不同向日葵品系對(duì)菌核病抗性的綜合鑒定

王彥尊 王文浩 何麗芬 閆玉星 張 紅 劉文俊 鄭洪元 王彥雯

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)作物研究所，汾陽(yáng)032300；2 山西省文水縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，文水032100）

由 核 盤 菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）侵染引起的向日葵菌核病會(huì)使向日葵空籽率上升，產(chǎn)量降低，籽仁蛋白質(zhì)及含油量等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量下降，影響籽粒的食用價(jià)值與商品價(jià)值，最終影響經(jīng)濟(jì)效益。核盤菌子囊孢子可以通過(guò)風(fēng)力傳播，導(dǎo)致植株整個(gè)生育期均有染病可能性，防治時(shí)期難以掌握[1]。目前采用的防控措施主要包括農(nóng)藝措施、化學(xué)防治、生物防治和篩選抗病資源選育抗病品種。向日葵抗（耐）菌核病鑒定方法主要分為室內(nèi)與室外兩種條件下，其中室內(nèi)鑒定方法主要包括皮殼鑒定法、草酸鑒定法、菌土法鑒定和莖部或根頸部抗性鑒定等方法[2-6]，室外鑒定方法主要是使用牙簽法或打孔法將核盤菌接種在向日葵花盤背面[7]。向日葵菌核病主要在東北、華北、西北等種植區(qū)發(fā)生，發(fā)病率在10%～30%之間[8]，由此造成的減產(chǎn)嚴(yán)重的高達(dá)60%。培育和篩選對(duì)菌核病有抗性的向日葵育種材料仍然是未來(lái)向日葵育種家的首要任務(wù)[9]，也是防治該病害最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一[10-13]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料供試品系：材料均來(lái)源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)作物研究所向日葵課題組自主收集、選育的種質(zhì)資源，具體見(jiàn)表1。供試菌株：核盤菌菌株。供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）、基本培養(yǎng)基。

表1 供試向日葵品系資源信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離與純化核盤菌菌核取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)作物研究所食用向日葵試驗(yàn)地中的發(fā)病植株。將收集到的菌核置于75%的酒精中消毒3～5s，用無(wú)菌水漂洗2 次，再用5%次氯酸鈉溶液消毒1～3min，75%的酒精中再次消毒3～5s 后，再用無(wú)菌水漂洗3 次，用滅菌過(guò)的濾紙吸干菌核周圍水分后，接種在PDA 培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 室內(nèi)抗菌核病能力鑒定當(dāng)向日葵幼苗生長(zhǎng)至3～4 對(duì)真葉時(shí)，取其葉片進(jìn)行清洗并使用滅菌濾紙擦拭多余水分后，將試驗(yàn)材料均勻地放在直徑15cm 的培養(yǎng)皿濾紙上，葉片背面朝上備用。將純化好的菌株，接種在PDA 培養(yǎng)基上，待菌落生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿3/4 時(shí)，取邊緣菌絲塊（直徑4mm），接種在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，當(dāng)菌落鋪滿培養(yǎng)皿的80%時(shí)，使用直徑4mm 的打孔器沿著菌落邊緣打取菌絲瓊脂塊，將其接種在待測(cè)葉片葉脈兩側(cè)，使核盤菌菌絲與葉片充分接觸，以未接菌的培養(yǎng)基瓊脂塊作為對(duì)照，每個(gè)材料重復(fù)3 次，定時(shí)觀察發(fā)病情況并拍照，用十字交叉法量取病斑直徑。

1.2.3 田間抗菌核病能力鑒定將核盤菌菌核接種在PDA 培養(yǎng)基中，置于24℃的恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖14d 后，將培養(yǎng)基表面的菌核去除后稱重，將含菌絲的培養(yǎng)基粉碎后，加入無(wú)菌水配制成20g/L的菌絲懸浮液。待向日葵進(jìn)入始花期，進(jìn)行田間菌絲侵染花盤試驗(yàn)，具體試驗(yàn)方法為：將配制好的溶液均勻噴施在花盤正面的小花上，用牛皮紙袋包裹花盤做保濕處理并隔絕外部環(huán)境影響，每盤噴施量為5mL，每個(gè)品種接種10 盤，試驗(yàn)重復(fù)3 次。接種30d 后進(jìn)行病害調(diào)查與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 抗性篩選方法

1.2.4.1 室內(nèi)鑒定試驗(yàn) 待葉片接種菌絲塊48h后，用十字交叉法量取病斑直徑，并根據(jù)表2 對(duì)菌核病抗性水平進(jìn)行劃分。

表2 向日葵品系對(duì)菌核病抗性水平的劃分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4.2 室外鑒定試驗(yàn) 向日葵花盤接種PDA 菌絲懸浮液30d 后，觀察花盤背面感病面積，統(tǒng)計(jì)感病植株數(shù)量及感病等級(jí)（表3），計(jì)算病情指數(shù)（病情指數(shù)=[∑（各級(jí)別花盤數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/調(diào)查總花盤數(shù)×4]×100）進(jìn)而對(duì)被鑒定材料進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。發(fā)病率（%）=發(fā)病花盤數(shù)/處理總花盤數(shù)×100。

表3 向日葵品系抗菌核病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化及菌絲致病力鑒定將消毒菌核接種在PDA 培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)2～3d 后，菌核附近可見(jiàn)白色菌絲生成，3～4d 后菌絲擴(kuò)散至培養(yǎng)皿60%～75%，培養(yǎng)6～7d，培養(yǎng)基邊緣可見(jiàn)小顆粒菌核生成（圖1）。取培養(yǎng)3～4d 的PDA 培養(yǎng)基邊緣菌絲塊，接種在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～5d 后，取基本培養(yǎng)基邊緣菌絲塊接種在葉片背面的葉脈兩側(cè)，24h可見(jiàn)褐色壞死組織（圖2），48h 葉面出現(xiàn)大面積壞死組織（圖3），致病力較強(qiáng)。

圖1 核盤菌菌核在PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)7d 生長(zhǎng)情況

圖2 向日葵葉片接種PDA 菌絲塊24h 的生長(zhǎng)狀況

圖3 向日葵葉片接種PDA 菌絲塊48h 的生長(zhǎng)狀況

2.2 不同向日葵品系對(duì)菌核病抗性的室內(nèi)鑒定以向日葵品系對(duì)菌核病抗性水平的劃分標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，將供試的38 個(gè)品系進(jìn)行離體葉片室內(nèi)鑒定，結(jié)果見(jiàn)表4。在所有供試材料中，自交系A(chǔ)35×B35（圖4）對(duì)菌核病表現(xiàn)出一定的抗病性，自交系A(chǔ)4×B4（圖5）對(duì)菌核病表現(xiàn)出一定的耐病性，其余品系均表現(xiàn)出不同程度的感病性，且未發(fā)現(xiàn)對(duì)菌核病產(chǎn)生免疫的向日葵品系。

圖4 自交系A(chǔ)35×B35 接種菌絲塊48h 的生長(zhǎng)狀況

圖5 自交系A(chǔ)4×B4 接種菌絲塊48h 的生長(zhǎng)狀況

表4 不同向日葵品系對(duì)菌核病抗性的室內(nèi)鑒定結(jié)果

2.3 不同向日葵品系對(duì)菌核病抗性的田間鑒定以向日葵抗菌核病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，將供試的38 個(gè)向日葵品系進(jìn)行田間菌絲體懸浮液噴施鑒定，結(jié)果見(jiàn)表5。在所有供試材料中，A35×B35 與A4×B4 對(duì)菌核病表現(xiàn)出一定的抗病性，且A35×B35 向日葵花盤正面（圖6）發(fā)現(xiàn)有菌落生成，但背面（圖7）未出現(xiàn)盤腐癥狀，說(shuō)明該材料對(duì)菌核病有一定的抵抗力，雖然核盤菌對(duì)向日葵進(jìn)行了侵染并形成菌落，但未侵入植株內(nèi)部。D9 與N17 對(duì)菌核病也表現(xiàn)出一定的抗性，達(dá)到中抗水平，其余材料均表現(xiàn)出不同程度的感病性，如N7 花盤背面已經(jīng)出現(xiàn)腐爛情況，且侵染面積已經(jīng)超過(guò)75%（圖8），C32 花盤已嚴(yán)重腐爛并脫落（圖9），在脫落處可見(jiàn)新生成的核盤菌菌核。

圖6 自交系A(chǔ)35×B35 接種PDA 懸浮液30d 的生長(zhǎng)狀況

圖7 自交系A(chǔ)35×B35 接種PDA 懸浮液30d 的生長(zhǎng)狀況

圖8 自交系N7 接種PDA 懸浮液30d 的生長(zhǎng)狀況

圖9 不育系C32 接種PDA 懸浮液30d 的生長(zhǎng)狀況

表5 不同向日葵品系對(duì)菌核病抗性的田間鑒定結(jié)果

通過(guò)室內(nèi)離體葉片鑒定與室外PDA 菌絲懸浮液噴施鑒定試驗(yàn)，綜合病情指數(shù)與葉片病斑平均直徑2 項(xiàng)指標(biāo)，得出試驗(yàn)結(jié)果如下：A35×B35（品系07（Y）-136A）在兩種鑒定方法下，均表現(xiàn)出一定的抗性，其為抗菌核病品系；A4×B4（品系07（Y）-141A）經(jīng)室外鑒定，結(jié)果為抗性材料，但經(jīng)離體葉片鑒定試驗(yàn)，結(jié)果為耐性材料，綜合得出，該品系為耐菌核病材料；通過(guò)本試驗(yàn)，篩選獲得抗菌核病材料A35×B35（品系07（Y）-136A）1 個(gè)，A4×B4（品系07（Y）-141A）、D9（品系11（CX）-1）、N17（品系15（HN）-34）耐病材料3 個(gè)，D13 等中感材料9 個(gè)，B21×A21 等感病材料16 個(gè)，D14 等高感材料9 個(gè)。

3 結(jié)論與討論

在向日葵生長(zhǎng)過(guò)程中，均存在因感染菌核病導(dǎo)致大面積減產(chǎn)的現(xiàn)象，尤其是北方向日葵開花期到成熟期正逢雨季，連續(xù)降水會(huì)加重菌核病現(xiàn)象的發(fā)生，嚴(yán)重影響向日葵的生產(chǎn)效益與經(jīng)濟(jì)效益。因此，選育向日葵品種不僅要注重品質(zhì)與產(chǎn)量，還應(yīng)當(dāng)注重對(duì)菌核病的抵抗力。

核盤菌菌核致病力的強(qiáng)弱會(huì)隨著實(shí)驗(yàn)室繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加呈減弱趨勢(shì)，為保證核盤菌致病力，本試驗(yàn)通過(guò)采集上一年度新生菌核并進(jìn)行純化，用于菌核病抗性鑒定。而在常規(guī)大田噴施套袋保濕進(jìn)行菌核病鑒定的試驗(yàn)中，由于多雨濕度大等自然因素，會(huì)加重菌核病的發(fā)生，從而對(duì)品種抗菌核病鑒定造成影響，故而本試驗(yàn)結(jié)合室內(nèi)離體葉片鑒定，綜合判斷品種抗（耐）菌核病能力強(qiáng)弱，一定程度上可降低誤差。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)38 個(gè)不同向日葵品系進(jìn)行綜合鑒定，共發(fā)現(xiàn)抗菌核病材料1個(gè)，耐病材料3個(gè)，感病材料25 個(gè)，高感材料9 個(gè)，為實(shí)現(xiàn)向日葵抗菌核病的育種目標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。