散結片聯合立體定向放射治療對肝癌大鼠腫瘤組織中PKM2/STAT3通路及巨噬細胞極化的影響*

董 晶 張 遠 徐振華 時 楨 國 濱△ 李金芳 陳自力

1.廣州中醫藥大學金沙洲醫院 (廣東 廣州, 510080) 2.壽光市人民醫院腫瘤放療科 3.貴州醫科大學附屬醫院

肝癌起病隱匿,發現時多為中晚期,治療難度大,患者大多預后不良。放射治療曾是肝癌非手術治療的首選,隨著立體定向放射治療的臨床應用,肝癌的療效有了進一步提高。散結片是中藥復方片劑,經過數年的藥理學研究及體外、動物實驗觀察,證實本品對肝癌細胞有顯著的殺傷力及抑制作用,并在臨床應用中取得了顯著的療效。巨噬細胞有M1型(殺傷腫瘤)與M2型(促進腫瘤)兩種極化類型,腫瘤為逃避巨噬細胞的殺傷作用,可迫使其極化狀態發生改變,以促進腫瘤發展。此外,許多類型的癌細胞以糖酵解的方式來增加葡萄糖攝取,丙酮磷酸激酶(PK)是糖酵解途徑中的限速酶之一,PKM2為腫瘤的增殖、轉移提供了優勢[1],并可通過磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)促進癌細胞轉移[2]。近年來,中藥聯合放療對腫瘤治療的研究逐漸增加,本研究運用散結片聯合立體定向放射治療肝癌大鼠,觀察聯合治療對肝癌大鼠腫瘤組織中PKM2/STAT3信號通路及巨噬細胞極化的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組 大鼠肝癌RH-35細胞購自上海一研生物公司。健康SD雄性大鼠50只, 6～8周齡,體質量220～320 g,購自南京協同生物公司[動物合格證號:SCXK(蘇)2018-0125] ,常規飼養,自由飲食飲水。實驗大鼠按照隨機數字表法分為健康組(健康大鼠正常喂養)、肝癌組(肝癌模型大鼠)、散結片組(模型大鼠+散結片)、放療組(模型大鼠+定向放療)、聯合組(模型大鼠+散結片+定向放療),每組10只。

1.2 藥物與試劑 散結片(珠海米迪泰克生物公司,國藥準字:Z20040106)。TUNEL工作液(蘇州玉衡生物公司),細胞周期性蛋白(CyclinD1)、細胞周期性蛋白依賴激酶(CDK4)引物(武漢淼靈生物公司),PKM2、STAT3、p-STAT3一抗(北京百奧萊博科技公司),M1型巨噬細胞標志蛋白(CD11c)、M2型巨噬細胞標志蛋白(CD206)一抗(深圳海思安生物公司),辣根過氧化物酶二抗(河北鵬宇生物有限公司),戊巴比妥鈉(臺州浩博生物公司)。

1.3 模型建立及治療方法 健康組大鼠常規飼養,剩余大鼠接受0.5 ml(2×106個/ml)RH-35細胞肝小葉內注射,制成肝癌模型大鼠[3]。模型建立成功后,模型組大鼠進行常規飼養;放療組大鼠腫瘤直徑>1 cm時腹腔麻醉后行CT定位,經治療計劃系統進行靶區規劃及靶點設計,給予40 Gy劑量1次性照射。散結片組大鼠給予12.5 g/kg散結片灌胃,給藥10 d;聯合組大鼠在定位放療的基礎上給予12.5 g/kg散結片灌胃,給藥10 d。

1.4 檢測指標

1.4.1 HE染色觀察肝癌大鼠病理組織形態 各組大鼠戊巴比妥鈉麻醉后處死,取出肝臟組織,放于組織固定液中固定72 h,其余部分于-80℃保存。10%甲醛固定后乙醇脫水、透明石蠟包埋、常規切片,然后將石蠟切片進行透明水化,并進行HE染色,最后以中性樹膠封片,封片后在偏光顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織中的病理改變。

1.4.2 TUNEL檢測肝癌細胞凋亡 各組大鼠肝癌組織切片脫蠟,蛋白酶K室溫孵育15～30 min,PBS清洗后加入TUNEL檢測液(TdT熒光標記),室溫避光孵育1 h,PBS沖洗3次。滴加50 μl convertr-POD,室溫避光孵育0.5 h。PBS清洗,DAB液顯色,沖洗,蘇木精復染,脫水透明,封片。熒光顯微鏡下觀察,計數陽性細胞。

1.4.3 RT-PCR檢測實驗大鼠肝組織癌細胞增殖相關基因CyclinD1、CDK4 mRNA表達水平 取肝癌組織,剪碎、研磨后加入1 ml Trizol試劑,勻漿機勻漿8 min左右,加入0.2 ml三氯甲烷搖勻,常溫放置15 min后4℃、12 000 r/min離心15 min,取上清;加入0.5 ml異丙醇混勻,靜置5～10 min,4℃、10 000 r/min離心10 min,棄上清;加入75%乙醇重懸沉淀,4℃、10 000 r/min離心10 min,干燥室干燥5 min,溶解于無RNA酶的水中。將提取的RNA逆轉錄為cDNA后進行PCR反應,反應條件為:94℃ 5 min,94℃ 30 s、55℃(CDK4退火溫度為56℃)30 s、72℃ 1 min,30個循環,72℃延伸5 min。引物序列見表1。反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳,紫外透射儀觀察、拍照,并分析目的基因相對表達量。

表1 PCR引物序列

1.4.4 免疫組化檢測實驗大鼠肝組織CD11c、CD206水平 各組大鼠肝臟組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片,經脫蠟、水化、封閉、抗原修復、封閉后,37℃放置30 min,滴加稀釋的CD11c、CD206一抗(1∶200),4℃孵育過夜。次日依操作順序加入二抗及SABC,室溫DAB顯色,封片后顯微鏡觀察。

1.4.5 免疫印跡檢測實驗大鼠肝組織PKM2、STAT3、p-STAT3水平 各組大鼠肝癌組織剪碎、過濾,離心后重懸沉淀,制備細胞懸液,使用RIPA溶液從細胞中提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后轉膜,5%脫脂牛奶封閉1 h 后,分別加入PKM2、STAT3、p-STAT3一抗(1∶500) 4℃孵育過夜。TBST洗滌5 min,洗滌3次后加入辣根過氧化物酶二抗(1∶1 500)室溫孵育1 h。洗膜后加入ECL工作液,獲取圖像并進行相對表達量分析。

2 結果

2.1 實驗大鼠肝組織病理改變情況 健康組大鼠肝細胞排列有序,形態正常;肝癌組大鼠肝癌細胞生長旺盛,細胞核大小不一,總體上細胞生長分布均勻且緊密,腫瘤組織間隙有大量毛細血管分布。散結片組、放療組、聯合組大鼠腫瘤細胞有不同程度的空泡,腫瘤組織的排列更為疏松,癌細胞有所減少。見圖1。

圖1 實驗大鼠肝組織病理改變情況 (HE染色,200×)

2.2 實驗大鼠肝癌細胞凋亡情況 肝癌組大鼠肝癌細胞凋亡率顯著低于散結片組[(35.42±4.22)%,t=23.410,P<0.001],散結片組大鼠肝癌細胞凋亡率與放療組較為接近[(36.83±3.71)%,t=0.794,P=0.438],放療組大鼠肝癌細胞凋亡率低于聯合組[(48.76±5.93)%,t=5.393,P<0.001]。見圖2。

圖2 實驗大鼠肝癌細胞凋亡情況 (TUNEL,TdT熒光標記, 200×)

2.3 實驗大鼠肝組織CyclinD1、CDK4 mRNA表達水平 見表2。

表2 實驗大鼠肝組織CyclinD1、CDK4 mRNA表達水平

2.4 實驗大鼠肝組織CD11c、CD206表達情況 見圖3、表3。

圖3 實驗大鼠肝組織CD11c、CD206表達情況 (免疫組化染色,400×)

表3 實驗大鼠肝組織CD11c、CD206表達情況

2.5 實驗大鼠肝組織PKM2 、STAT3、p-STAT3表達情況 見表4,圖4。

圖4 實驗大鼠肝組織PKM2 、STAT3、p-STAT3表達情況

表4 實驗大鼠肝組織PKM2、STAT3、p-STAT3表達情況

3 討論

近幾年我國肝癌患者新發病例中死亡人數占新發病例的近4/5[4]。肝癌的病死率較高,威脅患者生命,常見的治療方法為放療,放療會產生一定的抵抗性,長時間使用效果會減弱,中藥安全性較高,無毒副作用。因此本文研究散結片聯合立體定向放射治療對肝癌大鼠腫瘤組織中PKM2/STAT3信號通路及巨噬細胞極化的影響。

體內腫瘤發生于細胞增殖和凋亡調控機制失調時,因而細胞凋亡是機體維持平衡的一個關鍵環節,因此促進肝癌凋亡可以達到治療效果。廣泛應用于臨床的放療及化療均主要通過誘導腫瘤細胞凋亡發揮療效。肝臟對放療的耐受較低,但癌細胞需高照射劑量才可殺死,因此,常規的放療對肝癌的治療受限。立體定向放療可精準定位,大劑量集束照射病變區,殺死腫瘤細胞,并減少其對周圍組織的損傷。但放療存在一定的副作用,影響患者預后。中西醫結合在避免局部復發、提高患者生存質量方面具有一定的優勢。散結片可直接作用于肝癌細胞膜系結構,在短時間內造成肝癌細胞崩潰碎裂,對肝癌細胞的殺傷作用較為顯著。散結片主要包含白附子、白鮮皮、牛黃,具有清熱解毒、活血化瘀、軟堅散結的作用,肝癌主要病機是氣滯血瘀、濕熱瘀毒、肝腎陰虛。本文通過TUNEL實驗發現,在放療的基礎上聯合散結片促進肝癌細胞凋亡的效果明顯好于單一治療的效果。此外,聯合組腫瘤組織的排列更為疏松,癌細胞有所減少,空泡增加。有研究發現PKM2可通過促進STAT3磷酸化誘導乳腺癌細胞癌轉移[5]。STAT3 是 STAT家族成員之一,在各種癌癥中被激活。STAT3被磷酸化后,具有轉錄調控的作用。在本文中,肝癌大鼠體內PKM2、STAT3水平明顯高于正常組,在經過治療后降低,以聯合組效果最為顯著。鄧秋媛等[6]研究發現,通過抑制PKM2/STAT3信號通路水平可抑制肝內膽管癌細胞的轉移并促進癌細胞凋亡。劉晶等[7]提出,抑制STAT3表達可提高肝癌細胞對化療藥物的敏感性,并促進癌細胞的凋亡。另有研究表明,散結片中的牛黃可促進肝癌細胞的凋亡并抑制增殖[8]。本研究與上述研究結果相似,聯合組可能是通過抑制PKM2/STAT3通路水平,促進肝癌細胞凋亡。

Cyclins是細胞周期機制的核心之一,對細胞周期有正調控作用。CyclinD1與CDK4結合形成CyclinD1/CDK4復合物,正向調控癌細胞,促使細胞分裂。當處于靜止期G0的細胞受刺激后首先出現cyclinDl,并同時誘導CDK4等的表達,結合成相應的CyclinDl/CDK4復合體,作用于下游蛋白,促使細胞分裂。Rb是一種抑癌基因,可以通過調控細胞周期G1期的控制點來抑制細胞增殖。CyclinDl/CDK4復合物可以使Rb磷酸化,磷酸化的Rb促進DNA轉錄,并調節DNA的復制和DNA損傷修復,使細胞通過限制點進入S期,誘導腫瘤發生。在本文中,經過放療及散結片的治療,Cyclins、CDK4水平降低,且以聯合組效果更佳。劉波等[9]研究發現,Smad通路通過抑制CyclinDl、CDK4水平,促進了肝癌細胞的凋亡并抑制了增殖。Okabe等[10]研究發現,STAT3、CyclinD1呈正相關關系,在胸腺上皮質瘤中均高表達,降低STAT3后通過抑制CyclinD1水平,減少癌細胞增殖。本研究與上述研究結果相似,放療聯合散結片可能是通過抑制STAT3通路,從而降低CyclinD1水平,調控細胞周期,抑制肝癌細胞增殖。

巨噬細胞是體內重要的免疫細胞,當體內產生炎癥反應時,其依據體內環境的變化可分化成不同的細胞表型,進而表達相應的細胞功能,此過程稱為巨噬細胞的極化。不同巨噬細胞表型可通過特異標志物鑒定,目前多將CD11c作為M1型巨噬細胞極化的標志,將CD206作為M2型巨噬細胞極化的標志。M1型巨噬細胞具有抑制腫瘤增殖和侵襲的作用;M2型巨噬細胞具有促進腫瘤細胞增殖和侵襲的作用。本研究結果顯示,與健康大鼠相比,肝癌大鼠中CD11c水平降低、CD206水平升高,在經過定向放療及散結片的干預后,CD11c水平升高、CD206水平降低,且以聯合組效果更好,提示散結片聯合定向放療可有效抑制M2型巨噬細胞極化,促進M1型局勢細胞極化。 STAT3是聯系炎癥與腫瘤的重要因子,STAT3參與腫瘤血管生成、侵襲轉移等惡性生物學行為。在與炎癥相關的腫瘤中,如結腸癌及神經系統淋巴瘤中,M2型巨噬細胞能夠促進腫瘤細胞中STAT3的活化,從而引發一系列致癌信號的激活[11,12]。M2型巨噬細胞分泌大量的細胞因子,這些因子同時也是STAT3信號活化的重要參與者。M2型巨噬細胞可正向調節肝癌細胞中STAT3水平,肝癌細胞株中STAT3蛋白磷酸化水平在與M2型巨噬細胞共培養后明顯增高。畢建強等[13]報道,放療通過降低STAT3及NF-κB水平,抑制鼻咽癌大鼠瘤體增加,并促進癌細胞凋亡。白鮮皮是散結片中的一味中藥,吳麗美[14]研究發現,白鮮皮可通過降低STAT3水平,改善肝纖維化。因此本文推測,散結片聯合定向放療抑制了PKM2/STAT3信號通路,降低了CD206表達,從而抑制細胞向M2型轉化,又通過促進CD11c表達,促使巨噬細胞向M2型轉化,從而起到促進癌細胞凋亡并抑制增殖的作用。

綜上所述,散結片聯合定向放療可能通過抑制PKM2/STAT3通路,促進巨噬細胞M1型極化并抑制其M2型極化,促進肝癌細胞的凋亡并抑制其增殖。