SDC2和TFPI2基因甲基化聯合檢測試劑性能驗證

李欽麗,張繼偉

1.武漢市東西湖區人民醫院檢驗科,湖北武漢 430040;2.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院病理科,湖北武漢 430022

結直腸癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤,其發病率和死亡率呈逐年遞增的趨勢[1-2]。結直腸癌的早診篩查可以有效地降低結直腸癌的發病率和死亡率[3]。目前結直腸癌早期篩查技術主要包括結腸鏡檢查、糞便免疫化學測試(FIT)和多靶點糞便DNA檢測等,其中結腸鏡檢查是結直腸癌篩查的金標準,但由于檢查具有侵入性且需要充分的腸道準備,從而限制了該方法的普遍應用。其他無創篩查方法如多靶點糞便DNA檢測對結直腸癌及進展期腺瘤的靈敏度均高于FIT,在臨床上顯示出較好的應用潛力[4-5]。研究發現黏結蛋白聚糖2(SDC2)和組織因子途徑抑制劑2(TFPI2)基因在結直腸癌組織中呈現出高度甲基化,將SDC2和TFPI2基因甲基化水平作為結直腸癌的生物標志物,基于SDC2和TFPI2基因的糞便DNA檢測可以更靈敏、特異的檢測出結直腸癌[6-7]。

根據中國合格評定國家認可委員會(CNAS)《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明:CNAS-CL02-A009》[8]文件的相關要求,臨床醫學檢驗實驗室在開展新的分子檢測項目時必須對檢測系統進行性能驗證,以保證分子檢測項目檢測流程的可靠性及檢測結果的準確性。本研究參照CNAS發布并實施的《分子診斷檢驗程序性能驗證指南:CNAS-GL039》[9]對SDC2和TFPI2基因甲基化聯合檢測試劑盒(熒光PCR法)分別進行方法符合率、檢出限、精密度和抗干擾能力的性能驗證,以期為各檢驗實驗室在開展新的分子檢測項目制訂性能驗證方案時提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1標本來源 選取武漢市東西湖區人民醫院的30例糞便標本(結直腸癌標本25例和非結直腸癌標本5例),3份含1%甲基化目的基因的檢測限參考品(核酸濃度為10 000 copy/mL)來自于武漢艾米森生命科技有限公司。

1.2儀器與試劑 SLAN-96P全自動熒光定量PCR儀(上海宏石醫療科技有限公司),SDC2 和 TFPI2 基因甲基化聯合檢測試劑盒(熒光 PCR 法,武漢艾米森生命科技有限公司),核酸提取試劑和核酸純化試劑(武漢艾米森生命科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1糞便標本DNA提取和純化 根據DNA提取試劑盒說明書的步驟要求提取糞便標本的DNA,按照核酸純化試劑盒說明書對提取的DNA進行純化。

1.3.2熒光PCR擴增檢測 按照SDC2和TFPI2基因甲基化聯合檢測試劑盒(熒光PCR法)說明書配置反應體系25 μL,包括14 μL 反應液Ⅰ(buffer和dNTP),5.7 μL PCR 反應液Ⅱ(引物和探針),0.3 μL熱啟動Taq酶,陰性對照NC、標本核酸轉化液、陽性對照PC各5 μL。加樣后,確定蓋好管蓋或封膜后,短暫離心30 s(避免有氣泡,如果有氣泡,用手指輕彈,重新瞬時離心),立即進行PCR擴增反應。擴增條件為95 ℃ 5 min,1個循環;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,45個循環,60 ℃時收集ROX、FAM和VIC信號。

1.3.3結果判讀 按照SDC2和TFPI2基因甲基化聯合檢測試劑盒(熒光PCR法)說明書進行結果判讀:甲基化的SDC2基因DNA片段(ROX信號通道)和TFPI2基因DNA片段(FAM信號通道)及內控基因ACTB(VIC信號通道)。ACTB基因即為β-actin,是常用管家基因,用于評估檢測中標本DNA水平和質量,避免由于標本DNA水平和質量的問題導致假陰性結果。陽性對照ROX、FAM和VIC通道均應有擴增曲線升起,并且循環閾值(Ct值)在26～30;陰性對照ROX、FAM和VIC通道均應無擴增曲線升起或Ct值>40;待測標本在VIC通道有擴增曲線升起且Ct值≤36的條件下,如果ROX和(或)FAM通道有擴增曲線升起且Ct值≤38,則判斷標本甲基化陽性,如果ROX和FAM通道均無擴增曲線升起或Ct值>38,則判斷標本甲基化陰性。

1.3.4方法符合率 采用腸鏡檢查和(或)與病理診斷結果結合的金標準方法為對照方法,用候選方法檢測30例糞便標本,其中包括結直腸癌標本25例和非結直腸癌標本5例。

1.3.5檢出限 通過對3份含1%甲基化目的基因的檢測限參考品L1、L2和L3使用本檢測試劑重復檢測3次。L1為含1%甲基化TFPI2基因的參考品,L2為同時含1%甲基化SDC2和1%甲基化TFPI2基因的參考品,L3為含1%甲基化SDC2基因的參考品。所有參考品均為用甲基化目的基因質粒與從組織細胞內提取的基因組核酸,按照一定比例混合,最終得到含1%甲基化目的基因參考品。

1.3.6精密度 取1份陽性參考品,分5批次,每天檢測一批次,每批次重復檢測5次,記錄結果。最后計算批內和批間Ct值的變異系數(CV),CV≤5%為合格。

1.3.7抗干擾能力 選取2例陽性糞便標本和1例陰性糞便標本,按照試劑廠商提供的每1 mL糞便標本加入6 μL的比例最高抗干擾水平,分別加入干擾物質新鮮乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血/甘油,每例標本重復檢測3次。

2 結 果

2.1方法符合率驗證結果 收集的30例標本中,陽性標本與腸鏡檢查和(或)病理診斷結果符合率為96.0%,陰性標本符合率為100.0%,總符合率為96.7%,驗證通過。見表1。

表1 方法符合率結果比對(n)

2.2檢出限驗證結果 含1%甲基化目的基因濃度為10 000 copy/mL的檢測限參考品L1的TFPI2 3次重復檢測Ct值均≤38;參考品L2的SDC2和TFPI2 3次重復檢測Ct值均≤38;參考品L3的SDC2 3次重復檢測Ct值均≤38,3個檢測限參考品均為陽性,驗證通過。見圖1。

注:A為參考品L1 TFPI2基因(藍色),ACTB基因(綠色);B為參考品L2 TFPI2基因(藍色),SDC2基因(黃色),ACTB基因(綠色);C為參考品L3 SDC2基因(黃色),ACTB基因(綠色)。

2.3精密度驗證結果 1份陽性精密度參考品檢測的批內、批間精密度CV均≤5%,驗證通過。見表2、3。

表2 批內精密度驗證結果(Ct值)

2.4抗干擾能力驗證結果 通過對3例加入干擾物質的有效糞便標本(其中2例陽性,1例陰性),重復檢測3次,干擾物質對測定無明顯影響,驗證通過。見圖2。

注:A為陽性標本1 TFPI2基因(藍色),SDC2基因(黃色),ACTB基因(綠色);B為陽性標本2 SDC2基因(黃色),ACTB基因(綠色);C為陰性標本3 ACTB基因(綠色)。

3 討 論

研究表明成人每天都會有大量的腸上皮細胞從腸壁脫落,并通過大腸蠕動隨糞便排出體外,而腫瘤細胞由于增生異常更容易從腸道脫落,因此結直腸癌患者的糞便中往往有大量的病變細胞及異常的細胞組分,這是多靶點糞便DNA檢測穩定的物質基礎[10]。基因的甲基化修飾是腫瘤發生的早期事件,從結直腸癌患者排遺物中獲得的遺傳物質可以更早地反映腸道是否存在癌變情況[11]。SDC2是一種細胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,參與調節許多生理過程和病理過程,生理過程包括細胞增殖、分化、黏附、遷移、傷口愈合、血管生成;病理過程包括炎癥和癌癥[6]。TFPI2是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑,已被鑒定為一種腫瘤抑制基因。TFPI2在調節細胞增殖、凋亡及血管生成等方面也發揮重要作用,TFPI2在維持腫瘤微環境的穩定性,抑制腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移中均發揮重要作用[7]。SDC2和TFPI2基因在結直腸癌組織中呈現出高度甲基化,將SDC2和TFPI2基因甲基化狀態作為結直腸癌的生物標志物,可以更靈敏、特異地檢測出結直腸癌。

本檢測試劑基于實時熒光定量PCR技術實現對糞便標本中SDC2和TFPI2基因甲基化的檢測,在SDC2和TFPI2基因啟動子與結直腸癌發生高度相關的CpG區域,針對經過重亞硫酸鹽轉化后的序列分別設計了特異性引物和特異性熒光探針,可以在PCR中專一地檢測出甲基化的序列。從人糞便標本中獲得腸道脫落細胞基因組DNA,然后用重亞硫酸鹽進行轉化,并通過三重PCR擴增來測定亞硫酸鹽轉化后的DNA,從而檢測發生甲基化的SDC2基因DNA片段和TFPI2基因DNA片段,其中內控基因ACTB(β-Actin)為管家基因,用于評估檢測中標本DNA水平和質量。

性能驗證具體是指分子檢測實驗室按照檢測系統或試劑盒說明書使用某種特定檢測系統或試劑時,能夠復現生產廠家聲明的檢測性能過程。性能驗證不僅能夠提高分子檢測實驗室對新的檢測系統、新的檢測試劑或新的檢測方法相關性能指標的全面認識和理解,更重要的是對檢測實驗室技術質量管理水平的提升具有重要作用[12]。因此,在臨床檢測過程中,從保證檢測質量的角度出發,任何一種用于分子檢測實驗室的新的檢測系統、新的檢測試劑或新的檢測方法,在正式應用于臨床檢測前,均需要做性能驗證[13-15]。本研究參照《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明:CNAS-CL02-A009》[8]對開展新的分子診斷項目需進行檢測程序性能驗證的要求,分別從方法符合率、檢出限、精密度和抗干擾能力4個方面對SDC2和TFPI2基因甲基化聯合檢測試劑盒(熒光PCR法)進行性能驗證評價。

在方法符合率驗證中,參照《分子診斷檢驗程序性能驗證指南:CNAS-GL039》[9]要求,選取陰性標本至少5例、陽性標本(宜包含弱陽性/低擴增的標本),一般不少于10例。在對試劑進行性能驗證時,為排除和避免由于檢測標本帶來的誤差,通常可以采用在指南要求的基礎上進一步增加檢測標本量的方法,進而提高和保證檢測的準確性。為盡可能保證方法符合率驗證的準確性,本研究選取30例糞便標本,包括經臨床腸鏡檢查和(或)病理診斷確診為結直腸癌的標本25例和非結直腸癌的標本5例。25例結直腸癌標本中有24例經本試劑檢測為陽性,則陽性標本與腸鏡檢查和(或)病理診斷結果符合率為96.0%,高于臨床試驗確認的臨床靈敏度(95.3%);5例非結直腸癌標本經本試劑檢測全為陰性,陰性標本符合率為100.0%。以上檢測結果表明,30例糞便標本通過本檢測試劑的檢測結果與對照方法(腸鏡檢查和(或)病理診斷)相比僅有1例標本不一致,即總符合率為96.7%(29/30)。

檢出限又稱為檢測下限,是指能以適當的置信概率檢出待測物質的最低濃度或最小質量。檢出限既與檢測器對待測物質的響應信號有關,又與空白值的波動程度有關。本研究選用試劑廠家提供的檢出限參考品進行試劑盒檢出限的驗證,共選用3個濃度為10 000 copy/mL檢出限參考品,每個參考品重復檢測3次,依據檢測試劑盒的判讀標準所有檢測結果均為明確陽性,符合試劑盒檢出限的要求。

精密度通常是指對同一標本進行多次重復檢測所得到的結果的一致程度,通常以CV表示。本研究選用試劑廠家提供的陽性參考品進行試劑盒精密度的驗證,驗證結果發現TFPI2、SDC2和ACTB的批內與批間檢測結果Ct值的CV值均≤5%,符合試劑說明書要求標準,精密度驗證合格。一般來說,檢測方法或檢測試劑的精密度高,可以更好地保障檢測結果的穩定。

在臨床檢測過程中,為避免臨床標本可能存在的內源性或外源性干擾物質對檢測結果準確性的影響,造成假陰性結果的出現,通常建議選用抗干擾能力好的檢測試劑。為確認及避免干擾物質對本試劑盒檢測結果準確性的影響,本研究通過用本試劑盒檢測分別加入新鮮 EDTA 抗凝血/甘油干擾物質的陽性標本和陰性標本,對本試劑盒進行抗干擾能力的驗證,檢測結果表明干擾物質未對檢測結果造成影響,符合試劑說明書要求標準,說明本檢測試劑抗干擾能力好。

綜上所述,本實驗針對方法符合率、檢出限、精密度和抗干擾能力4個方面驗證了SDC2和TFPI2基因甲基化聯合檢測試劑盒(熒光PCR法)的效果,所有實驗結果均符合要求,表明本試劑可用于臨床檢測。