電針預處理對心肌缺血再灌注損傷小鼠下丘腦腹內側核神經元活動的影響

陳翩翩,周 翔,周 杰,王帥亞,舒 琪,王茜伊,張 帆,胡 玲,2,余 情,2,蔡榮林

(1.安徽中醫藥大學針灸推拿學院,安徽 合肥 230012;2.安徽省中醫藥科學院針灸經絡研究所,安徽 合肥 230038;3.新安醫學教育部重點實驗室,安徽 合肥 230038)

經脈臟腑與腦相關研究是中西醫理論結合的突破口[1]。既往研究表明,電針心經經穴對缺血心肌具有明顯的保護作用[2-5],可以在中樞神經系統的調控下,通過神經—體液途徑有效改善心肌組織缺血、低氧的狀態[5-7],針刺調節心臟功能的作用與下丘腦和小腦等腦區的調控密切相關[3,8-10]。下丘腦腹內側核(ventromedial hypothalamic nucleus,VMH)是下丘腦結節區最大的核團,VMH的激活在情緒壓力中起著重要的作用,而情緒壓力會影響心血管疾病的發生和預后[11]。有研究[12-13]應用化學遺傳學方法調控VMH神經元,發現激活VMH可加重對心臟的損傷。然而,電針是否通過VMH發揮抗心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)尚不清楚。本研究擬采用多通道在體記錄技術,觀察電針預處理對MIRI小鼠VMH神經元電活動的影響,探討電針預處理改善MIRI的下丘腦調控機制,為經脈臟腑與腦相關研究提供新的實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物 8周齡健康雄性C57BL/6小鼠36只,購自濟南朋悅實驗動物育種有限公司[生產許可證號:SCXK(魯)2019-0003],適應性飼養7 d。籠內溫度控制為(24±1)℃,相對濕度60%,自然光線12 h明暗交替。實驗經安徽中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準(倫理審批號:AHUCM-mouse-2022083),實驗過程中嚴格遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》中相關規定對動物進行處置。

1.2 主要試劑 戊巴比妥鈉(批號 201201):北京化學試劑公司;小鼠抗c-fos(批號sc-166940):Santa Cruz公司;兔抗谷氨酸(批號 G6642)、兔抗γ-氨基丁酸(批號 A2052)、驢抗小鼠(批號 A0460)、山羊抗兔抗體(批號 A0423):Sigma公司。

1.3 主要儀器 SDZ-Ⅱ型華佗牌電子針療儀(SDZ-Ⅱ型):蘇州醫療用品廠有限公司;顱骨鉆(型號 F150S)、桌面型數字雙臂大鼠腦立體定位儀(型號 68028):深圳市瑞沃德生命科技有限公司;Plexon在體多通道信號采集處理系統(型號 OPX 010):美國Plexon;Powerlab多導生理記錄儀(型號 ML118):澳大利亞ADInstrument;微絲電極(16通道):美國Plexon公司。

2 方法

2.1 動物分組及電針預處理 將36只小鼠隨機分為假手術組、模型組、電針組,每組12只。電針組小鼠用一次性無菌針灸針(0.25 mm×13 mm,蘇州天協針灸器械有限公司)分別刺入雙側神門、通里穴2～3 mm,華佗牌SDZ-Ⅱ型電子針療儀電極輸出線夾持針柄,同側的神門和通里接同一對正負輸出線進行電針刺激,以電壓1 V、頻率2 Hz、小鼠肢體輕微抖動為度的連續波傳遞刺激,每次30 min,每日1次,共干預7 d。末次電針預處理結束后1 h內進行MIRI模型復制。

2.2 模型復制 小鼠按10 mL/kg劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉,仰臥固定,氣管插管后連接呼吸機。胸部心臟處皮膚脫毛后沿劍突約第3～4肋間縱行切開皮膚約1 cm,鈍性分離肌層并打開胸腔,使用眼科撐開器撐開肋骨暴露心臟,分離心包膜,找到小鼠冠狀動脈左前降支以10-0號無菌帶線縫合針由左至右穿過左前降支深部肌層,打活結結扎左前降支,缺血心肌壁呈現發紺、膨出表示結扎成功。結扎30 min后,松開結扎線再灌注120 min,左下冠狀動脈顏色由發紺變為淺暗或暗紅色,心電圖ST段回落1/2以上或T波下降0.2 mV以上,表明再灌注成功[14]。假手術組在開胸后不結扎冠狀動脈,而僅在相應部位用針空穿1次即可,其他操作同模型組。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 3組小鼠心電圖的采集、記錄與分析 Powerlab多導生理記錄儀記錄小鼠標準Ⅱ導聯心電圖,Chart軟件分析各組小鼠結扎前、結扎30 min、再灌注120 min時ST段電壓值的變化。

2.3.2 3組小鼠心肌組織病理變化 小鼠心肌組織采用蘇木精—伊紅(hemaxylin-eosin,HE)染色,顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

2.3.3 3組小鼠VMH中c-fos表達水平比較 小鼠心肌缺血再灌注120 min后,斷頭處理小鼠取腦,采用免疫熒光染色法觀察小鼠VMH中c-fos表達情況。另對模型組小鼠VMH中c-fos與谷氨酸、γ-氨基丁酸分別共染,觀察小鼠VMH中c-fos分別與谷氨酸、γ-氨基丁酸共表達情況。

2.3.4 3組小鼠VMH神經元電信號的采集與分析

(1)數據采集 模型復制后24 h后進行小鼠VMH神經元放電信號的采集。參照《小鼠腦立體定位圖譜》[15]確定VMH的定位(左右:±0.4 mm,前后:1.4 mm,深度:-5.6 mm)。以手動微推進器以步徑10 μm/s的速度緩慢將電極尖端推入VMH,待觀察到穩定的神經元放電后記錄5 min。

(2)數據分析 神經元活動采集由OmniPlex多通道采集系統記錄,記錄原始的寬頻帶數據,所有數據進行數字化儲存。通過Offline Sorter 3軟件將神經元放電歸類以SPK.pl2文件格式導出。采用Neuro Explorer 5.029軟件對Offline Sorter 3完成后導出的SPK.pl2文件分別進行分析,將獲得的處理過的神經元電信號進行自相關、能量頻譜(局部場電位)及光柵圖分析。根據放電頻率和自相關將VMH神經元分為中間神經元(抑制性神經元)和錐體神經元(興奮性神經元),一般中間神經元放電頻率較高,而錐體神經元放電頻率較低;中間神經元的自相關圖中有多個等間隔波峰,而錐體神經元放電間隔呈中短而尖的單個波峰,具有明顯的簇狀放電特性[16]。

3 結果

3.1 3組小鼠心電圖ST段電壓值比較 與假手術組比較,模型組小鼠結扎30 min及再灌注120 min時ST段電壓值均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,電針組小鼠結扎30 min及再灌注120 min時ST段電壓值均顯著降低(P<0.05)。見圖1。

注:與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.2 3組小鼠心肌組織形態比較 假手術組小鼠心肌細胞的橫切面形態正常,排列整齊,著色均勻,走向一致,細胞核位于心肌細胞中央,心肌組織結構未見異常;與假手術組比較,模型組小鼠心肌細胞間隙增大,染色不均勻,走向紊亂且伴心肌細胞斷裂,可見心肌細胞間質水腫、大量炎癥細胞;與模型組比較,電針組小鼠心肌細胞輪廓基本完整,細胞橫向斷裂的現象減少,小部分細胞可見水腫,炎癥細胞減少。見圖2。

圖2 3組小鼠心肌組織病理形態學觀察(HE染色,10×50倍)

3.3 3組小鼠VMH中c-fos表達水平比較 與假手術組比較,模型組小鼠VMH中c-fos陽性細胞數顯著增加(P<0.05);與模型組比較,電針組小鼠VMH中c-fos陽性細胞數顯著減少(P<0.05)。模型組小鼠VMH免疫熒光雙染結果顯示,激活的c-fos與谷氨酸能神經元的共表達量高于與γ-氨基丁酸能神經元的共表達量(P<0.05)。見圖3、圖4。

注:A.假手術組;B.模型組;C.電針組;與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;紅色為c-fos陽性細胞

注:A.γ-氨基丁酸能神經元數/c-fos陽性細胞數;B.谷氨酸能神經元數/c-fos陽性細胞數;與A比較,△P<0.05;綠色為谷氨酸能神經元或γ-氨基丁酸能神經元,紅色為c-fos陽性細胞

3.4 3組小鼠VMH神經元電活動比較 與假手術組比較,模型組小鼠VMH錐體神經元放電次數顯著增加(P<0.05),中間神經元放電次數顯著減少(P<0.05);與模型組比較,電針組小鼠VMH錐體神經元放電次數顯著減少(P<0.05),中間神經元放電次數差異無統計學意義(P>0.05)。頻譜能量圖顯示,與假手術組比較,模型組小鼠VMH神經元局部場電位頻譜能量增強;與模型組比較,電針組小鼠VMH神經元局部場電位頻譜能量降低。光柵圖顯示,與假手術組比較,模型組小鼠VMH神經元放電頻率較為密集;與模型組比較,電針組小鼠VMH神經元放電頻率較為疏散。見圖5。

注:A.假手術組;B.模型組;C.電針組;與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;Ⅰ.小鼠VMH錐體神經元放電次數;Ⅱ.小鼠VMH中間神經元放電次數;Ⅲ.小鼠VMH神經元放電光柵圖;Ⅳ.小鼠VMH神經元頻譜能量分析圖

4 討論

心肌缺血是導致冠心病患者死亡的主要原因之一,早期治療可通過恢復缺血心肌的血液供應,降低死亡風險。然而,當中斷的心肌血液供應在一定時間內恢復時,會對原有缺血的心肌造成再灌注損傷[17]。“神門”是手少陰心經的原穴,《靈樞·九針十二原》:“五藏有疾,當取之十二原”。原穴在疾病診治中發揮重要作用,其不僅是針灸臨床的常用腧穴,也是目前腧穴效應規律及作用機制等研究所選用的重要腧穴。因此,神門穴是治療心臟疾病的重要穴位。

下丘腦是大腦重要的高級中樞,可調節包括心臟在內的眾多臟器功能。VMH可調節外周交感神經系統的活動,交感神經系統與心血管疾病的發生發展密切相關[18]。研究發現,電刺激或化學遺傳病毒激活VMH可引起心臟收縮性增強[19],增加交感神經系統的活動及心臟結構的變化[12-13,20],證實了該核團與心血管系統關系密切。c-fos基因是一種即時早期基因,VMH中c-fos對特定刺激(如電針)早期即有較靈敏的反應。本研究發現,MIRI小鼠VMH中c-fos表達量較假手術組顯著增加;電針預處理的MIRI小鼠VMH中c-fos表達量顯著降低,表明電針預處理可通過抑制VMH神經元活動減輕心肌缺血損傷。

本研究通過在體多通道技術實時記錄了小鼠VMH神經元的放電情況。研究結果發現,小鼠心肌缺血再灌注后,VMH中間神經元放電次數減少,且伴隨有錐體神經元放電次數顯著升高,而電針預處理小鼠VMH椎體神經元放電次數顯著減少,表明針刺效應的發揮可能主要由興奮性神經元所介導。研究[21-22]表明,針灸的作用與特定腦區中谷氨酸、γ-氨基丁酸等神經遞質的調節密切相關,這可能是針灸調節內臟功能的重要機制。谷氨酸是中樞神經系統中重要的興奮性神經遞質[23]。研究[24]表明,VMH神經元主要為谷氨酸能神經元。本研究結果也表明,MIRI小鼠VMH中谷氨酸表達量明顯高于γ-氨基丁酸,VMH中谷氨酸能神經元參與了MIRI,針刺預處理可能通過抑制VMH中谷氨酸能神經元活動發揮對心肌的保護作用。本研究還發現,在電針的干預下,小鼠VMH中興奮性神經元放電次數較模型組顯著減少(P<0.05),抑制性神經元放電次數與模型組的差異無統計學意義(P>0.05)。另外,頻譜能量圖顯示,與模型組比較,電針后小鼠VMH中局部場電位頻譜能量顯著降低;光柵圖也顯示電針后小鼠VMH神經元放電頻率較為疏散,再次驗證了VMH可能參與電針預處理抗MIRI的效應機制。因此,可以認為由心肌缺血再灌注導致的心肌損傷可能與VMH抑制性神經元放電活動的異常降低密切相關,且針刺可以通過調控興奮性神經元發揮針刺效應,這與本次免疫熒光染色實驗得出的結論是一致的。

綜上所見,電針預處理可有效減輕MIRI,降低小鼠VMH錐體神經元放電頻率,表明VMH神經元活動在針刺調節心臟功能效應中發揮著重要的作用,且谷氨酸能神經元可能是其發揮作用的重要靶點。