白術內酯Ⅲ對自發性高血壓大鼠腦卒中的影響及機制研究

李吉博, 馮永文, 吳文峰, 范學政, 李海霞

[中國科學院大學深圳醫院(光明), 1. 重癥醫學科, 2. 神經外科, 3. 急診科, 廣東 深圳, 518106]

腦卒中是危及人類生命健康的主要疾病之一,具有較高的致死率和致殘率[1-2]。原發性高血壓的臨床發病率較高且發病趨于年輕化,而腦卒中是自發性高血壓患者常見的并發癥[3]。自發性高血壓所致腦卒中目前尚無針對性的有效治療方法,因此,開發新藥物對治療自發性高血壓相關腦卒中具有重要意義。白術內酯Ⅲ(A Ⅲ)是一種天然草本生物活性化合物,具有抗炎和神經保護作用[4]。既往研究[5]發現, A Ⅲ可減輕異氟烷誘導的大鼠海馬神經元損傷,表明A Ⅲ對腦具有保護作用,但A Ⅲ能否治療自發性高血壓大鼠(SHR)腦卒中尚不明確。相關研究[6-7]表明,自發性高血壓患者血漿中miRNA-296-5p表達水平顯著高于非自發性高血壓患者,且A Ⅲ通過上調微小RNA-296-5p(miR-296-5p)而抑制人肝癌細胞生長并誘導其凋亡。本研究探討A Ⅲ對SHR腦卒中的影響及其分子機制,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SPF級SD大鼠12只, 6周齡,體質量200～210 g, 購自導科醫藥技術(廣東)有限公司,生產許可證號為SCXK(粵)2022-0060。雄性SPF級SHR共96只, 6周齡,體質量200～210 g, 購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。本研究動物實驗均已獲得本院動物倫理委員會審核批準。

1.2 主要試劑

A Ⅲ(規格1 g, 純度≥98%)購自深圳虹彩祥根生物科技有限公司; miR-296-5p激動劑(miR-296-5p agomir)及其陰性對照品(agomir NC)購自百奧邁科生物技術有限公司; 尼莫地平購自北京凱詩源生物科技有限公司。

1.3 SHR腦卒中模型構建

使6周齡SHR連續2個月自由飲用0.9%氯化鈉溶液,然后給予1%氯化鈉溶液喂養,若SHR出現肢體抽動、癱瘓、全身震顫、軟癱甚至死亡等癥狀中的1種,則視為SHR腦卒中模型構建成功[8]。本實驗建模成功率為100%, 建模過程中未出現大鼠死亡情況。

1.4 動物分組及處理

按照隨機數字表法將模型大鼠分為模型組(Model組)、A Ⅲ低劑量組(A Ⅲ-L組)、A Ⅲ高劑量組(A Ⅲ-H組)、陽性藥物尼莫地平組(Nim組)、miR-296-5p激動劑組(miR-296-5p agomir組)、agomir NC組、A Ⅲ-H+miR-296-5p agomir組、A Ⅲ-H+agomir NC組,每組12只。A Ⅲ-L組、A Ⅲ-H組大鼠分別尾靜脈注射2.22、6.66 mg/kg A Ⅲ, 且腹腔注射等量生理鹽水[9]; Nim組大鼠腹腔注射1 mg/kg尼莫地平,且尾靜脈注射等量生理鹽水[10]; agomir NC組、miR-296-5p agomir組大鼠分別尾靜脈注射300 μg agomir NC、300 μg miR-296-5p agomir, 腹腔注射等量生理鹽水[11]; A Ⅲ-H+agomir NC組大鼠尾靜脈注射6.66 mg/kg A Ⅲ和300 μg agomir NC, 腹腔注射等量生理鹽水; A Ⅲ-H+miR-296-5p agomir組大鼠尾靜脈注射6.66 mg/kg A Ⅲ和300 μg miR-296-5p agomir, 腹腔注射等量生理鹽水; Model組大鼠腹腔注射等量生理鹽水,尾靜脈注射等量生理鹽水。將正常飼養的12只SD大鼠設為對照組(NC組),分別腹腔注射和尾靜脈注射等量生理鹽水。各組大鼠給藥1次/d, 持續6周。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠神經癥狀評分: 參照文獻[10]進行大鼠神經癥狀評分。0分表示大鼠正常; 1分表示大鼠少動或輕度激惹; 2分表示單側前肢或頭抽動,時跳時竄; 3分表示大鼠單側肢體癱瘓,行走困難; 4分表示大鼠四肢癱瘓,不能站立。

1.5.2 大鼠平均動脈壓: 將大鼠固定于血壓計配套的保溫套中,待血壓監測界面的脈搏波趨于穩定時,使用智能無創血壓計測定尾動脈血壓。

1.5.3 大鼠存活時間: 從給藥第1天開始,每天統計各組大鼠生存情況直至末次給藥結束,若出現死亡,記錄大鼠存活時間。

1.5.4 大鼠血小板黏附率: 末次處理24 h后,將所有大鼠經腹主動脈取血,收集血液,使用XSN-R型血小板黏附-體外血栓兩用儀檢測各組大鼠血小板黏附率。

1.5.5 大鼠腦組織海馬CA1區病理變化: 采用蘇木素-伊紅(HE)染色法檢測。于大鼠死后或卒中后6周處死后,立即取海馬CA1區腦組織。各組隨機選取6只大鼠的海馬CA1區腦組織固定于4%多聚甲醛中,將組織標本包埋于石蠟中,用切片機切成5 μm切片后進行HE染色,使用光學顯微鏡觀察腦組織海馬CA1區病理變化。

1.5.6 大鼠腦組織海馬CA1區miR-296-5p表達: 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miR-296-5p表達。取各組剩余6只大鼠的海馬CA1區腦組織,利用TRIzol試劑提取腦組織勻漿總RNA。將RNA逆轉錄為cDNA后,以cDNA為模板進行qRT-PCR[12-13]。qRT-PCR反應條件為95 ℃預變性30 s, 95 ℃變性5 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共45個循環。以U6為內參基因,通過2-△△Ct法計算miR-296-5p相對表達水平。U6正向引物(5′-3′)為CTCGCTTCGGCAGCACA,反向引物(5′-3′)為AACGCTTCACGAATTTGCGT; miR-296-5p正向引物(5′-3′)為GTATCCAGTGCAGGGTCCGA, 反向引物(5′-3′)為CGACGAGGGCCCCCCCT。

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 A Ⅲ對大鼠神經癥狀評分和平均動脈壓的影響

與NC組比較,Model組大鼠神經癥狀評分、平均動脈壓升高,差異有統計學意義(P<0.05); 與Model組比較, A Ⅲ-L組、A Ⅲ-H組、Nim組大鼠神經癥狀評分、平均動脈壓降低,差異有統計學意義(P<0.05); 與A Ⅲ-L組比較, A Ⅲ-H組、Nim組大鼠神經癥狀評分、平均動脈壓降低,差異有統計學意義(P<0.05); 與Model組、agomir NC組比較, miR-296-5p agomir組大鼠神經癥狀評分、平均動脈壓升高,差異有統計學意義(P<0.05); 與A Ⅲ-H組、A Ⅲ-H+agomir NC組比較, A Ⅲ-H+miR-296-5p agomir組大鼠神經癥狀評分、平均動脈壓升高,差異有統計學意義(P<0.05), 見表1。

表1 各組大鼠神經癥狀評分和平均動脈壓比較

2.2 A Ⅲ對大鼠存活時間和血小板黏附率的影響

與NC組比較, Model組大鼠存活時間縮短,血小板黏附率升高,差異有統計學意義(P<0.05); 與Model組比較, A Ⅲ-L組、A Ⅲ-H組、Nim組大鼠存活時間延長,血小板黏附率降低,差異有統計學意義(P<0.05); 與A Ⅲ-L組比較, A Ⅲ-H組、Nim組大鼠存活時間延長,血小板黏附率降低,差異有統計學意義(P<0.05); 與Model組、agomir NC組比較, miR-296-5p agomir組大鼠存活時間縮短,血小板黏附率升高,差異有統計學意義(P<0.05); 與A Ⅲ-H組、A Ⅲ-H+agomir NC組比較,A Ⅲ-H+miR-296-5p agomir組大鼠存活時間縮短,血小板黏附率升高,差異有統計學意義(P<0.05), 見表2。

表2 各組大鼠存活時間和血小板黏附率比較

2.3 A Ⅲ對大鼠海馬CA1區病理損傷的影響

HE染色結果顯示, NC組大鼠海馬CA1區神經元結構正常; Model組大鼠海馬CA1區神經元結構紊亂,核固縮,神經元數量減少; 與Model組比較, A Ⅲ-L組、A Ⅲ-H組、Nim組大鼠海馬CA1區病理損傷減輕; 與Model組、agomir NC組比較, miR-296-5p agomir組大鼠海馬CA1區病理損傷加劇; 與A Ⅲ-H組、A Ⅲ-H+agomir NC組比較, A Ⅲ-H+miR-296-5p agomir組大鼠海馬CA1區病理損傷嚴重,見圖1。

2.4 A Ⅲ對大鼠腦組織海馬CA1區miR-296-5p表達的影響

與NC組比較, Model組大鼠海馬CA1區miR-296-5p表達升高,差異有統計學意義(P<0.05); 與Model組比較, A Ⅲ-L組、A Ⅲ-H組、Nim組大鼠海馬CA1區miR-296-5p表達降低,差異有統計學意義(P<0.05); 與A Ⅲ-L組比較, A Ⅲ-H組、Nim組大鼠海馬CA1區miR-296-5p表達降低,差異有統計學意義(P<0.05); 與Model組、agomir NC組比較, miR-296-5p agomir組大鼠海馬CA1區miR-296-5p表達升高,差異有統計學意義(P<0.05); 與A Ⅲ-H組、A Ⅲ-H+agomir NC組比較,A Ⅲ-H+miR-296-5p agomir組大鼠海馬CA1區miR-296-5p表達升高,差異有統計學意義(P<0.05), 見表3。

表3 各組大鼠腦組織海馬CA1區miR-296-5p表達比較

3 討 論

SHR是目前國際公認的最接近于人原發性高血壓的動物模型,也是藥物篩選及基礎研究的首選動物模型[14]。本研究通過高鹽喂養SHR構建SHR腦卒中模型,結果顯示,與NC組比較, Model組大鼠神經癥狀評分、平均動脈壓升高,存活時間縮短,海馬CA1區病理損傷嚴重,表明SHR腦卒中模型構建成功。血小板黏附是指血小板可黏附于其他異物表面的特性,在正常生理情況下,血小板不與完整的血管內皮發生黏附,病理狀態下血小板則可黏附至內皮下基質中的膠原上,進而引發腦血管病變[15]。本研究發現, Model組大鼠血小板黏附率顯著高于NC組,再次證實Model組大鼠存在腦血管病變。

A Ⅲ是從白術中發現的主要生物活性成分,已被證實具有抗氧化、抗腫瘤、抗過敏反應、抗菌作用和認知保護作用[16-17]。A Ⅲ可抑制脂多糖誘導的小鼠小膠質細胞炎癥反應[18], 可保護原代培養的神經元免受同型半胱氨酸處理誘導的細胞凋亡[19],可減輕神經炎癥而改善小鼠腦缺血情況[20]。本研究結果顯示, A Ⅲ可降低腦卒中SHR的神經癥狀評分、平均動脈壓、血小板黏附率,延長存活時間,減輕海馬CA1區病理損傷,且A Ⅲ劑量越高,對應指標的變化趨勢越顯著,表明A Ⅲ可減輕SHR腦卒中,或可成為治療自發性高血壓誘發腦卒中的潛在有效藥物。

既往研究[21]顯示, A Ⅲ可通過調控miR-466c-5p表達而抑制過氧化氫誘導的大鼠骨髓間充質干細胞成脂分化。為了進一步探究A Ⅲ影響SHR腦卒中的分子機制,本研究團隊對與自發性高血壓相關的文獻進行搜索,發現miR-296-5p表達與非洲綠猴的自發性高血壓有關[22], 且腦缺血損傷可刺激miR-296表達水平逐漸上調[23], 表明miR-296-5p可能與SHR腦卒中有關。本研究結果顯示, Model組大鼠腦組織海馬CA1區miR-296-5p表達高于NC組,且相較于Model組、agomir NC組, miR-296-5p agomir組大鼠海馬CA1區miR-296-5p表達升高,神經癥狀評分、平均動脈壓、血小板黏附率升高,存活時間縮短,海馬CA1區病理損傷加劇,表明miR-296-5p確實參與了SHR腦卒中過程。本研究還發現, A Ⅲ可抑制腦卒中SHR海馬腦組織CA1區miR-296-5p表達,且A Ⅲ劑量越高,抑制作用越顯著,推測A Ⅲ可能通過抑制miR-296-5p表達減輕SHR腦卒中。為了驗證該猜想,本研究在高劑量A Ⅲ作用的基礎上加用miR-296-5p agomir干預腦卒中SHR[24], 結果顯示, miR-296-5p agomir減弱了高劑量A Ⅲ對SHR腦卒中的改善作用,證實了猜想的正確性,即A Ⅲ可能通過抑制miR-296-5p表達而減輕SHR腦卒中。

綜上所述, A Ⅲ可能通過抑制miR-296-5p表達對SHR腦卒中起到治療作用,但A Ⅲ對SHR腦卒中的改善作用可能還涉及其他通路,有待未來深入開展后續研究加以探討。