脂類和補體聯合檢測在肺結核鑒別診斷中的應用價值*

鄒 琛,張 潔,曹 蕓,張 泓,張舒林,徐潤灝△

1.上海交通大學醫學院附屬兒童醫院檢驗科,上海 200062;2.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院檢驗科,上海 200001;3.上海交通大學醫學院免疫學與微生物學系,上海 200025;4.上海市公共衛生臨床中心結核病研究中心,上海 201508

結核病是威脅人類健康的主要傳染病之一,據世界衛生組織發布的《2022年全球結核病報告》顯示,2021年約160萬人因結核病死亡[1]。我國的結核病發病總數位居全球第二,國家衛生健康委員會發布的《2021年全國法定傳染病疫情概況》中指出,在我國的乙類傳染病中,肺結核發病人數、死亡人數均位居第2[2]。由此可見,結核病尤其是肺結核的早診早治仍是我國面臨的巨大挑戰。

肺結核患者臨床表現及影像學檢查缺乏特異性,早期不易與肺炎、肺癌等其他肺部疾病區分[3-4]。血液中各類成分眾多,其中不少蛋白、代謝物、微小RNA在肺結核發生過程中發生顯著變化[5-6],因此血液學檢查被認為在肺結核輔助診斷和鑒別診斷中有著巨大潛能。依托于前期進行的血漿蛋白組學分析,在本研究中,筆者進一步檢測了肺結核患者血漿中的載脂蛋白(Apo)A1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3、脂蛋白a[Lp(a)]、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、小而密低密度脂蛋白膽固醇(sdLDL-C)、游離脂肪酸(NEFA)這12個脂類項目,以及補體C1q(C1q)、補體C3(C3)、補體C4(C4)、總補體活性(CH50)這4個補體項目,共16項臨床常用指標,以探索其在肺結核鑒別診斷中可能存在的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年5月至2021年10月在上海市公共衛生臨床中心及上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院就診的肺部疾病患者252例為研究對象,其中肺結核初治患者85例(TB組),非小細胞肺癌(NSCLC)初治患者87例(NSCLC組),社區獲得性肺炎(CAP)初治患者80例(CAP組)。TB組中男48例、女37例,年齡25～80歲,平均(59.51±13.08)歲,納入標準:通過患者的臨床表現、影像學診斷、病原學診斷,根據《肺結核診斷》標準[7],確診為肺結核,并排除肺外結核、肺部惡性腫瘤、合并其他嚴重感染的可能。NSCLC組中男53例、女34例,年齡27～82歲,平均(62.76±10.59)歲,納入標準:經影像學和組織病理學檢查確診為NSCLC,排除同時伴有肺結核的可能;CAP組中男44例、女36例,年齡25～83歲,平均(62.23±14.47)歲,納入標準:臨床診斷為肺部感染,排除同時伴有肺結核的可能。同時選取上海市公共衛生臨床中心及上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院的90例體檢健康者作為對照組,其中男52例、女38例,年齡25～82歲,平均(60.48±12.74)歲,納入標準:排除肺部腫瘤及感染,且肝、腎功能等指標無明顯異常。各組均排除血脂異常者、并發其他部位腫瘤者、自身免疫疾病患者等。各組年齡和性別比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究通過上海市公共衛生臨床中心倫理委員會批準(2019-S009-02)。

1.2方法

1.2.1樣本前處理 使用乙二胺四乙酸抗凝管收集各組患者的空腹全血標本3 mL,2 685×g離心10 min,分離得到血漿,置于-80 ℃超低溫冰箱中保存待測,避免反復凍融。

1.2.2樣本檢測 采用H7600全自動生化分析儀(日本Hitachi公司)對ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3、Lp(a)、TC、TG、HDL-C、LDL-C、sdLDL-C、NEFA、C1q、CH50進行檢測。其中ApoA1、ApoB、Lp(a)試劑盒購于四川邁克生物股份有限公司;ApoA2、ApoC2、ApoC3試劑盒購于北京利德曼生化股份有限公司;C1q試劑盒購于寧波美康生物科技有限公司,檢測方法均為免疫比濁法。TC、TG、HDL-C、LDL-C、CH50試劑盒購于日本富士膠片和光純藥株式會社,TC的檢測方法為膽固醇氧化酶法,TG的檢測方法為去游離甘油法,HDL-C的檢測方法為抗體阻礙法,LDL-C的檢測方法為選擇保護法,CH50的檢測方法為脂質體免疫測定法。sdLDL-C試劑盒購于北京柏定生物工程有限公司,檢測方法為過氧化氫酶法。NEFA試劑盒購于德賽診斷系統有限公司,檢測方法為酶比色法。采用BNII全自動特定蛋白分析儀(德國SIMENS公司)及其配套試劑盒對C3、C4進行檢測,檢測方法為免疫比濁法。

2 結 果

2.1各組不同指標水平比較 TB組血漿ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA水平低于對照組(P<0.05),Lp(a)、C3、C4水平高于對照組(P<0.05);TB組血漿ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3、TC、TG、HDL-C、LDL-C、NEFA、C3水平低于NSCLC組和CAP組(P<0.05),此外sdLDL-C、C1q水平僅低于NSCLC組(P<0.05),CH50水平高于CAP組(P<0.05),見表1。

表1 各組不同指標水平比較或M(P25,P75)]

2.2各項指標鑒別診斷肺結核效能的評估 ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3、TC、TG、HDL-C、LDC-C、NEFA、C3這11項指標在TB組與NSCLC組,TB組與CAP組中的比較,差異均有統計學意義且變化趨勢一致,將NSCLC組、CAP組合并為非結核病組(NTB)組,采用ROC曲線分析其對肺結核的鑒別診斷效能。鑒別診斷效能最佳的指標是ApoB,其曲線下面積(AUC)為0.799,靈敏度為74.12%,特異度為77.84%。見表2。

表2 各項指標及模型鑒別診斷肺結核的效能分析

2.3肺結核鑒別診斷模型的構建和驗證

2.3.1模型的建立 隨機抽取80%的標本,即TB組68例及NTB組133例(其中NSCLC組69例、CAP組64例),組成訓練標本。將上述11項指標納入逐步法二元Logistic回歸分析,最終得到了由ApoB、C3、HDL-C和NEFA構成的鑒別診斷模型Y=1/[1+eLogit(P)],式中Logit(P)=-5.29×ApoB-1.954×C3-2.333×HDL-C-1.903NEFA+9.32,見表3。模型系數綜合檢驗(χ2=183.06,P<0.05)和Hosmer-Lemeshow檢驗(χ2=9.427,P<0.05)結果顯示,模型擬合度良好。見表3。

表3 逐步法二元logistic回歸分析結果

2.3.2模型的效能分析 以模型Y作為新變量進行ROC曲線分析,其鑒別診斷肺結核的AUC為0.868(95%CI0.813～0.911),靈敏度為70.59%,特異度為89.47%,符合率為83.08%,見表2。

2.3.3模型的驗證 將剩余標本(TB組17例、NTB組34例)作為驗證標本,代入模型Y進行驗證。驗證標本中,TB組13例和NTB組29例判斷正確,靈敏度為76.47%,特異度為85.29%,符合率為82.35%。與訓練樣本的診斷符合率基本相同。

2.4鑒別模型與部分現有檢測方法的比較 將TB組68例及NTB組133例(其中NSCLC組69例、CAP組64例)患者的痰涂片抗酸染色結果、結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)結果與本研究得到的4項指標鑒別模型(ApoB+HDL-C+NEFA+C3)結果進行比較,其中抗酸染色的特異度最高(100.00%),其次為鑒別模型(88.62%);T-SPOT.TB的靈敏度最高(89.41%),其次為鑒別模型(71.76%)。此外,鑒別模型有著最高的總符合率(82.94%)。見表4。

表4 鑒別模型與部分現有檢測方法的比較

3 討 論

目前,高誤診率仍是我國肺結核診治中的難點,尤其是在部分社區醫療單位中,肺結核易被誤診為肺癌及肺炎。這是由于越來越多肺結核患者的病灶形態不典型,在胸部CT和X光檢查時缺乏特異性征象所致,且其早期臨床表現多為咳痰、發熱、咯血等,與其他肺部疾病極為相似[8-9]。結核分枝桿菌培養雖然是診斷結核病的金標準,但其靈敏度低,培養時間長,給疾病的診斷、治療帶來了較大難度[5]。血液學檢查有著簡便、快速、無創、高效的特點,T-SPOT.TB等γ-干擾素釋放試驗作為常用的肺結核血液學檢查手段,有著較高的靈敏度,但其診斷肺結核的特異度較低[10],而多項血液指標聯合檢測能夠提升診斷的靈敏度及特異度,可能成為肺結核輔助診斷與鑒別診斷的新方向。

本研究顯示,與對照組比較,TB組血漿TC、HDL-C、LDL-C水平均降低,與HAN等[11]的研究結果一致。膽固醇在血液中常以脂蛋白的形式存在,主要為HDL-C和LDL-C。目前的研究結果顯示,肺結核的發生、發展與膽固醇代謝有著密切聯系[11-12]。有研究發現結核分枝桿菌感染的巨噬細胞內膽固醇酰基轉移酶水平會明顯升高,導致細胞內有更多的游離膽固醇酯化,形成過多脂滴,這些脂質在巨噬細胞內大量堆積,打破了機體脂代謝的動態平衡,這被認為是肺結核患者血漿各類膽固醇水平降低的原因[12-13]。也有觀點認為膽固醇代表著個體免疫力水平,膽固醇水平低下導致感染肺結核的風險增加,而結核感染后機體免疫力的下降,會使得血液中膽固醇進一步減少[14],鄭秀麗等[15]的研究結果顯示,高膽固醇飲食輔助治療后,肺結核患者的血清白蛋白水平升高,痰液結核桿菌轉陰率和肺部病灶吸收率也升高,病情逐步好轉。

本研究發現TB組患者血漿ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3這5項Apo水平降低,與CHEGOU等[16]及LIU等[17]的部分研究結果一致。Apo的主要功能是運輸脂類到各組織進行代謝,具有水平穩定、進食后變化小、個體變異性低的特點[18]。其中ApoA1和ApoA2等是HDL-C中蛋白質的主要組成部分,ApoB則是LDL-C中蛋白質的主要組成部分,由于HDL-C及LDL-C等膽固醇在TB組患者血漿中水平降低,各類Apo水平亦同步降低。另據研究報道,機體在營養不良時,血漿Apo水平降低明顯[19],可見肺結核繼發的營養不良也可能是各類Apo水平較低的原因。值得注意的是,與TB組相反,ApoB在NSCLC組和CAP組血漿中水平升高(P<0.05),因此其在本研究納入的所有指標中有著最大的AUC,據此筆者認為ApoB在鑒別診斷肺結核中有著較大的潛能。

此外,本研究還發現TB組患者NEFA水平降低。脂肪酸是結核分枝桿菌的重要營養物質之一,人體內被結核分枝桿菌感染的巨噬細胞可以通過清道夫受體介導的Apo內化作用攝取血液來源的脂肪酸,胞內的結核分枝桿菌借機利用這些脂肪酸維持其在細胞中的生存,而細胞外的結核分枝桿菌則很可能從血液中的各類Apo處獲得脂肪酸[20-22]。這被認為是宿主血漿中的NEFA水平降低的原因。

越來越多的補體因子被認為和肺結核的發生有著明顯聯系,有學者認為某些基因突變會導致C3等補體因子水平升高,從而增加結核易感性[23],同時隨著結核患者組織損傷、肉芽腫和空洞形成等疾病進程的出現,血漿C3、C4等補體因子水平會進一步升高[24-25],這與本研究結果相符。需要指出的是,雖然本研究發現血漿C3、C4等補體因子在TB組血漿中水平升高,但這些補體因子在NSCLC組和CAP組中亦呈高表達,最終本研究發現只有C3對肺結核有一定的鑒別診斷價值。

本研究基于現有的標本,通過逐步法二元Logistic回歸建模并消除多重共線性,最終得到由ApoB、C3、HDL-C、NEFA組成的輔助鑒別診斷模型(AUC為0.868),相較于現有的肺結核血液學檢測方法T-SPOT.TB,上述4項指標組成的鑒別診斷模型有著更高的特異度和總符合率。目前,在肺結核與其他肺部疾病的鑒別診斷中,一些常見血液學指標的變化往往沒有引起人們的重視。就目前的診斷技術而言,單一的血液學指標確實難以對肺結核等疾病進行精確判斷,而最佳指標組合的概念彌補了這一缺陷,通過不同的算法將各類差異指標聯用,能夠得到由最佳指標組合構成的診斷模型,納入的指標類型越全面,模型的診斷效能則越出色,這可能是肺結核等疾病未來診斷的趨勢。在脂類和補體方面,本研究納入了16項指標,發現脂類指標ApoB、HDL-C、NEFA及補體指標C3參與組成的模型有著輔助鑒別診斷肺結核的潛能,這4項指標的檢測有著成熟的試劑盒,在臨床較為普及,或許可以與影像學檢查、病原學檢查互補,提高診斷的準確性。不過,脂類、補體指標的類型較為單一,其診斷效能存在一定的上限,若期望在診斷效能上繼續突破,還可加入細胞因子類、氨基酸類、微小RNA類等已被證實在肺結核患者血液中異常表達的指標,筆者也將對此進行深入探索。另一方面,血液指標聯用對肺結核輔助鑒別診斷的價值在國內外均處于探索階段,因此,本文結論還需大樣本、多中心研究加以驗證。