靈貓方調控HBV相關免疫應答的機制研究*

崔 怡 朱曉駿 尚 志 方 淼 唐亦非 高月求△

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院 (上海, 201203) 2.上海中醫藥大學曙光臨床醫學院

慢性乙型肝炎(CHB)目前仍然是全球性公共衛生問題。據統計,全球有2.57億人為慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者,是肝硬化、肝細胞癌(HCC)和肝病相關死亡的主要危險因素,每年約88.7萬人死于HBV相關疾病[1-3]。中國是世界上HBV感染負擔最重的國家,1～59歲人群中HBV表面抗原(HBsAg)的總體攜帶率為7.18%,相當于有9 300萬HBV攜帶者[4],約60%肝硬化患者和75%肝癌患者是由HBV感染引起的[5,6]。現有的抗病毒藥物雖能有效抑制病毒復制,但無法徹底清除肝細胞中的HBV cccDNA,很難達到臨床治愈[7,8]。中草藥及其活性成分以其獨特的優勢在治療CHB方面發揮重要作用,具有廣闊的應用前景[9]。靈貓方是上海中醫藥大學附屬曙光醫院肝病科治療CHB的有效驗方。前期研究發現,靈貓方可有效改善CHB患者的臨床證候,提高患者的生化指標和抗病毒應答反應,增強免疫應答[10-13]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6N雄性小鼠,3周齡,30只,SPF級,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司上海分公司[實驗動物生產許可證編號SCXK(浙)2019-0001,實驗動物使用許可證編號SYXK(滬)2017-0014,實驗動物合格證編號20211012Abzz0619000774]。本研究在北京維通利華實驗動物技術有限公司上海分公司SPF級飼養室進行動物飼養、造模與觀察。所有實驗均遵照國家相關實驗動物的使用、福利和倫理學要求等規定。

1.2 藥物與試劑 ①實驗藥物:靈貓方由仙靈脾、女貞子、黃芪、貓爪草各15 g,胡黃連、青皮各9 g組成。根據前期實驗基礎,以人鼠劑量9.1倍換算,按照11.83 g/kg劑量灌胃給藥。所用藥物均為中藥配方顆粒,由江陰天江藥業有限公司生產(生產批號:仙靈脾20056134、女貞子21066074、黃芪20116104、貓爪草19076164、胡黃連20092211、青皮21046274)。②試劑: PrcccDNA ShB2m、pCMV-Cre質粒為本實驗室所有;大腸桿菌DH5α為本實驗室保存;無內毒素質粒大提試劑盒(TIANGEN,貨號 DP117);IFNα試劑盒(GenXspan,貨號GXP557484);F4/80抗體(abcam,貨號 ab111101);DAB顯色液(邁新,貨號 DAB-2031);EDTA抗原修復液(邁新,MVS-0099);過氧化物酶阻斷劑(Biotechnologies,貨號SP KIT-A3)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1。

表1 PCR引物序列(5′to 3′)

1.3 實驗方法

1.3.1 HBV小鼠模型構建及分組情況 PrcccDNA ShB2m及pCMV-Cre質粒均用無內毒素質粒大提試劑盒制備,質粒制備方法如下:兩種質粒分別轉染大腸桿菌DH5α,從轉染的細菌平板中挑取生長良好的單菌落接種于LB液態培養基,37℃、220 r/min振蕩培養過夜,其中轉染PrcccDNA ShB2m的細菌使用含50 μg/ml氨芐青霉素的培養基,轉染pCMV-Cre的細菌使用含50 μg/ml卡那霉素的培養基。菌液4℃離心,棄上清后依次加入溶液P1、P2、P3,QF緩沖液洗脫,異丙醇沉淀,100%乙醇清洗并溶于TE緩沖液,即可獲取無內毒素的高濃度質粒。采用水動力轉染技術建立HBV小鼠模型,將小鼠按照隨機數字表法分為3組,模型組和靈貓方組小鼠尾靜脈高壓水注射1.5 ml含6 μg PrcccDNA ShB2m及pCMV-Cre質粒的生理鹽水,正常組小鼠注射等量生理鹽水。第3天采集小鼠眼眶靜脈血,Elisa檢測分析血清中HBsAg、HBeAg水平。靈貓方組小鼠按10 ml/kg劑量灌胃,2次/d;模型組和正常組小鼠以等體積飲用水灌胃,連續灌胃3 d。

1.3.2 標本留取 第3天灌胃結束后禁食12 h,用2%戊巴比妥鈉3 ml/kg腹腔注射麻醉,經眼眶靜脈叢采血,3 000 r/min離心15 min后吸取血清,-80℃低溫保存。打開腹腔,從門靜脈灌注生理鹽水沖洗肝臟,在同一肝葉位置切取一小塊組織,置入10%中性多聚甲醛中固定;另切取一小塊肝組織分裝于離心管中-80℃低溫保存;剩余肝組織研磨,4℃、400 g離心15 min后棄上清,沉淀用Percoll混勻,850 g梯度離心25 min,設置提速加速度為9、減速加速度為0,沉淀加入2 ml紅細胞裂解液室溫放置3～5 min,4℃、400 g離心7 min后棄上清,即可得到肝臟免疫細胞,-80℃低溫保存。

1.3.3 檢測指標與方法 (1)Elisa檢測血清HBsAg、HBeAg、IFNα水平:血清HBsAg、HBeAg水平委托上海中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科檢測。IFNα水平按照Elisa檢測試劑盒說明書操作,取出血清并稀釋,標準品孔加入50 μl不同濃度(2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)的標準品,設置待測樣本孔及空白孔,除空白孔外其余各孔加入酶試劑,封板溫育后重復洗滌5次,顯色,加入終止液后測定各孔的吸光度(OD值)。(2)IHC檢測肝組織F4/80蛋白表達:石蠟切片脫蠟,PBS洗3次加入EDTA抗原修復液,微波高火2 min、低火15 min修復抗原,自然冷卻至室溫后PBS洗3次,滴加3%過氧化氫以阻斷內源性過氧化物酶活性,PBS洗3次后10% BSA封閉60 min,滴加F4/80一抗(1∶500)4℃孵育過夜, PBS洗3次,滴加二抗(1∶200)室溫孵育60 min,PBS洗3次,DAB顯色,蘇木精染核,自來水沖洗,梯度乙醇脫水,樹脂封片,顯微鏡下觀察,采用Image J 軟件統計F4/80積分吸光度(IA)。(3)實時熒光定量PCR檢測肝組織TNFα、IL-1β、IL6 mRNA表達:稱取50 mg肝組織,加入500 μl RLS裂解液,全自動研磨儀勻漿90 s,RNA快速提取試劑盒提取總RNA,逆轉錄獲取cDNA,實時熒光定量PCR檢測TNFα、IL-1β、IL-6、β-actin mRNA,采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。(4)蛋白質組學檢測:肝免疫細胞加入蛋白裂解液500 μl,冰上裂解30 min,4℃、12 000 r/min離心10 min,取上清,BCA法測定蛋白濃度;二硫蘇糖醇56℃還原30 min,碘代乙酰胺室溫避光孵育15 min,37℃酶解過夜;Strata X C18(Phenomenex)除鹽,TEAB溶解,乙腈標記,室溫孵育2 h,重復除鹽后真空冷凍干燥;高pH反向HPLC分級處理60 min,真空冷凍干燥;液相色譜-質譜聯用分析,Maxquant檢索質譜數據。

2 結果

2.1 靈貓方對實驗小鼠血清HBsAg、HBeAg滴度和IFNα水平的影響 與模型組比較,靈貓方干預3 d后,靈貓方組小鼠血清HBsAg、HBeAg滴度明顯下降(P<0.05,P<0.01),IFNα水平顯著上升(P<0.01)。見圖1,圖2。

圖2 靈貓方對實驗小鼠血清IFNα水平的影響 (*P<0.01)

2.2 靈貓方對實驗小鼠肝組織F4/80蛋白表達的影響 與正常組比較,模型組小鼠肝組織F4/80蛋白表達量明顯升高(P<0.01);與模型組比較,靈貓方組小鼠肝組織F4/80蛋白表達量明顯降低(P<0.01)。見圖3。

圖3 靈貓方對實驗小鼠肝組織F4/80蛋白表達的影響 (*P<0.01)

2.3 靈貓方對實驗小鼠肝組織TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA表達的影響 與正常組比較,模型組小鼠肝組織TNFα、IL-1β、IL-6mRNA表達明顯升高(P<0.01,P<0.001);與模型組比較,靈貓方組小鼠肝組織TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA 表達明顯降低(P<0.01)。見圖4。

圖4 靈貓方對實驗小鼠肝組織TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA表達的影響 (*P<0.01)

圖6 實驗小鼠肝臟免疫細胞差異蛋白KEGG通路富集分析

圖7 實驗小鼠肝臟免疫細胞差異蛋白表達定量分析

2.4 靈貓方對實驗小鼠肝臟免疫細胞蛋白質組的影響 對模型組及靈貓方組小鼠肝臟免疫細胞質譜數據進行生物信息學分析,GO分析顯示,差異蛋白顯著富集于代謝相關功能,包括脂代謝;KEGG通路富集分析顯示,差異蛋白顯著富集于PPAR通路;差異蛋白表達定量分析顯示,與模型組比較,靈貓方組免疫細胞的代謝能力下降,天然免疫應答上升。見圖5～7。

3 討論

靈貓方以仙靈脾、女貞子為君,溫而不悍,補而不膩,并補腎之陰陽[14];貓爪草、胡黃連為臣,清化肝經濕熱疫毒;黃芪為佐,補益后天脾氣,助君藥培養先天,并使補而不滯;青皮為使,引諸藥入足厥陰之經。前期研究表明,靈貓方可促進pHBV1.3質粒轉染HepG2細胞的Ⅰ、Ⅲ型干擾素(IFN)表達,增強固有免疫功能[9];靈貓方可提高CHB患者外周血NK細胞數量及其胞內外TLR3的表達水平,調節機體免疫功能[12]。

CHB免疫發病機制十分復雜,至今尚未完全闡明[15,16]。脂質代謝已被證明在抗病毒反應中發揮重要作用[17],代謝過程的轉錄調控是早期Ⅰ型IFN反應的關鍵特征,IFN-α的生成與巨噬細胞參與膽固醇合成的基因下調有關[18]。本研究結果提示,靈貓方促進HBV感染小鼠IFNα分泌,降低HBsAg、HBeAg滴度;蛋白組學分析顯示,靈貓方可抑制免疫細胞代謝,提高天然免疫應答。據此推測,靈貓方可能通過抑制免疫細胞脂質代謝,促進IFNα分泌,從而降低HBV相關血清標志物的表達。

巨噬細胞脂依賴脂肪酸氧化途徑獲取能量,通過激活活性氧和NLRP3炎癥小體分泌IL-1β等促炎因子[19]。PPAR主要分布在肝臟、腸道及心臟組織,誘導線粒體脂肪酸氧化的限速酶CPT-1表達,增強線粒體對脂肪酸的利用和氧化[20],同時,PPAR在抑制炎癥因子生成方面亦發揮著重要作用[21]。本研究結果提示,靈貓方可降低HBV感染小鼠肝組織F4/80蛋白表達,抑制TNFα、IL-1β、IL-6等促炎因子的釋放;蛋白組學分析顯示,差異蛋白顯著富集于PPAR通路。據此推測,靈貓方可能通過作用于PPAR信號通路,降低巨噬細胞表達,抑制促炎因子的釋放。

綜上,靈貓方可能通過作用于PPAR信號通路,參與免疫細胞脂質代謝重編程,進而增強HBV相關免疫應答,同時抑制促炎因子的釋放。本研究為靈貓方調控HBV相關免疫機制提供了一定的實驗依據,為該方今后應用于CHB的臨床治療提供科學證據,具體的藥理機制有待于進一步探究。