乳球菌屬在黃酒釀造過程中的分布及作用研究

胡夢莎，孫國昌，毛青鐘

（會稽山紹興酒股份有限公司，浙江紹興 312032）

黃酒是我國的傳統發酵食品，富含多種營養成分和活性物質，營養價值高，與啤酒、葡萄酒并稱為世界三大古酒。它以谷物為原料，經浸米、蒸煮、加曲、糖化發酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾調而成。黃酒發酵的最大特點是霉菌、酵母菌、細菌共同參與的多菌種混合發酵，在其生產過程中微生物在不同階段發揮著重要作用。

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是對可發酵碳水化合物并產生乳酸的一類細菌的統稱[1]。除鏈球菌屬的少數幾個種以外，絕大多數的乳酸菌是具有重要生理功能的益生菌，被公認為是安全(generally regarded as safe，GRAS)的食品級微生物，已被廣泛用于食品、農業和醫藥等領域[2]。早期，在黃酒釀造中，乳酸菌和醋酸菌、枯草芽孢桿菌一起被認為是有害微生物[3]，隨著研究的深入，乳酸菌在黃酒釀造中的重要作用才得以被肯定。現有研究發現，乳球菌屬和乳桿菌屬是黃酒中較為重要的兩種乳酸菌，但目前并沒有系統闡述它們在黃酒釀造過程中的作用。本文綜述了近年來黃酒中乳球菌屬的研究進展。

1 乳球菌屬分類及其性能

1.1 乳球菌屬分類及性能

1985 年，Schleifer 等[4]建議將乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis) 及其相關的鏈球菌移入到一個新的菌屬，即乳球菌屬，這一建議于1986 年正式公布。在2001 年出版的《伯杰氏系統細菌學手冊》第1 卷中，乳球菌屬(Lactococcus)被分類于硬壁菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目、鏈球菌科中的第2屬[5]。

乳球菌屬細菌形態呈球形或卵圓形，(0.5～1.2)μm×(0.5～1.5)μm，在液體培養基中主要成對或成短鏈，見圖1、圖2、圖3[6]，革蘭氏陽性，不運動，不產莢膜和芽孢，兼性厭氧，能發酵一些碳水化合物產酸，以L(+)-乳酸為主，不產氣，接觸酶和氧化酶均為陰性，營養要求復雜，最適溫度30 ℃，部分菌種能在10 ℃生長，但基本上在45 ℃都不生長[7]。所有的乳球菌通常能在4 % NaCl 生長，僅乳酸乳球菌乳脂亞種只耐2%NaCl[6]。大部分種別可從植物產品和乳制品中分離出，一些菌種可從人類標本中分離出。

圖1 乳酸乳球菌乳酸亞種超薄切片電子顯微照片[6]

圖2 乳酸乳球菌乳酸亞種的相差顯微照片[6]

圖3 乳酸乳球菌乳亞種相差顯微照片[6]

此菌株形成對生的卵圓形細胞清晰地表現出剛開始分裂的類似桿狀的外形，此菌株形成鏈狀排列，標尺=10 μm。

1.2 乳球菌屬的模式菌

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，L.lactis)是乳球菌屬中的模式菌，形成單一的DNA 同源群。L.lactis在食品工業中應用廣泛，對人和動物無致病性。按其表型特征，最初將L.lactis分為3 個亞種，分別為乳酸乳球菌乳酸亞種(L.lactissubsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亞種(L.lactissubsp.cremoris)、乳酸乳球菌葉蟬亞種(霍氏)(L.lactissubsp.hordniae)。2011 年Pérez 等從褐鱒魚(Salmo trutta)和虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)的腸道黏液中分離得到一個新亞種，命名為Lactococcus lactissubsp.tructae[8]。因此目前為止，乳酸乳球菌包括4個亞種。表1、表2列出了乳酸乳球菌亞種的鑒別特征和其他性能[8-14]。

表1 乳酸乳球菌亞種的鑒別特征

表2 鑒定乳酸乳球菌的其他性能

2 乳球菌屬在黃酒釀造過程中的分布及作用

乳球菌是參與黃酒發酵的重要微生物之一，浸米和發酵過程都離不開乳球菌。乳球菌的增殖、糖化分解、產酸性能等都給釀酒酵母、乳桿菌等創造出一個良好的生態環境，為在開放體系下釀造黃酒提供最佳條件。

2.1 浸米時期的乳球菌

浸米是黃酒釀造過程中的第一步，也是非常重要的工藝之一。其主要目的是使米充分吸水膨脹，有利于后續蒸煮，同時米中含有的少量糖化酶可將淀粉轉化為糖，糖進一步被乳酸菌利用產生乳酸。

朱小芳等[16]通過高通量測序技術分析黃酒浸米水中的細菌群落結構，發現浸米過程中乳酸菌為優勢細菌，其豐度含量占比為60.67%，有乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、魏斯氏菌屬(Weissella)等，其中乳桿菌屬含量占乳酸菌的90.06%，片球菌屬占8.91%，乳球菌屬占0.57%。

陳歷水等[17]的研究表明原米經過浸泡后其微生物群落發生顯著變化，乳桿菌屬和乳球菌屬成為群落中的優勢種屬，乳球菌屬的豐度僅次于乳桿菌屬，高于片球菌屬；禹偉[18]的研究結果也表明浸米水中乳酸乳球菌和乳桿菌為優勢細菌，并且從第2 天的浸米水中分離出乳酸乳球菌。這與朱小芳等[16]的研究結果存在一些差別，分析可能是由于浸米水取樣的時間、方法、位置等不一樣而導致的。

毛青鐘[19]利用傳統微生物分離培養技術研究發現，浸米前期浸米水中主要是乳球菌，隨著水中酸度升高，逐漸以桿菌的作用為主，越到浸米后期，乳桿菌所占比例越大(超過85 %)。當浸米水的pH＜4.5 時，球菌的數量已大幅減少。浸米結束時僅有極少量的乳球菌(對生和四鏈生)存在，乳球菌存在于浸米的整個過程，但后期數量非常少[20]。此外，浸米水表面主要是桿菌，乳球菌大部分存在于浸米水內部[19]。因此，研究浸米水中的微生物時，取樣時間及取樣方式、位置顯得格外重要。

長期的生產實踐發現，相同工藝、相同底物發酵濃度釀成的紹興黃酒，若浸米時間長，入壇后久藏不壞，反之則不易久藏。分析可能是在浸米過程中產生了某種抑菌成分的緣故，且這種抑菌成分伴隨著發酵最終進入到成品黃酒中。成瀟龍等[21]以金黃色葡萄球菌為指示菌，研究發現黃酒釀造浸米水中的抑菌物質為乳酸鏈球菌素(Nisin)。乳酸鏈球菌素，又稱為乳鏈菌肽，是由乳酸乳球菌乳酸亞種的一些菌株在代謝過程中合成的一種含有34 個氨基酸殘基的多肽型天然生物防腐劑[22]，能抑制大部分革蘭氏陽性菌的生長繁殖，如乳桿菌、產芽孢桿菌、耐熱腐敗菌等，對酵母菌和霉菌則無抑制作用[23]。

浸米過程中乳酸菌及其豐富的發酵產物是保障黃酒發酵過程在開放條件下正常進行的關鍵因素之一。浸米水中含有豐富的營養物質，如淀粉、蛋白質、糖類等，還有B 族維生素、微量元素等[24]，乳球菌會利用這些營養物質，代謝產生大量乳酸等酸類物質，降低浸米水的pH 值。酸度的提高能抑制有害菌的生長繁殖，從而保障發酵安全順利進行。同時，發酵過程中產生的有機酸，是黃酒風味物質的重要來源。例如，乳酸是黃酒中含量最高的有機酸，微帶澀感，能給黃酒帶來醇厚感[15，25]，且具有溶解其他香氣成分的定香作用[26]；乙酸是黃酒中主要的揮發性酸，帶有愉快的酸香味，不僅能增加酒體的濃厚感，還能和相應的醇反應生成酯，帶來濃郁的酯香[26]。

2.2 酒藥制作淋飯酒母過程中的乳球菌

酒母是黃酒釀造過程中酵母的主要來源，按生產工藝不同可分為淋飯酒母、速釀酒母、糖化酒母等。其中，淋飯酒母用于傳統黃酒的生產，通過搭窩操作可以使酒藥中大量的有益微生物在有氧條件下迅速繁殖。

酒藥中的細菌數僅次于扣囊復膜孢酵母數，在有些酒藥中細菌數甚至超過了酵母數[27]。經檢測分析，酒藥中的細菌包括乳酸菌、醋酸菌、丁酸菌、枯草芽孢桿菌等，其中乳酸菌包括乳球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬等[28]。

毛青鐘[29]通過傳統分離培養法對淋飯酒母及其制作過程進行研究，發現乳球菌是淋飯酒母制備的關鍵菌。搭窩糖化時，窩液中乳球菌的含量約為0.45×108個/mL，而乳桿菌的數量很少，乳球菌產生的有機酸使窩液的pH 值降至3.5 以下，甚至3.0 以下。放水加曲后，醪液的pH 值升高至3.8 左右，此時酵母和細菌競爭性迅速繁殖，產生大量乳酸等有機酸，使醪液的pH 值迅速下降到3.5 以下，乳球菌的數量急劇增加，在頭耙和二耙的時候達到頂峰，約為1.0×108個/mL。隨后酵母產生了大量的酒精，抑制了不耐高酒精度的乳球菌的生長和繁殖，數量迅速減少，直至檢測不到。一般16 d 以上、酒精度大于15%vol 的淋飯酒母才會應用于生產，此時已基本檢測不到乳球菌。

乳球菌在淋飯酒母搭窩糖化期起糖化分解作用，快速生長繁殖，發酵產生大量乳酸，并累積產生乳酸菌細菌素[27]。大量乳酸、低pH 值、乳酸菌細菌素、高糖度等能抑制有害細菌的生長繁殖。因此，在淋飯酒母制作過程中，乳球菌起了非常重要的作用，保證了在開放的條件下把從酒藥、曲和熟地上接入的優良酵母順利培養成酒母。

2.3 發酵醪中的乳球菌

紹興機械化黃酒生產采用的是速釀酒母。速釀酒母的制備是通過創造一定的環境和營養條件，選擇性地逐步擴大培養、馴育黃酒酵母菌和有益乳酸菌等微生物的過程[30]。目前還未有對速釀酒母中微生物群落的研究，但對速釀酒母釀造的機械化黃酒發酵醪中細菌群落的研究較多。

Hong 等[32]通過16S rDNA/ITS 測序技術和宏基因組技術分析了機械化黃酒發酵醪中微生物的多樣性，鑒定出數量較多的細菌有乳桿菌屬、糖多孢菌屬、芽孢桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬，還有少量的鏈霉菌屬、魏斯氏菌屬、片球菌屬等。Liu 等[31]利用Illumina MiSeq 測序方法研究了紹興黃酒中細菌的演替，結果表明紹興黃酒發酵過程中的優勢細菌(含量在1.00 %以上)有10 種，包括糖多孢菌屬、芽孢桿菌屬、高溫放線菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬等，這與劉蕓雅[26]的研究結果一致。劉蕓雅還發現乳球菌屬在0 d 的發酵液中豐度最高，達到11%左右，然后豐度降低，在發酵18 d的時候開始回升，發酵24 d時豐度為3%。

通過宏基因組技術分析，謝廣發等[33]在發酵醪中鑒定出的乳酸菌包括乳桿菌屬50 種、乳球菌屬2種、明串珠菌屬12 種、魏斯氏菌屬4 種、片球菌屬4種、酒球菌屬2 種、雙歧桿菌屬6 種等，其中植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、乳酸乳球菌等乳酸菌數量相對較多。

這些研究結果都表明，紹興機械化黃酒發酵醪中乳球菌屬屬于優勢細菌的一種，在發酵前期含量較高，隨后有所下降，在發酵后期又有稍許回升。其中乳酸乳球菌的數量較多。

在黃酒發酵過程前期，乳酸乳球菌等乳球菌屬細菌不斷增值，產生乳酸等有機酸，產生的乳酸會與乙醇反應生成乳酸乙酯，是黃酒的一種重要風味物質。劉蕓雅[26]借助SIMCA-P 多元統計軟件，采用PLSR，系統分析了黃酒發酵中細菌菌群與風味物質的相關性，結果表明乳球菌屬與1-辛烯-3-醇、苯甲醛、苯乙醛相關性極強；洪家麗等[34]從紅曲黃酒傳統釀造用曲和釀造過程中分離出了乳酸乳球菌(Ll)，通過研究發現接種乳酸乳球菌(Ll)能促進酵母菌的生長，有效增加紅曲黃酒中辛酸乙酯、正丁醇和草酸乙酯的含量。這些結果都表明乳球菌屬在黃酒揮發性物質形成中占有重要地位。

3 結語

黃酒是經酵母、細菌和霉菌等微生物共同作用釀造而成的發酵原酒，其釀造過程是在開放式狀態下進行的，各種原輔料和工器具中都存在著大量的微生物，釀造環境及空氣中的微生物也均有機會侵入。在這種生產環境下，黃酒長期以來能夠安全釀造，與其自身微生物體系的變化及產物有著密切的關系。乳球菌屬是參與黃酒發酵的重要微生物之一，浸米、淋飯酒母及機械化黃酒發酵過程中都離不開乳球菌屬。一方面，乳球菌屬能產生大量乳酸、乳酸菌細菌素等物質，在黃酒釀造過程中抑制有害細菌的生長繁殖，保障黃酒釀造的安全性和黃酒的安全；另一方面，乳球菌屬產生的代謝產物又能給黃酒風味添磚加瓦。