胃癌組織中lncRNA CHRF、miR-489的表達變化及意義

鄧小婧，辜正策，李璐池，劉欣，楊炎鑫

眉山市中醫醫院病理科，四川眉山 620032

胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率均位于惡性腫瘤前列［1］。目前胃癌的治療方法主要包括手術治療、放化療及靶向治療等，早期胃癌患者經治療后預后良好，但由于胃癌常隱匿發病，早期臨床癥狀及體征不具備特異性，多數患者確診時已經是中晚期，治療后預后較差［2-3］。研究胃癌發生發展的分子生物學機制對于胃癌的診斷及治療具有重要意義。長鏈非編碼核糖核酸（lncRNA）是一種非蛋白編碼核糖核酸（RNA），已有多種lncRNA 被證實與胃癌細胞的增殖、轉移有關［4-5］，但關于lncRNA CHRF 與胃癌關系的研究較少。微小RNA（miRNA）存在于大多數生物中，其通過調控靶基因實現對腫瘤的調控，與腫瘤的發生與發展密切相關。miR-489 是miRNA 家族成員之一，已被證實與乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌等惡性腫瘤的發生有關［6-8］。研究表明，腫瘤相關成纖維細胞外泌體miR-489可通過靶向抑制Twist1表達，參與胃癌的病理變化過程［9］。上皮間質轉化（EMT）是指上皮細胞在一定因素的作用下由上皮表型向間質表型轉化的生物學過程，與胃癌的發生及病理進展相關［10］。本研究觀察了胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489 的表達變化，并探討其與患者病情嚴重程度、EMT 及預后的關系，為胃癌的臨床診治及預后判斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標準：①符合胃癌的臨床診斷標準［11］，并經病理學檢查確診；②入組前未接受任何抗腫瘤治療；③符合根治性手術適應證［12］；④臨床病理資料完整；⑤無精神性疾病。排除標準：①合并心、肝、肺、腎等重要臟器功能不全；②合并其他惡性腫瘤；③合并嚴重感染、免疫系統疾病；④合并脾功能亢進、高尿酸血癥。選擇2018 年1 月—2020 年1月在眉山市中醫醫院進行根治手術治療的胃癌患者63 例，男41 例、女22 例，年齡（51.48 ± 8.84）歲。本研究通過我院倫理委員會批準（倫審2017 第0631號），患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 胃癌及癌旁組織lncRNA CHRF、miR-489 檢測 采用實時熒光定量PCR 法。術中收集患者的胃癌組織和癌旁組織樣本，癌旁組織樣本采集區域需距腫瘤組織邊緣≥5 cm；組織樣本采集后分成兩份，一份即刻置于液氮中快速冷凍，-80 ℃保存；另一份經4%中性甲醛固定，石蠟包埋后4 μm 厚度連續切片。取冷凍后的胃癌及癌旁組織，TRIzol 試劑盒提取總RNA，逆轉錄獲取cDNA。采用2720 型熱循環PCR 系統和SYBR Green Mix 試劑盒進行PCR反應，2-ΔΔCt法計算lncRNA CHRF、miR-489相對表達量。

1.3 胃癌及癌旁組織EMT 相關蛋白檢測 采用Western blotting 法。取胃癌及癌旁組織切片，進行常規脫蠟、水化處理，置于0.01 mol/L、95 ℃的枸櫞酸緩沖液中浸泡并進行熱修復。加入RIPA buffer裂解液充分裂解后提取總蛋白，采用BCA 法定量蛋白，取20 μg 總蛋白進行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電轉移至聚偏氟乙烯膜。加入5%脫脂奶粉封閉60 min，依次加入鼠抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentine）、鋅指蛋白轉錄因子（Snail）一抗及二抗，溫室孵育。以GAPDH 為內參，增強型化學發光試劑發光后采用Image-Pro Plus 軟件分析目的條帶灰度值，計算E-cadherin、Vimentine、Snail蛋白相對表達量。

1.4 預后評價 患者出院后定期門診復查和電話隨訪，隨訪時間截至2023年1月，隨訪終止事件為患者死亡或隨訪到期，記錄患者的3年生存率。

1.5 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。計量資料采用S-W 正態性檢驗，呈正態分布以表示，結果比較采用t檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態分布以M（P25，P75）表示，結果比較采用秩和檢驗。胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489與E-cadherin、Vimentine、Snail的關系采用Pearson相關分析法。根據lncRNA CHRF、miR-489 的平均值將患者分為lncRNA CHRF 高表達和低表達者、miR-489 高表達和低表達者，繪制其Kaplan-Meier 生存曲線，并比較其3 年生存率。以胃癌患者的預后（賦值：1 = 死亡，0 = 生存，t = 生存期）為因變量，以患者臨床特征為自變量，進行單因素及多因素COX回歸模型分析；因本研究的樣本量較少會影響多因素分析，特采取以下兩種措施：一是對所有自變量指標進行降維處理（連續變量均按總均值轉化成兩分類變量），二是采用逐步前進法（α留=0.05，α剔=0.10），把可能被剔除的指標因素（P值偏大的、HR值接近1的）先加入至回歸模型，使其先被剔除而不影響后續回歸。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁組織lncRNA CHRF、miR-489及E-cadherin、Vimentine、Snail 蛋白相對表達量比較 見表1。

表1 胃癌組織與癌旁組織lncRNA CHRF、miR-489及EMT相關蛋白相對表達量比較（）

表1 胃癌組織與癌旁組織lncRNA CHRF、miR-489及EMT相關蛋白相對表達量比較（）

注：與癌旁組織比較，*P＜0.05。

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2.2 不同臨床特征的胃癌患者胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489表達比較 見表2。

表2 不同臨床特征的胃癌患者胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489表達比較（）

表2 不同臨床特征的胃癌患者胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489表達比較（）

注：不同臨床特征之間比較，*P＜0.05。

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2.3 胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489與E-cadherin、Vimentine、Snail 表達的關系 胃癌組織lncRNA CHRF與E-cadherin表達呈負相關關系（r= -0.539），與Vimentine、Snail 表達呈正相關關系（r分別為0.497、0.522），P均＜0.05。胃癌組織miR-489 與E-cadherin表達呈正相關關系（r= 0.512），與Vimentine、Snail 表達呈負相關關系（r分別為-0.506、-0.508，P均＜0.05）。

2.4 胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489 高低表達者的預后比較 63 例患者均獲得隨訪，無失訪病例，隨訪3 年共生存46 例，3 年生存率為73.02%。胃癌組織lncRNA CHRF 高表達者3 年生存率為55.56%（15/27），低表達者為86.11%（31/36），兩者比較P＜0.05；胃癌組織miR-489 高表達者3 年生存率為93.33%（28/30），低表達者為54.55%（18/33），兩者比較P＜0.05。見OSID碼圖1、2。

2.5 胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489 表達對患者預后的影響 影響胃癌患者預后的單因素COX 分析結果見表3，多因素COX分析結果見表4。

表3 影響胃癌患者預后的單因素COX分析結果

表4 影響胃癌患者預后的多因素COX分析結果

3 討論

胃癌的發生與發展是多因素、多基因參與的復雜過程，對患者的身體健康及生命安全具有巨大威脅。目前，手術是胃癌的主要手治療段，但一些中晚期胃癌患者存在術后復發率高、生存率低的問題。lncRNA作為一種非蛋白編碼RNA，其異常表達在腫瘤的發生發展過程中具有特殊的調控機制，多種lncRNA（如HOTAIR、ANRIL、GAPLINC 等）參與了胃癌細胞生物學行為（如細胞生長、增殖、凋亡及轉移）的調控，且與腫瘤進展過程密切相關［13］。miRNA通過作用于靶信使RNA 參與細胞增殖、分化、凋亡過程，人類miR-489 定位于7 號染色體，主要表現為抑癌功能，在多種惡性腫瘤中呈低表達，通過調控靶基因的表達參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷徙及轉移過程［14］。研究顯示，lncRNA CHRF 作為miR-489 的天然“海綿”，通過靶向調節Myd88表達，抑制血管緊張素Ⅱ生成，在肥大心肌細胞中表達特異性升高，并誘導心肌肥厚的發生［15］。研究顯示，lncRNA CHRF可吸附miR-489，解除其對靶基因MyD88 和Smad3的抑制作用，從而激活炎癥和纖維化信號通路，在肺纖維化的發生中發揮了關鍵作用［16］。本研究結果顯示，胃癌組織lncRNA CHRF 表達高于癌旁組織、miR-489 表達低于癌旁組織，并與胃癌患者的臨床分期和分化程度有關，TNM 分期越高、分化程度越低的胃癌組織表達變化越明顯，提示二者與胃癌的發生及病情嚴重程度有關。

EMT 存在于多種惡性腫瘤的浸潤及轉移過程中，表現為腫瘤上皮細胞受到細胞外因子刺激后失去極性，轉化為間質細胞，導致細胞遷徙和運動能力增強，腫瘤浸潤和轉移能力升高。研究表明，EMT活性與胃癌的發生發展密切相關［17］。雖然發生EMT 的細胞類型和組織環境會有差異，但發生EMT的過程會存在一些共同特征，通過檢測EMT 相關蛋白可反映上皮細胞的EMT 狀態。E-cadherin 作為細胞黏附連接的關鍵分子，是EMT 的重要標志物，其表達下降時常伴有Wnt 通路激活，減弱了GSK3β 對Snail 的抑制作用，從而促進EMT 的發生。Snail、Vimentine 與啟動因子結合后引起轉錄抑制，可降低E-cadherin 表達，促進EMT 過程。本研究結果顯示，胃癌組織Vimentine 和Snail 蛋白表達高于癌旁組織，E-cadherin 蛋白表達低于癌旁組織，提示胃癌細胞存在EMT 過程。分析其機制，可能是當胃癌發生后，黏附分子及基因表達發生病理性改變，啟動因子胞嘧啶—磷酸—鳥嘌呤基序島區過度甲基化，活性過氧化物、轉化生長因子β（TGF-β）及凋亡信號傳導途徑相關基因表達升高，造成腫瘤組織E-cadherin表達降低，而E-cadherin 表達降低可使腫瘤細胞間黏附作用降低或喪失，導致腫瘤細胞更容易遷徙和轉移；Vimentine 表達升高可激活C-src 原癌基因，進一步使限速酶己糖激酶磷酸化，為腫瘤的生長及轉移提供有利條件；Snail 可通過與E-cadherin 啟動子區的作用元件E-box 結合，從而抑制E-cadherin 轉錄，參與胃癌的發生及病理進展過程。本研究結果顯示，miR-489 表達與E-cadherin 呈正相關關系，與Vimentine 和Snail 呈負相關關系；而lncRNA CHRF 表達與E-cadherin 蛋白呈負相關關系，與Vimentine、Snail 呈正相關關系。研究顯示，miR-489 通過靶向抑制Twistl 在胃癌細胞中的表達，從而抑制胃癌細胞的生長、遷移和侵襲過程，同時miR-489 可通過抑制EMT 過程，參與抑制胃癌細胞的生長與病理進展；此外，miR-489 可直接調控靶基因（如Akt3、PTPN11、MyD88 等）及相關通路，影響胃癌細胞的生物學行為［18］。因此，miR-489 可通過多種途徑對胃癌細胞形成復雜的調控網絡，最終影響胃癌的發生及進展過程。而當miR-489 表達降低時，其對胃癌細胞及EMT 過程的抑制作用減弱，更有利于腫瘤細胞的生長及病理進展。lncRNA CHRF 可能通過調控EMT 相關蛋白和miR-489 表達，參與調控胃癌細胞的增殖、侵襲、轉移過程，然而其具體的信號通路尚需進一步研究。

本研究結果顯示，lncRNA CHRF 高表達者3 年生存率低于lncRNA CHRF 低表達者，miR-489 高表達者3年生存率高于miR-489低表達者，進一步分析顯示胃癌組織lncRNA CHRF 表達升高及miR-489表達降低是影響患者預后的獨立危險因素。推測lncRNA CHRF 表達上調、miR-489 表達下調更有利于胃癌細胞的浸潤和轉移，導致轉移灶隱匿性發展，從而使手術難以切除所有的病灶，增加了患者復發及術后死亡的風險。另外，癌組織lncRNA CHRF 表達上調可促進胃癌細胞的EMT，促進腫瘤分化、轉移的同時，增加了輔助治療藥物的耐藥性，從而影響患者預后［19］。

綜上所述，胃癌組織lncRNA CHRF 表達升高、miR-489表達降低，二者參與了EMT 的發生，并與患者的病情嚴重程度及預后有關。lncRNA CHRF 高表達和miR-489 低表達是胃癌預后的獨立危險因素，可作為胃癌診療的特異性生物標志物。