半胱氨酸蛋白酶抑制劑S 與傳統腫瘤標志物在胃腸癌中的診斷價值比較

周愛群，張志勇，方全鋼，曾黎峰，劉燕鳴，孔維莉

（江西省人民醫院（南昌醫學院第一附屬醫院）檢驗科，江西 南昌 330006）

胃癌和結直腸癌是兩類嚴重危害人類公共健康的疾病， 死亡率在所有癌癥中分別高居第四位和第三位[1-3]。 盡管手術治療和聯合治療技術有所進步，但由于腫瘤復發、轉移和出現化療抵抗，胃癌和結直腸癌的預后仍然不夠理想[4]。 早期診斷和治療對于提高手術成功率和患者生存率至關重要，因此亟需探討新的胃腸癌早期診斷指標。

近年來， 越來越多的研究發現半胱氨酸蛋白酶抑制劑S（CST4）與胃腸癌關系密切[5]。 Yaling Dou 等[6]研究發現CST4 在胃腸癌組織和細胞中高表達并首次建立了血清CST4 濃度檢測的酶聯免疫吸附法（ELISA）。 Choi EH 等[7]發現CST4 基因在胃癌細胞中高表達并且與胃癌發生密切相關。 Yi Qiang Zhang 等[8]研究發現CST4 在胃癌組織和細胞中高表達并深入研究了CST4 在胃癌轉移過程中的ELFN2 信號通路的作用機制。

為探討血清CST4 的臨床診斷價值，本研究利用血清CST4 檢測試劑盒檢測經臨床病理確診的胃腸癌患者血清CST4 濃度，并與正常對照組和傳統胃腸癌腫瘤標志物比較， 為胃腸癌的早期診斷和治療提供新的檢查手段。

1 材料和方法

1.1 研究材料 共120 例血清樣本。采集2019 年1月至12 月來江西省人民醫院就診的80 例經臨床病理確診的胃腸癌患者（胃癌40 例，結直腸癌40例） 術前和40 例正常體檢人群空腹靜脈血2 mL，待血液凝固后及時分離血清-80 ℃凍存。所有胃腸癌病例參照美國癌癥聯合會（AJCC）在2017 年發布的第八版TNM 分期。 本研究通過了本院倫理委員會的審核批準。 各組病例臨床資料詳見表1。 三組年齡、性別差異無統計學意義（P>0.05）。

表1 各組血清樣本臨床病例資料統計表

1.2 主要試劑 人半胱氨酸蛋白酶抑制劑S（CST4）檢測試劑盒（酶聯免疫法），上海良潤生物醫藥科技有限公司生產。 CEA、CA19-9、CA125 化學發光法檢測試劑（羅氏生產）。

1.3 主要儀器 全自動酶標儀（BioTek Elx800）、全自動酶標洗板機（PW-960）。 全自動化學發光免疫分析儀（羅氏E601）。

1.4 研究方法

1.4.1 血清CST4 的檢測 嚴格按照試劑盒說明書操作。從4 ℃冰箱取出所需人份的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑S（CST4）檢測試劑盒（酶聯免疫法），平衡至室溫；將待檢血清從-80 ℃冰箱取出解凍平衡至室溫待檢。 每板設置7 個濃度校準品及1 個質控孔， 加入100 μl 校準品和質控品， 再依次加入100 μL 待檢血清，37 ℃水浴箱孵育1 h；全自動洗板機洗板5 次后每孔加入100 μL 酶標抗體，37 ℃水浴箱孵育1 h；全自動洗板機洗板5 次后每孔加入配置好的100 μl 底物液，37 ℃水浴箱避光顯色15 min，最后加入100 μl 終止液終止反應。 利用酶標儀15 min 內完成比色測定各孔OD 值，繪制標準曲線并計算各個樣本濃度值。

1.4.2 血清CEA、CA19-9、CA125 濃度檢測 按照全自動化學發光免疫分析儀的標準操作流程檢測。

1.4.3 繪制受試者工作特征（ROC）曲線評價CST4在胃腸癌中的診斷價值。

1.4.4 統計學處理 全部資料采用SPSS 17.0 統計軟件包進行統計分析。 呈正態分布的計量資料以±s表示， 非正態分布的計量資料用M（P25，P75）表示；正態性連續資料用單因素方差分析，兩兩比較用最小顯著性差異法分析。 非正態性連續資料用非參數檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清CST4 測定結果 采用SPSS 17.0 統計軟件對各組血清CST4 測定結果進行夏皮洛-威爾克（S-W）檢驗和直方圖分析，結果發現數據不服從正態分布， 故采用兩樣本Mann-Whitney U檢驗，結果見表2。

表2 胃癌組、結直腸癌組和正常對照組血清CST4 濃度比較（U/L）

2.2 CST4 對胃腸癌的早期診斷價值 按試劑盒說明書參考范圍確定各指標的陰陽性結果， 分別計算各指標在胃腸癌早期（Ⅰ期和Ⅱ期）中的陽性檢出率，結果發現CST4 在胃腸癌早期中的陽性檢出率均達26.9%，高于傳統腫瘤標志物CEA、CA19-9和CA125，結果見表3。

表3 胃腸癌早期（Ⅰ期和Ⅱ期）各檢測指標陽性檢出率比較

2.3 CST4 在胃腸癌中的診斷價值及與傳統腫瘤標志物的比較 利用SPSS 17.0 統計軟件繪制各指標受試者工作特征（ROC）曲線。結果顯示，CST4、CEA、CA19-9、CA125 對胃癌預測的AUC分別為0.755（95%CI：0.649~0.861，P<0.001）、0.628（95%CI：0.505~0.750，P<0.05）、0.647 （95%CI：0.524 ~0.720，P<0.05）、0.615（95%CI：0.493~0.738，P>0.05）；對結直腸癌預測的ROC曲線下面積(AUC) 分別為0.754（95%CI：0.650~0.859，P<0.001）、0.666 （95%CI：0.549~0.784，P<0.05）、0.661（95%CI：0.540~0.781，P<0.05）、0.504（95%CI：0.373~0.635，P>0.05）。 可見，CST4 對胃腸癌預測的AUC均高于傳統腫瘤標志物，診斷價值優于傳統腫瘤標志物。結果見圖1。

圖1 胃癌（A）及結直腸癌（B）血清腫瘤標志物受試者工作特征曲線（ROC）分析

2.3 CST4 在胃腸癌的診斷性能評估及與傳統腫瘤標志物比較 胃腸癌組所有病例以病理診斷結果為金標準，分別計算各指標檢測臨床靈敏度、特異性、PLR、NLR、PPV 和NNV。 結果發現，CST4 的所有檢測性能指標均優于CEA、CA19-9 和CA125。利用SPSS 17.0 統計軟件包對CST4 和傳統腫瘤標志物的靈敏度和特異性進行配對χ2檢驗， 發現CST4 檢測靈敏度與CA125 比較差異有統計學意義（胃腸癌組分別為χ2=4.923，P<0.05 和χ2=8.1，P<0.05），結果分別見表4 和表5。

表4 血清CST4 對胃癌診斷性能及與傳統腫瘤標志物的比較

表5 血清CST4 對結直腸癌診斷性能及與傳統腫瘤標志物的比較

2.4 CST4 對胃腸癌預后價值的評估 為了評估CST4 對胃腸癌預后判斷價值， 我們比較了胃腸癌晚期（Ⅲ+Ⅳ期）和早期(Ⅰ期和Ⅱ期)CST4 的水平，采用Kruskal-Wallis H檢驗， 結果發現胃腸癌Ⅲ+Ⅳ期CST4 中位數分布水平均高于胃腸癌Ⅰ期和Ⅱ期， 其中胃癌Ⅲ+Ⅳ期CST4 水平與胃癌Ⅰ期和Ⅱ期比較差異有統計學意義（χ2=7.817，P<0.05）。結果分別見圖2 和表6。

圖2 胃腸癌不同分期CST4 水平(U/L)分布比較

表6 胃腸癌不同分期CST4 水平分布（U/L）比較

3 討論

半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cystatins，CSTs）是一類對半胱氨酸蛋白酶具有抑制作用的蛋白家族[9-10]，越來越多的研究發現CSTs 與腫瘤的發生發展密切相關，CSTs 在腫瘤的生長[11-12]、血管生成[13]、浸潤[14]和轉移[15]中起重要作用，具有作為腫瘤診斷和預后評估標志物的潛力。

胃腸癌傳統腫瘤標志物有CEA[16]、CA19-9[17-18]、CA125[19]等，但是這些指標的靈敏度和特異性都不夠理想。 本研究發現胃腸癌組血清CST4 水平顯著高于正常對照組， 且差異具有統計學意義， 提示CST4 可作為一項新的胃腸癌腫瘤標志物。 我們比較了各指標在胃腸癌早期（Ⅰ期和Ⅱ期）中的陽性檢出率， 結果發現CST4 早期陽性檢出率均高于CEA、CA19-9 和CA125，提示CST4 有望用于胃腸癌的早期篩查， 有利于胃腸癌的早期診斷和早期治療。

通過繪制ROC曲線分析， 我們發現胃腸癌組CST4 的AUC均高于傳統腫瘤標志物，結果與學者吳明蘭等[20]和石夢珍等[21]一致；比較發現胃腸癌組CST4 的靈敏度、 特異性、PLR、NLR、PPV 和NNV等指標均優于傳統腫瘤標志物，且與CA125 比較，靈敏度差異有統計學意義；以上結果提示CST4 對胃腸癌具有更好的診斷價值和性能。

通過分析胃腸癌不同分期的CST4 水平，發現胃腸癌晚期病人CST4 水平高于早期病人，提示CST4水平與胃腸癌進展有關， 有可能用于胃腸癌預后評估。 為了進一步研究CST4 預后評估和療效判定的臨床應用價值， 我們擬加強各期病例數收集，同時動態監測患者術后的血清CST4 濃度，為CST4 的臨床應用價值研究提供更全面的數據和資料。

綜上，胃腸癌血清CST4 濃度顯著高于正常對照組， 其診斷價值和檢測性能均優于傳統腫瘤標志物， 極有可能成為一項新的胃腸癌早期診斷標志物。