基于轉錄組鑒定鼓槌石斛花溫度脅迫響應基因

陳宏宇，于瑩，李菲

基于轉錄組鑒定鼓槌石斛花溫度脅迫響應基因

陳宏宇1，于瑩2，李菲1

（貴州中醫藥大學 1. 藥學院，2. 基礎醫學院，貴州 貴陽 550025）

為研究鼓槌石斛花在溫度脅迫應答方面的基因表達差異，對其在低溫和高溫脅迫下進行Illumina技術轉錄組測序．結果表明，組裝獲得321 734個單基因，其中141 464個基因在Nr，COG等4個數據庫中獲得注釋．低溫和高溫脅迫分別識別了3 830，10 430個應答基因．在應答基因中，發現多個CBL，CBF和熱激蛋白等基因成員．鼓槌石斛花低溫脅迫應答可能與“損傷應答”“細胞外區”“血紅素結合”等多個過程有關；高溫脅迫應答可能與“缺水應答”“核”“ATP結合”等多個過程有關．這些差異基因為解析鼓槌石斛非生物脅迫應答機制提供幫助．

鼓槌石斛；轉錄組；溫度脅迫；基因

鼓槌石斛（Lindl.）為蘭科石斛屬附生植物，是藥典石斛的主要來源之一，其益胃生津、滋陰清熱，用于病后虛熱、口干煩渴、腫痛等[1]．鼓槌石斛野生資源有限，由于生長緩慢和過度采挖，其野生資源驟減，栽培產量也較低[2]．

低溫和高溫脅迫是常見的非生物脅迫．低溫會引起細胞膜損傷，造成代謝失調，活性氧積累[3]，同時激活信號分子，引起轉錄調控，使抗逆功能基因表達[4]．DREB/CBF途徑是低溫調控的主要通路[5]．MAPK、鈣調蛋白、CDPK和ICE轉錄因子等也是低溫響應基因[6]．高溫會改變細胞膜流動性，造成內穩態失衡，影響分子遺傳等功能[7]．等高溫耐受功能基因可以保護細胞膜、葉綠體和代謝等過程[8]．高通量測序技術用于大規模分析基因表達并識別基因功能和調控通路[9]．THOMASHOW[10]等利用基因芯片首次研究了擬南芥低溫脅迫響應基因．隨著測序技術的成熟，基于測序的轉錄組分析在該領域應用逐漸增多[11]．LI[12]等利用轉錄組研究了柳枝稷高溫脅迫響應分子機制．隨后，陸續報道了棉花、苦瓜和茶樹等相關的研究與分析[13]．鼓槌石斛春季開花，目前未見鼓槌石斛與溫度脅迫分子機制的相關報道，本文對鼓槌石斛花在低溫和高溫脅迫下轉錄組進行分析，識別差異表達基因，分析調控通路，為進一步揭示其脅迫應答分子機制提供基礎．

1　實驗部分

1.1　材料與處理

鼓槌石斛由生藥學實驗室提供，栽培基質為碎松樹皮+木屑（3∶1）．碎松樹皮源于四川松樹，取皮粉碎為3～6 mm碎片，以黑色塑料營養缽作為容器，放入人工氣候室（22℃，14 h光照/天）．開花后，選取花期一致的15顆植株，分為3組，分別為對照、低溫（4℃人工氣候室）處理和高溫（40℃人工氣候室）處理．1 h后，每組取5朵花，稱取相同質量，混樣后液氮冷凍．

1.2　測序

樣本提取總RNA，消化DNA，反轉錄．cDNA擴增產生150～200 bp的PCR產物，進行定量和純化．利用金唯智（GENEWIZ）公司Illumina IIx基因組分析系統進行32 nt單端轉錄組測序．利用Cutadapt（v1.9.1）軟件去除接頭序列，去除5’或3’末端質量值低于20或含N堿基，去除trim后reads長度低于75 bp的序列．

1.3　基因組裝與注釋

合并所有樣本數據后，利用Trinity（v2.2.0）軟件從頭組裝，序列聚類后進行序列拼接和冗余去除，得到非冗余長Unigene序列，統計序列數量與長度分布．利用BLAST軟件對Unigene進行Nr數據庫、SwissProt數據庫、GO數據庫、KEGG數據庫、COG數據庫注釋．

1.4　基因表達分析

利用FPKM值表示對應Unigene的表達量．使用Bioconductor軟件包的edgeR（v3.4.6）進行差異表達分析，差異基因表達變化2倍以上且qvalue≤0.05定義為差異顯著基因．采用GOseq法進行GO富集，顯著富集篩選標準為over_represented_pvalue≤0.05，KEGG顯著富集篩選標準為Qvalue<0.05．

2　結果與討論

2.1　測序與差異表達基因

對鼓槌石斛花對照、低溫處理和高溫處理3個樣本測序，去除低質量數據后，分別獲得28 776 626，39 813 750，31 544 116個Reads．3個樣本數據合并后，從頭組裝共獲得321 734條長的、非冗余單基因，平均長度526.98，GC含量39.02%．其中長度為200～500 bp的單基因數量最多，占總數的71.9%．利用Nr，COG，SwissProt，KEGG數據庫分別注釋了138 372，41 957，56 479，8 778條單基因，共141 464條單基因．

經計算得，低溫脅迫識別差異表達基因3 830個，其中上調（誘導）表達1 533個，下調（抑制）表達2 297個；高溫脅迫識別差異表達基因10 430個，其中上調表達4 422個，下調表達6 008個．結果表明，在2種脅迫下均有較大程度的基因表達量變化，高溫脅迫應答基因數量明顯多于低溫脅迫，2種脅迫下調表達基因數量均多于上調表達基因．

2.2　基于GO的基因功能分類

鼓槌石斛花低溫脅迫應答基因的顯著富集功能聚類分為三大類：生物過程、細胞組分和分子功能，分別有10，3，17個功能聚類．高溫脅迫三大類分別為13，6，11個．按照差異表達基因數量，分別列出每種聚類排名前5的類別，其中細胞組分只有3個類別（見表1～2）．結果表明，低溫脅迫在3種聚類的數量都少于高溫脅迫．低溫脅迫引起鼓槌石斛花“損傷應答”“細胞外區”“血紅素結合”等方面的應答．但“低溫應答”并未列入最顯著富集的30個聚類．高溫脅迫引起鼓槌石斛花“缺水應答”“核”“ATP結合”等方面的應答．同時分別有88和43個基因聚類在“熱脅迫應答”和“細胞對熱應答”，說明高溫脅迫引起鼓槌石斛花熱脅迫應答相關基因響應．

表1　鼓槌石斛花低溫脅迫應答基因的GO聚類分析

表2　鼓槌石斛花高溫脅迫應答基因的GO聚類分析

2.3　基于KEGG的基因調控通路分析

鼓槌石斛花低溫脅迫應答基因歸屬通路分為三大類：遺傳信息過程、代謝和細胞過程，分別有1，28，1個通路（見表3，圖1a）．鼓槌石斛花高溫脅迫應答基因歸屬通路分為四大類：環境信息過程、遺傳信息過程、代謝和細胞過程，分別有3，8，17，2個通路（見表4，圖1b）．按照差異表達基因數量，遺傳信息過程和代謝只列出排名前5的通路．結果表明，低溫脅迫中代謝過程是最主要的富集途徑，差異表達基因數量和占比最多；高溫脅迫中除代謝過程外，環境信息過程、遺傳信息過程和細胞過程的差異表達基因數量也較多．

表3　鼓槌石斛花低溫脅迫應答基因的KEGG聚類分析

表4　鼓槌石斛花高溫脅迫應答基因的KEGG聚類分析

圖1　鼓槌石斛花低溫、高溫脅迫應答基因的KEGG聚類分析

2.4　溫度脅迫相關基因表達分析

DREB/CBF（dehydration-responsive element-binding protein/C-repeat binding factor）途徑是植物最重要的低溫應答通路之一，本文識別了34個可能的CBF基因，但在低溫脅迫下均未顯著表達．列舉了在低溫脅迫下有一定程度差異表達的13個CBF基因（見表5）．其中，DN134227_c0_g1_i1，DN135743_c0_g2_i6在低溫脅迫下表達量有所升高；DN119624_c0_g1_i1，DN127127_c0_g3_i1，DN129406_c0_g1_i1，DN134227_c2_g1_i3，DN135743_c0_g2_i3，DN135822_c1_g10_i1，DN135822_c1_g1_i1，DN135822_c1_g5_i1，DN135822_c1_g8_i2，DN138346_c1_g2_i1，DN60230_c0_g1_i2在低溫脅迫下表達量有所降低，但均未達到顯著差異．

表5　鼓槌石斛花DREB/CBF基因在低溫脅迫下的相對表達量

根據基因功能聚類分析，識別了鼓槌石斛花高溫脅迫相關的差異表達基因（GO：0009408）．按照差異表達程度，列出排名前10的基因（見表6）．結果表明，鼓槌石斛花在高溫脅迫下誘導表達程度最高的10個基因均屬于熱激蛋白．

2.5　MAPK信號轉導途徑相關基因表達分析

MAPK是促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase）家族，按照級聯途徑分為MAPK，MAPKK，MAPKKK；按信號來源分類，分別逐級激活調控下游其他基因的表達．本文識別了188個可能的MAPK基因，其中在低溫脅迫中，3個上調表達，2個下調表達（見表7）；在高溫脅迫中，6個上調表達，12個下調表達（見表8）．結果表明，低溫脅迫對MAPK誘導較小，高溫脅迫對MAPK誘導較大．MAPKK9在2種溫度脅迫中都被誘導表達；MAPK10和MAPKKK1都被抑制表達．

表7　鼓槌石斛花低溫脅迫應答MAPK家族基因

表8　鼓槌石斛花高溫脅迫應答MAPK家族基因

3　結論

利用轉錄組測序對鼓槌石斛在低溫和高溫脅迫下的花進行基因表達分析，組裝獲得321 734個單基因，其中141 464個基因獲得注釋．低溫和高溫脅迫分別識別了3 830和10 430個應答基因．按照GO聚類的分析，“損傷應答”“細胞外區”“血紅素結合”等方面可能在鼓槌石斛花低溫脅迫應答起到重要作用，而“缺水應答”“核”“ATP結合”等方面可能在其高溫脅迫應答起到重要作用．同時，按照KEGG調控通路預測，代謝過程等方面在其溫度脅迫應答方面起到重要作用．

[1] 鄭司浩，黃林芳，陳士林．鼓槌石斛特異性PCR分子鑒定[J]．中草藥，2013，44（6）：744-748．

[2] 德英，馬潔，張麗霞，等．鼓槌石斛種質資源調查研究[J]．中國中藥雜志，2010，35（12）：1529-1532．

[3] DING Y L，SHI Y T，YANG S H．Advances and challenges in uncovering cold tolerance regulatory mechanisms in plants[J]．The New Phytologist，2019，222（4）：1690-1704．

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Identifying genes responsive to temperature stress inflower based on transcriptome analysis

CHEN Hongyu1，YU Ying2，LIFei1

（1. School of Pharmacy，2. School of Basic Medicine，Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China）

To understand the information of differentially expressed genes under temperature stress inflower．The transcriptome of flower under low temperature stress and high temperature stress were sequenced by Illumina sequencing technology．The results showed that there were 321 734 unigenes obtained，among which 141 464 unigenes were annotated by four databases．There were 3 830 and 10 430 responsive genes in low temperature stress and high temperature stress in．Among the regulated genes were members of the CBL，CBF，heat shock protein and so on．On thebasisthat result of gene regulation pathways，the low temperature stress responsive genes was correlated with response to wounding，extracellular region and heme binding．The high temperature stress responsive genes was correlated with response to water deprivation，nucleus and ATP binding in．Differences in gene expression may contribute to the observed mechanism of abiotic stress responsive in．

；transcriptome；temperature stress；gene

1007-9831（2023）11-0044-06

Q94

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2023.11.009

2023-06-07

貴州省科技計劃項目（黔科合基礎-ZK[2021]一般521）；貴州中醫藥大學博士啟動基金（貴中醫博士啟動[2020]19號，3043-043200019）

陳宏宇（1981-），男，黑龍江齊齊哈爾人，講師，博士，從事藥用植物學研究．E-mail：chy810501@163.com