基于高效液相色譜測定白酒中乳酸和乙酸的方法研究

張 婷，胡來麗，時 源，楊 果，何世興

（1.四川郎酒股份有限公司，四川古藺 646523；2.四川省醬香型白酒生態(tài)釀造工程技術研究中心，四川瀘州 646523）

為準確定量白酒中乳酸含量，本研究采用高效液相色譜法，選用磷酸二氫鈉作為流動相體系，加入不同比例甲醇，用5%乙醇制備標準溶液以排除乙醇對乳酸、乙酸保留時間的干擾，建立標準曲線，并通過精密度和加標回收試驗，以驗證方法的準確性。利用該方法找出不同香型白酒中有機酸的差異性，并選取原酒蒸餾過程中的前段、中段、尾段酒樣進行分析，以期為白酒中乳酸含量測定提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：醬香、濃香、清香3 種香型酒樣各10 個，市購；選取原酒蒸餾過程前段、中段、后段酒樣各1個。

試劑：甲醇（fisher）、乙醇（西隴科學股份有限公司）、乳酸（天津市光復化工研究所）、乙酸（天津市光復化工研究所）均為色譜純；磷酸（成都市科隆化學品有限公司）、磷酸二氫鈉（天津市科密歐化學試劑有限公司）均為優(yōu)級純。

儀器設備：Waters 2695 超高效液相色譜儀，配2489 紫外檢測器；Milli-Q（IQ7010）純水系統(tǒng)；pH儀，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；萬分之一分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；0.22 μm有機濾膜，天津市津騰實驗設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 流動相配制

配制濃度為20 mM磷酸二氫鈉，并用磷酸調節(jié)pH至2.7。

1.2.2 樣品前處理

總之，迪士尼樂園與色彩豐富的美國西海岸攝影藝術都曾在斯各格蘭德身上打下印記。同時出現在其作品中的，還有美國恐怖電影的痕跡，以及美國中產階級的焦慮——斯各格蘭德擅長以諷刺手法來表現這一點。她的作品中顯然飄蕩著一種城郊居民的憂郁氣息。她承認對平庸充滿興趣，“我自己也出身于中產階級，從品味來看，我的階層正是我做出許多選擇的根源。”

將樣品稀釋過0.22 μm 水系濾膜，待上機分析。

1.2.3 定性實驗

分別配制乳酸、乙酸標準溶液，在相同條件下進行檢測，根據乳酸、乙酸保留時間定性。

1.2.4 標準曲線的制作

準確稱取0.10 g 乳酸、乙酸至100 mL 容量瓶，分別用不同濃度乙醇溶液溶解并定容到100 mL，配制成濃度為100 mg/100 mL 乳酸、乙酸儲備液。用該儲備液配制濃度為0 mg/100 mL，5 mg/100 mL，10 mg/100 mL，25 mg/100 mL，50 mg/100 mL，100 mg/100 mL 的乳酸、乙酸混合標準溶液并建立標準曲線。

1.2.5 色譜條件

色譜柱：XSelect HSST3 (4.6 ×250 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量為10 μL；流動相A 為磷酸二氫鈉，B 為甲醇；配紫外檢測器，檢測波長為210 nm，分別在A∶B=95∶5 和A∶B=90∶10的流動相比例下進行測定分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

白酒樣品中主要成分為乙醇和水，考慮基質對分析結果的影響，分別用純水和10 %乙醇溶液配制標準溶液建立標準曲線。由圖1 和圖2 可看出，乙醇影響分離程度，乳酸保留時間為5.5 min。

圖1 純水配制標準曲線

圖2 10%乙醇配制標準曲線

XSelect HSS T3 5 μm 4.6×250 mm為反相色譜柱，通過加入5 %、10 %甲醇提高色譜柱分離程度。圖3 為流動相中加入5%甲醇、用10%乙醇作為溶劑建立的標準曲線，乳酸、乙酸保留時間提前，出現乳酸峰前移及乙酸峰拖尾現象。

圖3 流動相中加入5%甲醇、10%乙醇作為溶劑建立的標準曲線

圖4 為流動相中加入10 %甲醇、10 %乙醇作為溶劑建立的標準曲線，乳酸保留時間提前至4.0 min，峰分離效果好。

圖4 流動相中加入10%甲醇、10%乙醇作為溶劑建立的標準曲線

考慮乙醇對保留時間及結果的影響，將樣品分別稀釋至1 %vol、2 %vol、3 %vol、4 %vol、5 %vol、6 %vol、7 %vol、8 %vol、9 %vol。結果發(fā)現乳酸保留時間不變，乙酸保留時間受乙醇濃度影響，隨乙醇濃度增加而提前。酒精度范圍在10%vol 內，乙酸保留時間差異為0.1 min（見圖5）。根據流動相中不同乙醇濃度對保留時間的影響，綜合考慮將該方法優(yōu)化為濃度為20 mM、pH2.7 磷酸二氫鈉流動相中加入10%甲醇，用5%vol 乙醇溶液配制乳酸、乙酸標準溶液建立標準曲線。

圖5 不同乙醇濃度對乳酸、乙酸保留時間的影響

2.2 線性關系及檢出限

采用濃度為20 mM、pH2.7 磷酸二氫鈉，加入10%甲醇流動相，用5%乙醇作為溶劑建立標準曲線，對配制的不同濃度系列標準溶液進行檢測，得到標準曲線。乳酸、乙酸的保留時間、線性范圍、標準曲線回歸方程、相關系數及檢出限見表1。

表1 乳酸乙酸HPLC分析標準曲線

相關系數R2均＞0.9999，可滿足定量檢測要求。以信噪比（S/N)=3確定檢出限，能夠滿足實驗室的檢測需求[5]。

2.3 精密度試驗

配制濃度為2 mg/100 mL、20 mg/100 mL、80 mg/100 mL 的標準溶液，用上述方法進行6 次平行測定，計算乳酸和乙酸在不同濃度下測定結果的平均值及RSD。由表2 可知，乳酸、乙酸精密度試驗結果相對標準偏差均＜1.0 %，說明該方法的精密度良好，可用于白酒樣品的檢測。

表2 精密度試驗結果 （n=6)

2.4 加標回收率試驗

在含量約為40 mg/L 的標樣中，加入40 mg/L的標準品，平行測定3次，計算平均回收率和RSD，結果如表3所示。

表3 加標回收率試驗結果 (n=3)

由表3 可知，乳酸的加標回收率在102 %～103%之間，乙酸的加標回收率在104%～106%之間，RSD 均＜0.5%，表明該方法的測定結果準確度較好。

2.5 3種香型白酒四大酸的測定分析

選取3 種香型不同廠家酒樣各10 個，稀釋為乙醇濃度≤5%vol 樣品，過0.22 μm 有機濾膜，進行乳酸、乙酸測定，用氣相色譜法進行丁酸、己酸分析，用指示劑法對總酸進行測定，結果見表4。

對比得出不同香型白酒四大酸存在差異性，其中醬香型白酒乳酸、乙酸和總酸較高；濃香型白酒己酸較高；清香型白酒乙酸較高。初步得出白酒四大酸指標差異性可影響白酒風格及香型[7]。

2.6 前、中、尾段酒樣四大酸結果分析

選取原酒蒸餾過程前段、中段、尾段酒樣，用此方法進行四大酸分析，結果見表5。對比得出，有機酸隨著餾酒時間的延長呈上升趨勢，有機酸與餾酒時間呈正相關。鑒于此，可進一步開展白酒餾分風味物質的分析，并結合生產實際對白酒餾酒工藝提供技術指導[7]。

表5 前段、中段、尾段酒樣四大酸含量 (g/L)

3 結論

本研究確立了高效液相色譜法檢測白酒中乳酸、乙酸含量的方法，其標準曲線相關系數、精密度、加標回收率均能滿足試驗要求。通過研究不同體積分數乙醇對乳酸、乙酸保留時間和峰形的影響，在濃度為20 mM、pH2.7 磷酸二氫鈉加入10 %甲醇流動相，以便于增加乳酸、乙酸分離程度，用5%乙醇溶液配制標準溶液建立標準曲線，樣品稀釋為乙醇含量低于5%vol時，可以提高檢測結果的準確性。

利用該方法對醬香、濃香、清香3 種香型白酒的乳酸、乙酸進行測定，用氣相色譜法對己酸、丁酸進行測定，用指示劑法對總酸進行測定，可準確檢測出各酒樣中乳酸、乙酸、丁酸和己酸的含量差異。對餾酒過程中前段、中段、尾段酒樣中的四大酸進行測定，可知有機酸含量與餾酒時間呈正相關。本研究所提出的方法可用于白酒樣品中乳酸、乙酸的檢測，所得結果準確、可靠。