3種方法對曲霉菌鑒定結果對比研究*

張春華,胡明冬,蔣 敏,吳 倩

1.陸軍軍醫大學第二附屬醫院健康管理科,重慶 400037;2.重慶新橋社區衛生服務中心,重慶 400037;3.重慶醫科大學附屬第二醫院檢驗科,重慶 400010

侵襲性肺曲霉病(IPA)是指由曲霉菌所致的肺部感染疾病。隨著器官移植廣泛開展,免疫抑制劑和廣譜抗菌藥物的大量使用,使得IPA感染率呈逐年上升趨勢[1]。IPA臨床癥狀不典型,與病毒性肺炎難以鑒別。對IPA的診斷,主要根據臨床表現、體征、影像學、實驗室檢測組織病理中發現45°角分枝的菌絲或曲霉頭為金標準[2]。而在實際工作中,對曲霉菌的鑒定形態學傳統手工法準確率低且耗時長,特別是少見曲霉菌,需依賴經驗豐富的檢驗科工作人員。而基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)鑒定時間短,準確率高,結合血清學方法,能極大提高曲霉病診斷的準確率。本研究對2020年1月至2021年3月重慶醫科大學附屬第二醫院檢出的56株曲霉菌株,采用傳統手工法、分子測序、MALDI-TOF MS 3種鑒定方法進行比較。由醫學真菌中心(南京皮膚病研究所)對菌株進行分子測序,評價本實驗室傳統手工法對曲霉菌的鑒定狀況。針對MALDI-TOF MS方法,探討適合于曲霉菌質譜鑒定的最佳前處理方式,實現曲霉菌質譜的快速鑒定,并建立一套適合實驗室絲狀真菌鑒定標準操作流程。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集2020年1月至2021年3月重慶醫科大學附屬第二醫院住院患者確診或臨床診斷為慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、中耳炎、腫瘤患者的菌株,同一患者多次分離出同一絲狀真菌以1株計算,共分離培養出曲霉菌56株,收集并保存菌種。其中肺泡灌洗液標本分離出12株,痰液標本分離出35株,纖支鏡刷取物標本分離出3株,耳分泌物標本分離出4株,鼻竇分泌物標本分離出2株。

1.2儀器與試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA,OXID有限公司,培養基為粉劑,需配制成固體培養基),OMEGA FUNGAL DNA KIT1000(廣州飛揚生化科技有限公司代理),PCR 擴增儀(美國 BIO-RED S1000),DL2000 DNA Marker、2×TSINGKE Master Mix、通用引物β-tubulin(北京擎科新業生物技術有限公司),Bruker BioTyper系統(德國Bruker公司),甲酸和乙腈溶液(上海凌峰化學試劑有限公司)。

1.3方法

1.3.1傳統手工法 按照《全國臨床檢驗操作規程》真菌培養鑒定程序進行[3]。

1.3.2分子測序 提取模板DNA:按OMEGA FUNGAL DNA KIT1000試劑盒標準規程操作。目的基因擴增:按照以上步驟提取的DNA模板進行PCR擴增真菌ITS區域,本研究通用引物β-tubulinF:AATTGGTGGTGAAGATTTCTGG;R:AGTTGTCGGACGGAATAG[4]。PCR反應總體積50 μL:DNA模板4 μL,引物各1 μL,2×TSINGKE Master Mix 12.5 μL,蒸餾水6.5 μL。PCR反應在PCR擴增儀中進行,設置PCR反應程序:95 ℃變性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,共35個循環,72 ℃保持延伸7 min。PCR擴增產物送安徽通用生物系統有限公司進行測序。將每一株絲狀真菌的測序結果在Pubmed網站上通過BLAST檢索,與數據庫中條目進行比對,選擇同源性最大的結果作為分子測序鑒定的結果。

1.3.3MALDI-TOF MS鑒定 (1)甲酸乙腈萃取法[5-6]:用接種環刮取PDA培養3 d的菌落,挑取邊緣菌絲,加入300 μL純水+900 μL無水乙醇,以13 000 r/min震蕩離心2 min,棄去上清液,干燥。加入70%甲酸50 μL,4 000 r/min破壁震蕩20 s,重復兩次,放置5 min。加入乙腈50 μL,放置5 min。以13 000 r/min離心2 min,取上清液為真菌蛋白模板。(2)鋯珠碾磨甲酸乙腈萃取改良法:用接種環刮取PDA培養2 d的幼齡菌絲,挑入1 mL土豆肉湯中于搖床水平搖動28°增菌24 h,形成肉眼細密菌落,加入兩粒鋯珠,余下操作同甲酸乙腈萃取法。見圖1。(3)取1 μL真菌蛋白點靶,自然干燥后覆蓋基質1 μL,自然干燥后進行質譜鑒定。(4)鑒定評分:每株菌點靶兩次進行鑒定,結果一致時的菌名和鑒定得分,將鑒定標準定為:鑒定到種得分≥2.0分;低于2.0分但所有鑒定結果前5位為同一種菌,得分在1.7～2.0分為鑒定到屬,低于1.7分或鑒定結果為多種菌為無鑒定結果。

注:A為水平振搖形成的細密菌落圖;B為垂直振搖的細密菌落圖;水平振搖獲得菌絲更為均勻和細致。

1.4統計學處理 采用SPSS19.0和WHONET5.6軟件對收集到的數據進行統計匯總分析,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.156株曲霉菌采用3種方法進行鑒定的結果比較 以分子鑒定結果為金標準,質譜鑒定種屬52株,準確率為92.9%(52/56),手工鑒定32株,準確率為57.1%(32/56)。質譜鑒定的準確率明顯高于手工鑒定(P<0.05)。見表1。

表1 56株曲霉菌采用3種方法進行鑒定的結果比較(n)

2.2兩種絲狀真菌蛋白提取法質譜結果比較 56株曲霉菌采譜方式有兩種:一種為PDA固體培養72 h取菌絲,按照鋯珠碾磨甲酸乙腈萃取改良法提取蛋白液采譜,質譜鑒定到曲霉菌種屬準確率為73.2%(41/56);第二種為用PDA液體水平振搖24 h取菌絲采譜,再以鋯珠碾磨甲酸乙腈萃取獲得菌絲蛋白液,質譜鑒定到曲霉菌種屬準確率為92.9%(52/56)。兩種采譜方法比較,差異有統計學意義(P<0.05)。曲霉菌采用PDA液體水平振搖培養24 h取得的質譜圖更優。見表2。

表2 兩種絲狀真菌蛋白提取法質譜結果比較(n)

2.3PDA培養天數對質譜鑒定曲霉菌能力的影響 本研究選用PDA對56株曲霉菌株進行培養,并分別在2、3、5、7、9 d提取真菌蛋白,運用BRUKER MALDI-TOF MS進行采譜,PDA培養2 d質譜鑒定到種的準確率為25.0%,3 d為37.5%,5 d為33.9%,7 d為8.9%,9 d為1.7%。培養3、5 d質譜鑒定準確率分別為73.2%(41/56)和75.0%(42/56),其質譜鑒定準確率優于培養2、7、9 d的質譜鑒定準確率,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 PDA培養天數對質譜鑒定曲霉菌能力的影響(n)

3 討 論

在治療曲霉菌感染的患者時,獲取準確的病原菌信息至關重要,因為不同的曲霉菌對藥物的靈敏度不同,有的甚至存在天然耐藥。如大部分曲霉菌對兩性霉素B敏感,而土曲霉菌對兩性霉素B天然耐藥,黃曲霉菌可以出現獲得性耐藥[7-8]。因此指導臨床合理使用抗真菌藥物,必須準確快速地鑒定曲霉菌到種。曲霉菌現有鑒定方法包括傳統手工法、分子測序、MALDI-TOF MS技術等。分子測序為絲狀真菌鑒定的金標準,但是它對操作人員技術要求高,操作復雜,費用昂貴,不適合成為實驗室常規的檢測方法[9];曲霉菌傳統手工法鑒定需要數天時間,對菌落的生長速度、色素變化及鏡下菌絲和孢子結構進行觀察,要求檢驗人員有專業的技術和豐富的鑒定經驗,易產生較大的人為誤差,本實驗室對56株曲霉菌采用傳統手工法鑒定到種準確率只能達到57.1%(32/56),與相關研究結果一致[10]。近年來MALDI-TOF MS技術已廣泛用于細菌的鑒定[10-11],操作簡便、快速、高通量、且準確性高,臨床應用取得良好效果。

MALDI-TOF MS是臨床微生物病原菌鑒定的新型軟電離質譜技術,其通過檢測微生物蛋白質指紋圖譜,根據不同菌種特有的質譜峰與質譜圖數據庫進行比對,進而快速得出微生物鑒定結果,在細菌同源性分析、病原菌分型、毒力因子鑒定及耐藥檢測等方面表現出優勢[12-13]。在真菌的快速鑒定中,近年張霄霄等[14]發現MALDI-TOF MS技術可將酵母樣真菌的鑒定準確率從傳統手工法的79.6%提高到95.1%。SLEIMAN等[15]結合德國布魯克MALDI-TOF MS絲狀真菌數據庫和實驗室自建18種曲霉菌譜圖,將曲霉菌種鑒定準確率提高了24.0%,對傳統手工法僅鑒定到屬的曲霉菌株均實現了種鑒定。上述研究表明,MALDI-TOF-MS技術在臨床真菌鑒定中的作用日益顯著,然而質譜技術應用缺少實踐和經驗積累,尤其絲狀真菌結構復雜,鑒定過程復雜,目前仍處于探索階段。本研究從臨床分離出56株曲霉菌,對比傳統手工法和MALDI-TOF MS技術,結果顯示,以分子測序結果為金標準,MALDI-TOF MS技術鑒定絲狀真菌到種的準確率為92.9%,明顯高于傳統手工法鑒定的57.1%(P<0.05)。

在MALDI-TOF MS技術運用中,布魯克公司絲狀真菌數據庫基于液體法建立,認為曲霉菌在液體培養法中采譜能得到更高鑒定準確率。本研究首先比較了PDA液體培養水平和豎直兩種振搖方式得到的菌絲結果,發現水平振搖獲得菌絲更為均勻和細致;再比較了PDA固體培養72 h和PDA液體培養水平振搖24 h兩種方式,得到的菌絲質譜鑒定到種屬的鑒定準確率分別為73.2%和92.9%,兩種采譜方法比較,差異有統計學意義(P<0.05),采用PDA液體水平振搖培養24 h取得的質譜圖更優。曲霉菌質譜蛋白的提取法分為完整細胞法和細胞裂解法。甲酸萃取法為完整細胞法,郜珠研磨法屬于細胞裂解法,VITEK MS質譜儀推薦的絲狀真菌質譜分析前處理的蛋白質提取方法為甲酸乙腈法[16]。宗來斌等[17]采用甲酸乙腈萃取法對47株曲霉菌進行前處理后,質譜鑒定準確率為79.8%;本研究采用郜珠研磨法加上甲酸乙腈萃取法,質譜鑒定準確率達92.8%,且本法獲得的質譜圖特征峰數量更多,強度更高。分析原因可能是:(1)提取過程中加入一定量郜珠,可與菌絲相互碰撞、剪切,使蛋白質釋放更為充分,一定程度上提高了難破碎菌株的蛋白圖譜質量與鑒定效果;(2)PDA水平振搖培養24 h得到的真菌絲的壁較薄且均勻,郜珠震蕩更容易破壁,因而甲酸乙腈萃取到的核酸蛋白更多。

絲狀真菌的胞壁堅韌、難以破碎,常規方法難以獲得足量蛋白質。影響真菌蛋白質獲取的因素除提取方法外,還包括培養基選擇、提取蛋白時間等[18]。真菌常用的培養基有沙堡弱葡萄糖瓊脂(SDA)、察氏培養基(CA)和PDA。DE CAROLIS等[19]的研究表明不同培養基(SDA、MA或PDA)對MALDI-TOF MS的鑒定結果無影響。因此本研究選用PDA對56株曲霉菌進行培養,并分別在2、3、5、7、9 d提取真菌蛋白,運用MALDI-TOF MS進行采譜,結果培養3 d和5 d的質譜鑒定準確率分別為73.2%和75.0%,優于培養2、7、9 d的鑒定準確率,差異有統計學意義(P<0.05)。因此將PDA平板培養絲狀真菌提取蛋白時間定于3～5 d。

綜上所述,本著絲狀真菌鑒定準確、快速和安全的原則,本研究摸索出一套適合本實驗室的操作方法:呼吸道或耳鼻竇分泌物標本培養3～5 d,期間發現曲霉菌菌落可以挑取菌絲于PDA液體培養基中水平振搖培養24 h,所得菌絲采取郜珠研磨,甲酸乙腈萃取蛋白,MALDI-TOF MS采譜鑒定。此方法操作簡單、快速、結果準確且重復性好,完全可以滿足臨床需要,已在本實驗室得以應用,并適于在臨床微生物實驗室中推廣。相信將來MALDI-TOF MS技術在各臨床實驗室中應用會越來越廣泛,并逐漸取代傳統手工形態學鑒定方法。