miR-335-5p過表達對胃癌基因表達譜的影響及篩選基因的驗證研究*

王宏偉,趙雪靈,王 蒙,高夏青,陳鳳琴,寧 月,李海龍△

1.甘肅中醫藥大學附屬醫院檢驗科,甘肅蘭州 730020;2.甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院,甘肅蘭州 730101;3.甘肅中醫藥大學附屬醫院功能科,甘肅蘭州 730020

微小RNA(miR)-335位于染色體7q32.2,在胃癌的發生、發展中發揮了重要作用[1]。有報道指出,miR-335-5p在胃癌組織中表達下調,與其啟動子甲基化有關[2]。miR-335-5p抑制胃癌細胞的增殖和遷移,并誘導細胞凋亡,把胃癌細胞周期阻滯在G1/S期[1]。臨床病理分析顯示,miR-335低表達可能與胃癌發生發展有關,可一定程度評估患者預后[3]。為深入探明其調控胃癌細胞生物學行為的機制,本研究構建了miR-335-5p過表達慢病毒載體并感染胃癌細胞,然后選擇人類全基因組表達譜芯片篩選過表達miR-335-5p的胃癌細胞與對照細胞之間差異表達的mRNA,并采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白質印跡法(Western blot)驗證。

1 材料與方法

1.1材料來源 胃癌細胞MGC-803購自中科院上海細胞庫。靶基因環腺苷酸反應元件結合蛋白1(CREB1)、蘇氨酸激酶3(AKT3)、外被體包被蛋白β2亞基(COPB2)、芳香烴受體核易位蛋白2(ARNT2)、轉化生長因子(TGF)-β2、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、血小板源性生長因子-β(PDGF-β)、GAPDH、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(二抗)購自Immunoway生物科技有限公司。

1.2儀器與試劑 電泳和濕轉儀(美國Bio-rad公司、DYCZ-24D),酶標儀(美國Molecular Devices公司、SpectraMax i3X),凝膠成像儀(廣州博鷺騰生物科技有限公司、GelView 6300Plus),PCR擴增儀(美國ABI公司、ABI7500)。BCA試劑、配膠試劑購自北京索萊寶科技有限公司;增強型ECL發光試劑購自上海熠圣生物科技股份有限公司;miR-335-5p的過表達和陰性對照慢病毒載體由上海吉凱基因技術有限公司采用GV369載體合成,克隆位點為BamHNheⅠ;miDETECTA Track miRNA qRT-PCR starter kit購自廣州銳博生物有限公司;逆轉錄試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司;高糖DMEM培養基(美國Hyclone公司),胎牛血清(杭州四季青公司),青鏈霉素雙抗(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養 在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中加入青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 U/mL),在37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中常規培養。每隔2～3 d換完全培養基,待細胞密度達90%左右時按1∶2比例傳代。取對數生長期的細胞用于下一步實驗。

1.3.2慢病毒載體感染胃癌細胞 培養胃癌MGC-803細胞至對數生長期,消化細胞后用含有10%FBS的高糖DMEM培養基重懸細胞后計數,調成單細胞懸液,接種在6孔板中,置于37 ℃培養箱中備用。待過夜后的細胞生長至40%～50%時,用感染增強液稀釋配備1×108TU/mL的病毒液。取10 mg/mL polybrene以DMEM培養基稀釋至終濃度為5 μg/mL(指1 mL感染時體積),備用。在6孔板中采用1×108TU/ mL的病毒液感染胃癌細胞,將培養體系混勻后繼續培養8～12 h后,觀察細胞狀態,并更換為新鮮的培養基。感染72 h后,觀察熒光表達情況并拍照,消化細胞接種至細胞培養瓶繼續培養。待細胞生長至70%～80%時,消化傳代培養,收集部分細胞,提取RNA,逆轉錄后,擴增并計算miR-335-5p水平,以確定感染后細胞內miR-335-5p水平。

1.3.3MTT法檢測過表達miR-335-5p對胃癌細胞增殖的影響 將穩轉miR-335-5p和陰性對照的MGC-803細胞培養至對數生長期,收集細胞后用不含有胎牛血清的高糖DMEM培養基重懸細胞后計數,調成單細胞懸液,以200 μL體積加入96孔板,使細胞數為5 000個/每孔,置于37 ℃培養箱過夜備用。待24、48、72、96 h后每組每孔加入MTT 20 μL,繼續孵育4 h,吸去上清液,每孔加入二甲基亞砜150 μL,振蕩10 min,用酶標儀以570 nm波長檢測各孔吸光度(A)。按A值計算各組的平均值,實驗重復3次。

1.3.4Transwell小室檢測過表達miR-335-5p對胃癌細胞的遷移能力的影響 將成功轉染miR-335-5p的胃癌細胞用不含血清的培養液制成5×104/mL的懸液,取200 μL加入Transwell上室中,在下室中加入500 μL含有10%胎牛血清的培養基。細胞在37 ℃下培養48 h。將小室內的培養基丟棄,加適量預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)將細胞洗滌2次,添加足夠的4%細胞固定液將小室下側細胞固定2 min,將固定液倒掉并用PBS洗滌2次,隨后用100%甲醇固定,25 min后將甲醇倒掉并用適量的PBS將細胞洗滌2次,加0.1%的結晶紫在避光條件下進行20 min染色,結晶紫染液倒掉并用足量PBS洗滌細胞2次,隨后用棉簽小心將小室內側細胞拭去,常溫下放置30 min,待其風干后于光學顯微鏡下觀察拍照。隨機選取3個視野進行拍照,以穿過小室細胞數代表細胞數量的遷移能力。

1.3.5表達譜芯片篩選過表達miR-335-5p后胃癌細胞差異表達的基因 將穩轉miR-335-5p和陰性對照細胞培養至對數生長期,收集細胞后提取總RNA,采用Agilent mRNA表達譜芯片雜交分析,使用晶芯?cRNA擴增標記試劑盒進行樣品RNA的熒光標記,逆轉錄合成1st-strand cDNA和2nd-strand cDNA。基因芯片雜交反應在42 ℃溫度下16～20 h完成,洗滌后,應用芯片掃描儀進行掃描。雜交芯片在掃描后,使用Agilent G2565CA Microarray Scanner軟件掃描圖像(TIFF格式),掃描后的TIFF格式圖片數據采用Feature Extraction提數軟件進行預處理分析,然后采用GeneSpring GX軟件,寫入分組等參數信息。進行每個樣品的數據歸一化和QC分析,然后計算基因表達差異和P值。

1.3.6miRNA靶基因預測和靶基因富集信號通路分析 使用miRSystem網站(http://mirsystem.cgm.ntu.edu.tw/index.php)中集成的DIANA、miRanda、miRDB、miRWalk、PICTAR、PITA、RNA22、Targetscan軟件對miR-335-5p的靶基因進行預測,采用京都基因與基因組百科全書進行信號通路富集分析,選取至少3個軟件支持的靶基因作為下一步分析的候選基因。并與1.3.5所述表達譜芯片篩選基因取得交集基因,然后將交集基因開展靶基因富集信號通路分析。

1.3.7篩選基因PCR擴增檢測 采用Trizol試劑從細胞中提取總RNA,檢測RNA濃度和純度(A260/A280在1.8～2.0),以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性(28 S和18 S RNA條帶比值≥2.0)。提取完成后,進行逆轉錄反應,反應條件如下:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。然后進行qRT-PCR,反應條件:預變性95 ℃ 10 s,變性95 ℃ 15 s,退火60 ℃ 20 s,40個循環。擴增反應結束后進行溶解曲線分析,判斷產物是否有非特異性擴增;分析擴增曲線,計算Ct值,以β-actin作為內參基因,通過2-ΔΔCt法計算各組間mRNA水平差異(模型組基因水平設為1)。實驗重復3次,引物合成由大連寶生物工程有限公司合成,引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.3.8Western blot 收集各組處理的細胞,提取總蛋白,加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF為100∶1)提取總蛋白,將蛋白煮沸變性后,以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白分離,濕轉至聚偏氟乙烯膜上,以5%脫脂奶粉封閉1.5 h,一抗孵育過夜(CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGFB、GAPDH 1∶500～1∶1 000稀釋),TBST洗膜3次,二抗孵育2 h(羊抗兔,1∶2 000稀釋),TBST洗膜3次,加入ECL于Bio-rad凝膠成像儀中進行反應,實驗重復3～5次,采用Image J軟件對Western blot結果進行定量分析,灰度值以累積吸光度值表示,結果以目的蛋白與GAPDH的累積吸光度的比值表示。

2 結 果

2.1慢病毒感染效果的觀察及檢測 慢病毒miR-335-5p感染MGC-803細胞72 h后在倒置熒光顯微鏡鏡下觀察,結果顯示綠色熒光細胞占全視野細胞在80%以上,見圖1。qRT-PCR結果顯示,慢病毒miR-335-5p感染MGC-803細胞72 h后,MGC-803細胞中miR-335-5p水平(130.74±2.67)較陰性對照組(1.00±0.11)明顯升高(P<0.05),見圖2。

注:A為明場下細胞(×100);B為暗場下細胞(×100)。

圖2 各組miR-335-5p水平比較

2.2過表達miR-335-5p對胃癌細胞增殖的影響 MTT結果顯示,與陰性對照組比較,miR-335-5p組細胞的48、72、96 h 的A值均明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05),表明miR-335-5p可降低胃癌細胞活力、抑制其增殖,見圖3。

注:與同時段陰性對照組比較,aP<0.05。

2.3過表達 miR-335-5p 對胃癌細胞侵襲能力的影響 Transwell結果顯示,與陰性對照組比較,miR-335-5p組細胞數明顯減少,差異均有統計學意義(P<0.05),表明過表達miR-335-5p可抑制胃癌細胞的侵襲能力。見圖4。

注:A為陰性對照組;B為miR-335-5p組。

2.4表達譜芯片篩選差異基因和富集信號通路分析 表達譜芯片研究發現,miR-335-5p穩轉細胞和陰性對照細胞之間差異表達的基因(FC大于2.0倍)有1 713個。生物信息學研究表明,經DIANA、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22和Targetscan軟件共同預測miR-335-5p的靶基因,其中至少3個軟件支持的靶基因有3 013個,將所得基因與表達譜芯片篩選的差異基因取交集,獲得交集基因212個,并將獲得的交集基因運用DAVID 6.8軟件進行富集分析,共富集到20條信號通路,其中絕大部分為與腫瘤生物學有關的信號通路,如TGF-β通路、mTOR 通路、凋亡通路、p53信號通路等均為調控腫瘤生物學表型的重要通路。見圖5。

圖5 富集在與腫瘤密切相關的信號通路中的交集基因

2.5靶基因CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β的mRNA表達情況 為驗證感染慢病毒miR-335-5p和陰性對照的MGC-803后胃癌細胞中篩選靶基因在蛋白水平上的表達情況,選擇表達譜芯片篩選后差異表達的核心基因進行驗證。qRT-PCR實驗驗證結果表明,相對于陰性對照組,相關靶基因CREB1(0.53±0.08)、AKT3(0.60±0.05)、COPB2(0.43±0.05)、ARNT2(0.57±0.07)、TGF-β2(0.73±0.09)、KRAS(0.14±0.03)、PDGF-β(0.42±0.07)的mRNA水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

注:與陰性對照組比較,aP<0.05。

2.6靶基因CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β的蛋白表達情況 Western blot結果表明,與陰性對照組比較,相關靶基因CREB1(0.20±0.01)、COPB2(0.40±0.02)、AKT3(0.30±0.01)、ARNT2(0.49±0.01)、TGF-β2(0.21±0.00)、KRAS(0.19±0.01)、PDGF-β(0.21±0.01)的蛋白水平明顯降低(P<0.05)。見圖7。

注:A為Western blot蛋白效果圖;B為Western blot蛋白定量圖;與陰性對照組比較,aP<0.05。

3 討 論

胃癌是全球高發的惡性腫瘤之一,也是全球常見癌癥相關死亡原因中排第2位的惡性腫瘤。目前胃癌治療主要通過手術切除,但絕大多數胃癌在確診時已屬于進展期,已失去手術根治機會。因此,尋找早期診斷標志物是腫瘤研究的重大方向。目前,miRNA已成為胃癌診斷中的重要標志物。為進一步研究其生物學表型和功能意義,本研究通過慢病毒miR-335-5p過表達載體感染胃癌細胞的方式在胃癌細胞中上調其表達,從而觀察對胃癌細胞生物學增殖、侵襲方面的影響,并通過表達譜芯片與預測靶基因取交集的方式研究部分靶基因和富集的信號通路。

本研究結果表明,所篩選的靶基因所富集的信號通路如TGF-β信號通路、mTOR信號通路、凋亡通路、p53信號通路等均為調控腫瘤生物學表型的重要通路。相關研究發現,以上通路均是與胃癌發生、發展密切相關的通路,這些通路的改變為深入探討miR-335-5p的功能提供了依據。Western blot驗證結果表明,過表達miR-335-5p可以下調胃癌細胞中CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β的表達。

AKT3是一種與細胞周期有關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。AKT激酶是響應胰島素和生長因子的細胞信號的調節器,它們參與多種生物學過程,包括細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤發生及糖原合成和葡萄糖攝取。該激酶已被證實可被PDGF、胰島素和胰島素樣生長因子1(IGF1)刺激。HU等[4]研究表明,AKT3在胃癌組織中高表達。LIU等[5]研究發現,原發性胃炎是癌癥的一種獨特表型,生存率低,3個PI3K/AKT通路相關基因(PIK3R2、AKT3和IGF1)在原發性胃炎中表達上調。TAKAHASHI等[6]發現,AKT3表達是預測頭頸部鱗狀細胞癌免疫反應性和預后的潛在生物標志物。此外,AKT3的異構體特異性抑制可作為一種新型的癌癥治療方法,有效抑制PI3K/AKT/mTOR通路[5-6]。

ARNT2是堿性螺旋-環-螺旋-PAS轉錄因子超家族的重要成員之一。編碼的蛋白作為堿性螺旋-環-螺旋-PAS家族的幾個傳感器蛋白的伴侶,與傳感器蛋白形成異二聚體,該異二聚體結合響應發育和環境刺激的基因中的調節性DNA序列。在缺氧條件下,編碼的蛋白與細胞核中的缺氧誘導因子-1α組成復合物,該復合物與氧反應基因增強子和啟動子中的缺氧反應元件結合。小鼠中高度相似的蛋白質與芳基烴受體和單一蛋白質形成功能復合物,表明編碼的蛋白質在異源化合物的代謝和神經發生的調節中具有額外的作用。JIA等[7]研究發現,ARNT2在胃癌組織中低表達,且與腫瘤的浸潤深度、分化程度和較差的生存率呈負相關。過表達ARNT2可抑制細胞增殖。LI等[8]研究發現,ARNT2在肝細胞癌中的表達明顯高于癌旁組織,并與腫瘤的增殖、侵襲和轉移密切相關。LI等[9]研究發現,ARNT2是乳腺癌中與侵襲轉移有關的7個核心基因之一。以上研究表明,ARNT2在腫瘤的發生、發展中發揮了重要的作用,其在腫瘤中的表達具有組織特異性。

CREB1編碼一種轉錄因子,是DNA結合蛋白亮氨酸拉鏈家族的成員。該蛋白以同型二聚體的形式與cAMP反應元件(八聚體回文組)結合。該蛋白被多個蛋白激酶磷酸化,并誘導基因轉錄以響應對cAMP途徑的激素刺激。CREB1作為一種重要的原癌基因,作為蛋白激酶A(PKA)的下游效應器,參與組成cAMP/PKA/CREB信號通路,可以調節癌癥細胞的生長、遷移、侵襲和代謝[10]。有研究表明,CREB在許多生長信號通路下游的位置暗示了其在腫瘤細胞中的致癌潛力[11]。腫瘤生長與CREB表達和活化增加有關,沉默CREB1可抑制腫瘤的生長[12-13]。

TGF-β2編碼TGF-β蛋白超家族的分泌配體。該家族的配體結合各種TGF-β受體,導致調節基因表達的SMAD家族轉錄因子的募集和激活。編碼的前蛋白被蛋白水解處理以產生潛伏相關肽(LAP)和成熟肽,并且以由成熟肽同二聚體、LAP同二聚體和潛在TGF-β結合蛋白組成的潛伏形式存在,或者以僅由成熟肽同二聚體組成的活性形式存在。成熟肽也可以與其他TGF-β家族成員形成異二聚體。TGF-β/SMAD途徑的破壞與多種人類癌癥有關。YANG等[14]研究表明,TGF-β2在胃癌中高表達,并與腫瘤的組織學分級、淋巴結轉移、免疫細胞浸潤和預后不良相關。

KRAS是哺乳動物ras基因家族的Kirsten-ras癌基因同源物,編碼一種屬于小GTPase超家族的蛋白質。一個單一的氨基酸取代是激活突變的原因。轉化蛋白與多種惡性腫瘤有關,包括肺腺癌、黏液腺瘤、胰腺導管癌和結直腸癌。KRAS被認為是人類癌癥中最常見的突變致癌基因[15]。研究證明,使用KRAS誘導系統可建立許多小鼠模型[16]。YOON等[17]研究表明,17%的胃腺癌發生KRAS的擴增和突變,敲低KRAS可抑制人胃腺癌細胞的上皮細胞-間充質轉化和轉移。

PDGF-β是由PDGF和血管內皮生長因子組成的蛋白家族成員。編碼的前蛋白被蛋白水解處理以產生血小板衍生生長因子亞單位β,其可與相關的血小板衍生生長因子亞單位α同聚或異聚。這些蛋白結合并激活PDGF受體酪氨酸激酶,在廣泛的發育過程中發揮作用。該基因突變與腦膜瘤相關。22號和17號染色體之間的相互易位,位于該基因和Ⅰ型膠原α1基因所在的位點,與皮膚纖維肉瘤(一種罕見的皮膚腫瘤)有關。有研究表明,PDGF-β在胃癌組織中高表達,并與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期呈正相關,檢測PDGF-β水平可作為判斷胃癌轉移和預后的指標之一[18],PDGF/PDGFR信號通路的激活通過調節多種下游通路,包括磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路和絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶通路,與癌癥增殖、轉移、侵襲和血管生成相關。因此,靶向PDGF/PDGFR信號通路已被證明是癌癥治療的有效策略[19]。

COPB2是典型的細胞質蛋白復合體的1個亞基,其與雙賴氨酸基序結合,并與高爾基衍生的非網格蛋白包被的囊泡結合。在蛋白質生物合成過程中,COPB2以囊泡的形式將其他蛋白質從內質網運送至高爾基體[20]。COPB2參與調節多種腫瘤的生物學行為,可在肺癌[20]、乳腺癌[21]等多種惡性腫瘤中異常表達。AN等[22]研究表明,COPB2在胃癌中過表達,沉默COPB2可抑制細胞增殖,減少細胞集落的形成并誘導細胞凋亡。

本研究結果顯示,miR-335-5p上調表達抑制胃癌細胞增殖和侵襲能力,表達譜芯片篩選結合生物信息學靶基因預測分析取得交集,共獲得212個miR-335-5p的靶基因,并富集在20個腫瘤相關的信號通路中。mRNA和Western blot驗證結果表明,靶基因CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β是miR-335-5p調控胃癌發生、發展及預后的重要癌基因。檢索文獻和數據庫均顯示,CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β廣泛參與胃癌細胞的增殖、侵襲、轉移表型。本研究發現,miR-335-5p上調表達可明顯抑制胃癌細胞增殖和侵襲能力,所篩選的212個靶基因,包括CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β均富集于20個與腫瘤相關的信號通路中,CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β是經生物信息學方法表達譜芯片篩選的交集基因,并經PCR實驗和Western blot實驗驗證,由此說明miR-335-5p作為胃癌中的抑癌基因,其抑制胃癌細胞增殖和侵襲能力是由靶向調控CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β所介導的。miR-335-5p上調表達抑制胃癌細胞增殖和侵襲能力與抑制靶基因CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β的表達有關。此外,表達譜芯片結合生物信息學手段是重要的組學篩選的方法,本研究中所發現的差異表達基因所富集的信號通路和篩選的核心基因均能說明miR-335-5p在胃癌中是影響表型的關鍵分子,是調控胃癌生物學表型的觀察窗口。另外,通過表達譜芯片結合生物信息學分析發現的具有高度相關性的癌基因和信號通路為探討miR-335-5p調控胃癌的機制提供了線索和依據。