SIRT1在糖尿病腎病中的診斷及治療價值

安 敏,王雪冬,裴愛月,王淑嫻,梁晨陽,付少杰,馬福哲*

(1.唐山職業技術學院附屬醫院 腎內科,河北 唐山063000;2.吉林大學第一醫院 麻醉科,吉林 長春130021;3.吉林大學第一醫院 內鏡中心,吉林 長春130021;4.吉林大學第一醫院 腎病內科,吉林 長春130021)

糖尿病腎病(DKD)是糖尿病的一種嚴重并發癥,也是導致終末期腎病的主要原因之一[1]。但是在目前的臨床實踐中,一直缺乏可靠的分子靶點用于DKD的早期診斷和有效治療[2]。機器學習策略是用于從一組方案中選擇最佳模型來擬合觀察結果的人工智能技術,具有非線性、容錯性和實時性的優點,因此適合于復雜場景的應用[3]。近年來機器學習策略結合生物信息學技術,在尋找新型疾病診斷標志物方面展現出了巨大潛力[4]。微小RNA(miRNA)作為一種內源性非編碼RNA,通過調控其下游靶基因的表達在DKD發生發展中發揮著重要作用[5]。因此本研究旨在利用機器學習策略對公共數據庫轉錄組數據進行處理,鑒定出新的DKD診斷標志物,并預測調控該靶點的miRNA。之后利用多種分子生物學技術驗證上游miRNA對該靶點表達的調控情況,以及對DKD炎癥反應、氧化應激及纖維化的影響,以期探索出可用于DKD早期診斷和治療干預的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1公共數據來源 從GEO 數據庫(http://www.ncbi.nlm.nib.gov/ geo/)中獲取含有健康對照以及DKD患者的腎小球轉錄組數據。以GSE30528,GSE96804及GSE47185作為訓練集,GSE99339及GSE30122作為驗證集。訓練集和驗證集分別含有DKD患者64例和33例,對照組50例和61例。

1.1.2動物 6～8周齡的BTBR ob/ob小鼠(自發性2型DKD模型)40只,年齡匹配的BTBR野生型小鼠(BTBR WT)10只作為正常對照,均購于美國Jackson實驗室。

1.1.3主要試劑 ROS試劑盒、MDA試劑盒購于南京建成生物工程研究所;小鼠QuantiChromTM肌酐試劑盒、白蛋白試劑盒購于美國博世生物公司;小鼠血糖試劑盒、低密度脂蛋白試劑盒、尿素氮試劑盒購于杭州齊譽生物科技公司;SIRT1、VCAM-1、P53、Ac-P53、PAI-1、CTGF、TGF-β1、GAPDH一抗以及二抗購自美國Abcam公司;pGL質粒載體購于美國Promega公司。

1.1.4細胞系及處理 SV40MES13小鼠腎小球系膜細胞系購自上海中喬新舟生物公司。為維持適宜的環境條件,細胞培養溫度設置為37℃,并保持5%的CO2濃度。培養基成分包括RPMI-1640培養基、10%胎牛血清(FBS)、0.1 mg/mL鏈霉素以及100 U/mL青霉素。

1.2 方法

1.2.1機器學習及生物信息學分析 對各數據集進行批次校正后合并,以矯正后的P值<0.05以及|log2差異倍數|>1為篩選標準鑒定出DKD的差異表達基因(DEGs)。分別使用最小絕對收縮和選擇算子(LASSO),隨機森林(RF)以及支持向量機遞歸特征消除(SVM-RFE)3種機器學習算法針對訓練集數據構建診斷模型,將3種算法均納入的基因篩選為潛在生物標志物。在訓練集及驗證集中分別根據標志物基因的表達量繪制了其接受者操作特征(ROC)曲線。

1.2.2雙熒光素酶報告系統 通過RNA預測數據庫RNAhybird(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)預測可以與鑒定出的標志物mRNA 3’UTR區良好結合的目標miRNA。基于預測的結合位點合成包含目標miRNA結合位點的靶基因短序列,并將其插入到pGL-控制載體的KpnⅠ和BgⅢ位點,構建野生型質粒,將SV40MES13細胞種在24孔板中,與野生型報告質粒、熒光素腎素-胸苷激酶質粒以及目標miTNA,目標miRNA抑制劑共同轉染24 h,使用Promega Dual熒光素酶報告檢測系統分析熒光素酶活性。

1.2.3動物分組及處理 小鼠分為正常對照組、DKD空白對照組、DKD轉染非同源miRNA對照組、DKD轉染目標miRNA agomir組,DKD轉染目標miRNA antagomir組,每組10只。按各自分組,分別給予陰性對照抑制劑、目標miRNA agomir、目標miRNA antagomir,2 mg/kg每周1次皮下注射,共干預24周。于第1、12、24周測血糖、血肌酐、低密度脂蛋白、尿蛋白肌酐比(UACR)以及24 h尿量。第24周小鼠安樂死,取腎組織進行進一步研究。

1.2.4腎臟氧化應激分析 對第24周取材小鼠的腎臟皮質組織,采用檢測試劑盒測定其中的活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平。

1.2.5RNA的提取與檢測 應用TRizol試劑提取腎組織中總RNA,使用qRT-PCR方法檢測miRNA以及mRNA的表達,基因表達量被適當的標準化為 U6或GAPDH,使用2-△△ct法對基因的表達水平進行量化。miR-138-5p正向引物序列:5′-GGGAGCTGGTGTTGTGAAT-3′,反向引物序列:5′-CAGTGAGTGTCGTGGAGT-3′;SIRT1 mRNA正向引物序列:5′-GTCACACTTACGACAGAGCAGC-3′,反向引物序列:5′-TTTCTCCAGTACATACACAAC-3′;GAPDH mRNA正向引物序列:5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′,反向引物序列:5′-TCTAGACGGC AGGTCAGGTCCACC-3′;U6正向引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物序列:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.6蛋白表達測定 應用蛋白印跡法測定腎組織中蛋白的表達。使用含蛋白酶抑制劑的Ripa裂解液對總蛋白進行提取,并使用BCA試劑盒對蛋白濃度進行定量。采用常規Westernblot方法,用聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行分離,并轉移至PVDF膜上,再使用5%脫脂奶粉封閉15 min后于4℃下用一抗孵育過夜,次日用TBS-T將PVDF膜清洗3次,常溫下與二抗孵育1 h,再用TBS-T洗膜3次,用ECL顯影液顯影。

1.2.7統計學分析 由SPSS 25.0分析所收集數據,數據以均數±標準差表示,使用t檢驗比較兩組間差異,One Way ANOVA檢驗用于多重對比,P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 基于機器學習策略鑒定DKD新型診斷標志物

在訓練集數據中鑒定出100個DEGS,其中62個在DKD中低表達,38個高表達,見圖1A。使用LASSO、RF以及SVM-RFE機器學習算法分別構建診斷模型,取交集后鑒定出DKD的潛在診斷標志物為SIRT1,見圖1B～E。根據SIRT1在訓練集和驗證集中的表達量分別繪制ROC曲線,AUC分別為0.950和0.885,提示SIRT1對DKD具有良好的診斷效能,見圖1F～G。

圖1 基于機器學習策略鑒定DKD新型診斷標志物

2.2 鑒定調控SIRT1表達的miRNA

RNAhybird數據庫預測發現SIRT1 mRNA 3’-UTR中的堿基序列為miR-138-5p提供了結合位點,見圖2A。在2型DKD組和對照組中,qRT-PCR結果發現miR-138-5p在2型DKD組高表達(P<0.01,圖2B),而SIRT1 mRNA在DKD組低表達(P<0.05,圖2C)。Westernblot結果也發現SIRT1在DKD組低表達(P<0.05,圖2D和2E),提示miR-138-5p可能調控SIRT1的表達。進一步的雙熒光素酶實驗結果提示,在SV40MES13細胞中,相較于對照組,miR-138-5p能顯著降低SIRT1 mRNA 3’UTR質粒的熒光素酶活性(P<0.01,圖2F),提示miR-138-5p可直接與SIRT1 mRNA 3’UTR結合。

2.3 調控miR-138-5p/SIRT1途徑可減輕DKD腎損害

qRT-PCR結果發現miR-138-5p水平在BTBR ob/ob組及BTBR ob/ob+NC組均顯著高于正常對照組(P<0.01),在BTBR ob/ob+agomir組水平顯著高于BTBR ob/ob組(P<0.01),而在BTBR ob/ob+antagomir組水平顯著低于BTBR ob/ob組(P<0.01),見圖3A,而Westernblot結果發現腎組織SIRT1表達水平在BTBR ob/ob組及BTBR ob/ob+NC組均低于正常對照組(P<0.05),在BTBR ob/ob+agomir組表達水平顯著低于BTBR ob/ob組(P<0.01),而在BTBR ob/ob+antagomir組表達水平高于BTBR ob/ob組(P<0.05),見圖4A,提示miR-138-5p高表達及低表達動物模型造模成功,且miR-138-5p可負向調控SIRT1的表達。miR-138-5p高表達加重了2型DKD小鼠的多尿、高血糖、高脂血癥、高尿素氮以及蛋白尿癥狀,相應的miR-138-5p低表達則減輕了2型DKD小鼠的上述癥狀,差異均具有統計學意義(P<0.05),見圖3B-F,提示調控miR-138-5p/SIRT1途徑可減輕DKD腎損害。

圖3 調控miR-138-5p/SIRT1途徑可減輕DKD腎損害

2.4 調控miR-138-5p/SIRT1途徑可減輕DKD炎癥、纖維化及氧化應激

為進一步探究調控miR-138-5p/SIRT1途徑對DKD炎癥、纖維化及氧化應激的影響,檢測了PAI-1、VCAM-1、TGF-β1、CTGF、ROS以及MDA在腎組織的表達情況。相較于正常對照組,這些指標在2型DKD小鼠腎組織中均升高,差異均有統計學意義(P<0.05),相較于2型DKD小鼠,這些指標在miR-138-5p高表達模型組中均升高,在miR-138-5p低表達模型組中均降低,差異均有統計學意義(P<0.05),見圖4,提示調控miR-138-5p/SIRT1途徑可減輕DKD炎癥、纖維化及氧化應激。

圖4 調控miR-138-5p/SIRT1途徑可減輕DKD炎癥、纖維化及氧化應激

3 討論

DKD是糖尿病常見慢性并發癥之一,不僅是導致終末期腎臟病的主要原因,而且顯著增加罹患心腦血管疾病的風險,導致高致死率、高致殘率[6]。DKD目前尚缺乏特異性治療手段,早期診斷和及時干預可以改善DKD患者的預后[7]。DKD的發病機制復雜且目前尚不完全清楚,深入研究其發病機制,尋找有助于早期診斷以及治療干預的靶點具有重要意義[8]。

本研究通過數據挖掘聯合機器學習策略,鑒定出SIRT1為DKD的潛在診斷標志物。SIRT1是組蛋白去乙酰化酶家族的成員之一,以NAD+依賴的方式使P53蛋白去乙酰化,從而抑制P53的轉錄活性,進而調節細胞活動和機體穩態[9]。P53是抑癌基因TP53的蛋白質表達產物,是重要的抗腫瘤因子[10]。先前的研究已經證實,P53在DKD中存在著過度活化,并且與DKD的發生、發展密切相關[11]。逆轉DKD腎組織中SIRT1的低表達,可以抑制P53的過度活化,進而改善DKD腎組織的病理變化[12]。miRNAs對包括DKD在內的許多疾病中的多種生物學過程起著重要的調控作用[13-14]。而本研究則發現miR-138-5p可以識別和結合SIRT1,從而負向調控其表達,通過抑制miR-138-5p,即可逆轉DKD腎組織中SIRT1的低表達,進而抑制P53的表達和活性,減輕DKD腎組織的炎癥反應、纖維化及氧化應激等機制,改善DKD的腎臟損害。

綜上所述,本研究發現了miR-138-5p/SIRT1途徑在DKD發生發展中的重要作用,為DKD的早期診斷及治療干預提供了新的靶點和思路。