心肌梗死后急性期內梗死邊緣區交感神經過度再生，分布呈不均一性改變；另一方面交感神經過度興奮及支配不對稱性將進一步導致高支配區與正常區域和去支配區域形成神經肽等神經遞質的濃度差異，極易誘發心律失常[2]。急性心肌梗死發生后，神經營養因子在心肌局部或心臟循環中表達增加，在神經重構中發揮重要作用，尤以梗死邊緣區明顯[3]。心肌梗死后交感神經系統被激活，釋放大量的神經肽Y（neuropeptide Y, NPY），可強烈收縮冠狀動脈，增強交感神經重構，同時血小板聚集會加重心肌缺血，誘發心律失常[4]。酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase, TH）陽性表達可反映交感神經再生情況。多項研究表明，生長相關蛋白43（growth associated protein-43, GAP43）和神經生長因子（nerve growth factor, NGF）可促進神經元的增殖分化，NGF濃度和神經再生密度呈正相關[5]。神經抑制因子信號素3A（semaphorin 3A, Sema-3A）可通過引起神經元生長錐塌陷，發揮避免神經過度生長和神經纖維在局部聚集的作用[6]。

益氣活血方是郭書文教授的經驗用方，由李東垣《內外傷辨惑論》當歸補血湯加減化裁而來，具有補氣生血、益氣活血之效。方中益氣藥劑量高于活血藥。臨床中益氣活血方與西藥聯合應用，可明顯改善心肌缺血患者心肌供血、左心功能及相應臨床癥狀[7]。

急性心肌梗死發生后心臟神經的改變于早期即可出現。本研究從神經重構入手，觀察急性心肌梗死后早期益氣活血方對心臟神經的影響作用，旨在為益氣活血方減輕心肌梗死損傷提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級健康雄性SD大鼠92只，體質量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK（京）2020-0033。大鼠飼養于北京中醫藥大學SPF級動物房，自由攝食飲水，依晝夜節律12 h光照/12 h黑暗，室溫24～26 ℃，相對濕度40%～70%。本實驗通過倫理審查，編號：BUCM-4-2021110806-4070。

1.2 藥物制備 益氣活血方（專利號：201610368030.7）組成：黃芪50 g，當歸15 g，生曬參10 g，川芎15 g，三七6 g。中藥購于北京中醫藥大學東直門醫院，經付鵬（中藥學專業，副主任藥師）鑒定審查。根據課題組前期研究[8]藥物劑量比和煎煮方法制備。煎煮后過濾，濃縮，分裝，滅菌后備用。

酒石酸美托洛爾片（阿斯利康制藥有限公司，25 mg/片，批號：1805A23）。

1.3 主要儀器與試劑 小動物呼吸機（成都泰盟軟件有限公司，型號：HW-101E）；高分辨小動物超聲影像儀（加拿大Vusual Sonics公司，型號：Vevo2100）；制冰機（日本SANYO公司，型號：SIM-00083）；石蠟冷凍包埋機（中國金華科迪公司，型號：KD-BM）；復式脫色搖床（海口市其林貝爾儀器制造有限公司）；全波長熒光酶標儀（瑞士Tecan公司，型號：Safire2）；精密電子天平（德國Sartorius公司，型號：BAS223S）；蛋白質電泳系統（北京市六一儀器廠）。4%多聚甲醛固定液（賽維爾公司，批號：G1101-500ML）；戊巴比妥鈉（上海曦耀生物科技有限公司，批號：Y2019012102）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號：F6032104）；NGF抗體（批號：ab52918）、GAP43抗體（批號：ab75810）、Sema-3A抗體（批號：ab23393）、TH抗體（批號：ab112）、Actin內參抗體（批號：ab8226）均購自美國Abcam公司；標記山羊抗小鼠辣根過氧化物酶（批號：Sc-2005）、標記山羊抗兔辣根過氧化物酶（批號：Sc-2004）均購自美國Santa Cruz公司；PVDF膜（德國Millipore公司，批號：03010040001）；ECL發光液（賽默飛公司，批號：34080）；大鼠神經肽Y酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特公司，批號：E-EL-R0655c）。

1.4 模型建立 92只大鼠隨機選取20只作為假手術組，余72只行左冠狀動脈前降支結扎術。1%戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉后固定大鼠，備皮。氣管插管成功后連接小動物呼吸機。在嚴格無菌條件下行左冠狀動脈前降支結扎術。于左側第三、四肋間逐層橫向剪開皮膚和肌肉，鈍性分離心包膜，以合適視野充分暴露心臟，于左心耳與肺動脈圓錐間下2 mm進針結扎前降支，結扎完畢后迅速逐層縫合，撤掉呼吸機后密切關注大鼠是否恢復節律性自主呼吸，同時注意保暖復溫。術后每只大鼠立即注射利多卡因0.1 mL防止心律失常，呋塞米0.1mL減輕心臟負荷，連續3 d注射青霉素（20萬U/d）預防感染。術后心電圖顯示3個連續壞死性q波提示造模成功。假手術組造模過程同上，僅穿線不結扎。60只大鼠造模成功，成功率83.33%（60/72）。

1.5 動物分組及給藥 將60只造模成功大鼠隨機分為模型組、益氣活血方組、美托洛爾組，各20只。每組兩個觀察時間點各10只。手術后24 h起每日在同時間段內各組大鼠灌胃1次，連續給藥7 d。中藥依據臨床等效生藥劑量按大鼠和人6∶1換算。成人體質量70 kg每日生藥量為96 g。96 g/70 kg×6=8.2 g/（kg·d）。給藥劑量為：美托洛爾組0.5 mg/（kg·d），益氣活血方組8.2 g/（kg·d）[9]，假手術組和模型組給予等體積蒸餾水，1.0 mL/（kg·d）。

1.6 觀察指標

1.6.1 心功能 給藥后3、7 d，1%戊巴比妥鈉腹腔注射（40mg/kg）麻醉后固定大鼠，備皮,超聲高頻探頭RMV716取左心室短軸切面，通過M型曲線進行超聲檢查。每只取3個心動周期，計算平均值：左心室短軸率（left ventricular fractional shortening,LVFS）、左心室射血分數（left ventricular ejection fraction,LVEF）、左心室收縮末期內徑（left ventricular internal dimension systole, LVIDs）和左心室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter, LVIDd）均值。

1.6.2 室顫閾值 給藥后3、7 d，大鼠麻醉后固定，備皮，氣管插管，無菌條件下開胸充分暴露心臟，連接電極后將刺激電極的正極插于左心室心尖部組織，負極插入左室前壁右側，接近梗死區位置，正負極距離約0.3 cm，電極插入組織深度約0.1 cm。將電刺激條件設定為：方波、串刺激（每串刺激10個刺激波，脈寬ms），初始電壓1 V，每隔30 s遞增1 V，刺激頻率30 Hz[10]。記錄室顫閾值。

1.6.3 心肌病理變化 心肌取材時間點為給藥后3、7 d。取材前禁食12h，1%戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉。取腹主動脈血，于嚴格無菌條件下取出心臟，置于冷生理鹽水中充分洗去殘留血液，于冰上將組織橫切為上下兩個部分。上半部固定后用于石蠟包埋、切片、染色；下半部剪取梗死邊緣區后迅速浸入液氮保存，用于蛋白檢測。上半部組織固定24 h后包埋、切片。將切片脫蠟復水，Harris蘇木素染核，流水沖洗，梯度乙醇脫水；1%乙醇伊紅染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，使用顯微鏡觀察拍照。

1.6.4 TH陽性交感神經纖維分布 采用免疫組化觀察TH陽性交感神經纖維分布情況。石蠟切片脫蠟至水后滴加內源性過氧化物酶阻斷液，室溫孵育20 min，PBS緩沖液水洗3次，5 min/次，置于EDTA抗原修復緩沖液中，蒸鍋內進行抗原修復8 min。冷卻至室溫后劃圈，滴加血清封閉37 ℃，30 min后甩去多余血清后加入一抗，將切片平放于濕盒內4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，5 min/次，加入二抗室溫孵育1 h。PBS洗滌3次，5 min/次，滴加DAB液顯色，顯微鏡下觀察控制顯色時間后置于蒸餾水終止反應，水洗后烘干。蘇木素復染40 s，水洗，返藍液浸泡1 min，再水洗。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，掃描。

1.6.5 大鼠血漿NPY含量 采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測大鼠血漿NPY含量，觀察心臟交感神經被激活情況。根據試劑盒說明測定OD值檢測血漿NPY含量。

1.6.6 神經重構相關因子的蛋白表達 采用免疫印跡法（Western blotting）檢測大鼠梗死心肌邊緣區NGF、GAP43、Sema-3A、TH蛋白相對表達量。提取樣品蛋白，BCA試劑盒測定樣品濃度后調整各組蛋白為同等濃度，加入上樣緩沖液后煮沸5 min使蛋白變性。分別制作分離膠和濃縮膠，蛋白上樣，電泳，濃縮膠恒壓100 V 20 min，分離膠恒壓120 V，電泳直至溴酚藍到凝膠底部后電轉，將凝膠上蛋白表達轉膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，恒流200 mA，時間為2 h，轉膜后將PVDF膜在封閉液中封閉60 min，加入1∶500稀釋后的一抗，4 ℃孵育過夜。回收一抗后TBST洗膜3次，10 min/次，室溫下加入對應二抗，搖床孵育60 min，TBST洗膜5次，5 min/次，最后滴加ECL顯色液，曝光。運用Image-J軟件定量蛋白條帶灰度，分析得到蛋白相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件分析數據，計量資料用“均數±標準差”（）表示。經檢驗所有資料符合正態分布，進行方差齊性檢驗。若方差齊，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD分析，若方差不齊，采用蓋姆斯-霍威爾（Games-Howell）分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心功能比較 給藥3、7d，模型組大鼠LVEF、LVFS均低于假手術組，LVIDd、LVIDs均高于假手術組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。給藥3 d，益氣活血方組、美托洛爾組大鼠LVEF、LVFS、LVIDd與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；益氣活血方組大鼠LVIDs低于模型組（P＜0.05）。給藥7 d，益氣活血方組和美托洛爾組大鼠LVEF、LVFS均高于模型組（P＜0.05或P＜0.01），LVIDs均低于模型組（P＜0.05)；益氣活血方組和美托洛爾組大鼠LVIDd與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。美托洛爾組整體療效優于益氣活血方組，但個體差異較大，美托洛爾組大鼠給藥7 d后的LVIDs低于給藥3 d（P＜0.05）；益氣活血方組個體差異較小療效更加穩定。（見表1）

表1 各組大鼠心功能比較 （）

表1 各組大鼠心功能比較 （）

注：與假手術比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與給藥3 d比較，dP＜0.05。

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2.2 各組大鼠電刺激誘發室顫閾值比較 給藥3、7 d，模型組大鼠電刺激誘發室顫閾值低于假手術組（P＜0.01或P＜0.05）；給藥3 d，益氣活血方組、美托洛爾組大鼠電刺激誘發室顫閾值與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。給藥7 d，美托洛爾組大鼠電刺激誘發室顫閾值高于模型組（P＜0.01）；益氣活血方組大鼠電刺激誘發室顫閾值與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。美托洛爾組大鼠給藥7 d后電刺激誘發室顫閾值高于給藥3 d（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠電刺激誘發室顫閾值比較 （，V）

表2 各組大鼠電刺激誘發室顫閾值比較 （，V）

注：與假手術比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.01；與給藥3 d比較，dP＜0.05。

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2.3 心肌病理變化 假手術組大鼠心肌細胞排列整齊無明顯改變，僅見少量炎癥細胞；模型組大鼠心肌細胞斷裂且排列紊亂，細胞形態不規則，細胞核發生固縮，間隙明顯變大，心肌纖維雜亂無序，且明顯存在大量炎癥細胞浸潤。給藥3 d后，益氣活血方組和美托洛爾組大鼠心肌細胞結構紊亂，部分壞死，但細胞間間隙減小，炎癥纖維減少。給藥7 d后，益氣活血方組大鼠較模型組改善明顯，炎癥細胞浸潤明顯減少，心肌細胞排列較為整齊；美托洛爾組大鼠心肌細胞排列有明顯整齊改變，但仍可見炎癥細胞浸潤和心肌纖維增生。（見圖1）

圖1 心肌組織病理改變 （HE，×50，標尺=200 μm）

2.4 TH陽性交感神經纖維分布 假手術組大鼠心肌細胞走行方向一致，TH陽性神經纖維少見。模型組大鼠TH陽性神經纖維密度明顯增加，分布紊亂，形態粗大不一，甚者聚集呈束。給藥3 d，益氣活血方組、美托洛爾組大鼠TH陽性神經纖維密度低于模型組，且形態分布逐漸向正常改變，但仍可見大量炎癥細胞；給藥7 d，益氣活血方組、美托洛爾組大鼠神經形態及分布趨于正常化，聚集及粗大的神經纖維較少見。益氣活血方組大鼠TH陽性神經纖維少于美托洛爾組，心肌細胞走行更均勻一致。（見圖2）

圖2 TH 陽性交感神經纖維分布 （免疫組化，×100，標尺=100 μm）

2.5 各組大鼠血漿NPY含量比較 給藥3、7 d，模型組大鼠血漿NPY含量高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.01）；益氣活血方組大鼠血漿NPY含量與美托洛爾組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。給藥3 d，益氣活血方組、美托洛爾組大鼠血漿NPY含量與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。給藥7 d，益氣活血方組、美托洛爾組大鼠血漿NPY含量均低于模型組（P＜0.01）。益氣活血方組、美托洛爾組大鼠給藥7 d后的血漿NPY含量均低于給藥3 d（P＜0.01）。（見表3）

表3 各組大鼠血漿NPY 含量比較 （，pg/mL）

表3 各組大鼠血漿NPY 含量比較 （，pg/mL）

注：與假手術比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與給藥3 d比較，cP＜0.01。

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2.6 各組大鼠梗死心肌邊緣區NGF、GAP43、Sema-3A、TH蛋白相對表達量比較 給藥3、7 d，模型組大鼠NGF、GAP43、TH蛋白相對表達量均高于假手術組，Sema-3A蛋白相對表達量低于假手術組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；益氣活血方組、美托洛爾組大鼠NGF、GAP43、TH蛋白相對表達量均低于模型組，Sema-3A蛋白相對表達量均高于模型組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。給藥3 d，益氣活血方組大鼠NGF蛋白相對表達量高于美托洛爾組（P＜0.05）。給藥7 d，益氣活血方組大鼠TH蛋白相對表達量高于美托洛爾組（P＜0.05）；益氣活血方組大鼠其余指標與美托洛爾組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。各組大鼠給藥7 d各指標與給藥3 d比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表4、圖3）

圖3 NGF、GAP43、Sema-3A、TH 蛋白表達Western blotting 圖

表4 各組大鼠梗死心肌邊緣區NGF、GAP43、Sema-3A、TH 蛋白相對表達量比較 （）

表4 各組大鼠梗死心肌邊緣區NGF、GAP43、Sema-3A、TH 蛋白相對表達量比較 （）

注：與假手術比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與美托洛爾組比較，cP＜0.05；與給藥3 d比較，dP＞0.05。

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3 討論

心肌梗死屬中醫“胸痹”“心痛”范疇中的“真心痛”。張仲景在《金匱要略》中首次提出其病機為“陽微陰弦”。心主血脈，心脈痹阻不通則見心煩胸痛、脈急善恐等癥。血脈運行賴心陽推動。心陽不足，鼓動無力，則見氣滯血瘀，血脈不通。益氣活血方是郭書文教授治療心肌梗死的經驗用方，臨床應用收效顯著。方中黃芪、人參益氣固本；當歸、川芎、三七行氣活血，促進氣血的動態平衡和相互滋養。課題組前期研究[11-14]發現，益氣活血方可有效恢復心肌梗死后大鼠的冠脈微循環障礙，減輕心肌梗死后炎癥和氧化應激，抑制心肌細胞凋亡和壞死，改善左心室功能，降低心肌梗死后心衰、心律失常發生率。本研究擬通過觀察心肌梗死后交感神經重構具體情況，探究益氣活血方降低心律失常的作用機制。

心肌梗死后同區域交感神經損傷、壞死、重構及過度再生，會導致神經對心肌活動支配不均一，極易引起心臟電傳導紊亂，是導致心律失常重要機制之一[15]。機體損傷后首先會發生自我修復反應，即心肌梗死后早期出現交感神經適度再生。但隨著疾病進展，神經過度再生常常刺激交感神經系統激活，是造成心源性猝死和惡性心律失常的主要因素之一。研究發現中藥復方可通過調節神經內分泌過度激活，延緩心肌細胞凋亡[16]。

本實驗發現使用益氣活血方和美托洛爾干預急性心肌梗死大鼠3 d后，LVIDd有回縮趨勢，心功能一定程度恢復；干預7 d后，心功能明顯恢復，室顫閾值明顯升高，心肌細胞恢復良好。從時間跨度上看，益氣活血方組療效變化大于美托洛爾組，且療效均一性良好，個體差異小于美托洛爾組。以上結果表明急性期（3 d）美托洛爾對于心肌梗死后恢復具有較好優勢。美托洛爾可有效降低心律失常，阻斷或延緩心肌重塑[17]。中藥的多靶點綜合治療作用持久，恢復心功能、降低心律失常發生率的療效更明顯[18]。

心肌梗死后早期即可出現神經重構。有研究[19]指出，心肌梗死大鼠再生的神經纖維大多呈TH陽性，表明再生神經以成熟的交感神經為主，且心肌組織中TH陽性交感纖維的分布和密度可反映神經重構狀態。本研究結果表明，心肌梗死后梗死邊緣區TH陽性神經纖維密度明顯增加且分布不規則，神經纖維形態變形粗大。經藥物治療后，TH陽性神經分布和密度均減少，形態走行趨于規律正常。其中，給藥7 d后，益氣活血方組陽性神經纖維明顯少見，心肌細胞走行均勻一致，表明益氣活血方在心肌梗死早期可有效抑制交感神經重構。

心臟受多種肽能神經支配[20]，益氣活血方可能通過有效抑制去甲腎上腺素釋放發揮心肌保護作用[21]。本研究中NPY作為一種非腎上腺素能、非膽堿能神經遞質，在心肌梗死后能夠很好地反映交感神經活性及交感神經遞質釋放的動態變化[22]。給藥7 d后，益氣活血方和美托洛爾可有效抑制NPY的釋放，且給藥3 d時益氣活血方組療效比美托洛爾更明顯。NGF可促進機體神經元生長、增殖和分化，該水平與神經生成呈正相關[23]。GAP43在成熟或穩定神經元中以不表達或低表達方式存在，但在神經系統發育或再生時期GAP43與NGF可迅速增高，標志著相關神經快速生長[24-25]。在部分神經系統發育中，Sema-3A是協助改善交感神經重構的相關因子。其通過抑制交感神經再生從而防止神經發生過度發育與支配[26]，在心肌梗死后發揮維持心臟自主神經平衡的重要作用。心肌梗死急性期即可發生神經重構，而早期益氣活血方療效與美托洛爾相當，兩者均可以下調GAP43、NGF、TH表達，上調Sema-3A表達，尤以給藥7 d后效果更為明顯，提示益氣活血方在心肌梗死急性期可能通過調節神經因子表達水平有效改善交感神經重構狀態。

綜上所述，益氣活血方可能通過抑制心肌梗死急性期交感神經系統激活，進而抑制NPY分泌，下調神經因子水平，降低室顫閾值。本研究結果表明，早期美托洛爾療效更佳但個體差異明顯，益氣活血方早期可發揮療效且均一性良好，提示臨床上在急性期可進行盡早干預，中西藥聯合使用，抑制交感神經重構，降低惡性心律失常發病率。