高毒力肺炎克雷伯菌毒力影響因素及分子流行病學研究的進展

謝鈮奇，王杉，胡鐵弋

重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，重慶 402360

肺炎克雷伯菌（klebsiellapneumonia, KPN）是一種重要的革蘭陰性桿菌，可引起多種感染性疾病，如尿路感染、肺炎等[1]。高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent klebsiella pneumoniae, HvKP）感染首例報道來自我國臺灣地區(qū)，是一種不同于經典肺炎克雷伯菌（classic klebsiella pneumonia, cKP）的侵襲性感染[2]。HvKP毒性更強，其不僅可以在健康人群中傳播并引起危及生命的侵襲性感染，如眼內炎、化膿性肝膿腫等，且伴有擴散轉移[3]，危及生命。HvKP的發(fā)病表現(xiàn)出一定的地域特點，這可能與不同地區(qū)、不同種族的人群腸道或鼻咽部HvKP攜帶率及血清型不同有關，如一項研究表明23%的華裔健康人群腸道中有K1、K2血清型肺炎克雷伯菌定植[3]，而西班牙敗血癥患者分離的肺炎克雷伯菌中也僅有2.8%為K1、K2血清型[4]。HvKP在發(fā)現(xiàn)初期對抗生素普遍比較敏感，近年來發(fā)現(xiàn)耐藥率有上升趨勢，耐藥HvKP的發(fā)展使防治工作變得更加被動，甚至有HvKP院感爆發(fā)并致多人死亡的案例報道。為研究HvKP高毒的原因，了解耐藥率發(fā)展趨勢，以對臨床治療、院感防控、耐藥監(jiān)測及后續(xù)的研究方向提供理論基礎，本文對HvKP研究現(xiàn)狀進行了歸納總結。

1 HvKP的臨床特征研究現(xiàn)狀

1.1 臨床癥狀和感染途徑

HvKP造成的感染往往是侵襲性的，除了肺炎、傷口感染等，也可引起壞死性筋膜炎、心內膜炎、骨髓炎、眼內炎等。HvKP常可通過多種途徑引起既往體健和年輕患者嚴重的社區(qū)獲得性感染。如通過微吸或大吸口咽定植HvKP引起肺炎；結腸、會陰的定植菌可通過上行途徑導致肝膿腫或尿路感染；在醫(yī)療環(huán)境中，黏膜或上皮屏障的破壞（如氣管內管、手術切口和導管）也可能導致HvKP進入機體引起感染。有研究發(fā)現(xiàn)，HvKP感染者比普通肺炎克雷伯菌感覺者更容易出現(xiàn)肝區(qū)疼痛、寒戰(zhàn)高熱、惡心嘔吐等癥狀，且發(fā)生病死率和合并糖尿病的概率更高[5]。如相關研究報道了在1例HvKP引起的全身侵襲性感染病例中，該患者有糖尿病病史。

1.2 臨床診斷

目前診斷HvKP最普遍的方法是細菌培養(yǎng)結合臨床特征。細菌培養(yǎng)后通過拉絲實驗鑒別HvKP和普通肺炎克雷伯菌。最初認為高黏性表型對于判斷菌株是否為HvKP具有敏感度和特異度，即當用接種環(huán)來拉伸瓊脂板上的菌落時，形成長度為5 mm的黏液絲，也稱為拉絲實驗陽性。

但事實證明并非所有HvKp菌株都是高黏的，一些cKp菌株也可能具有這一特征。所以研究者們試圖通過一些基因或載體的測定來判斷菌株是否為HvKP，如有研究表明毒力基因peg-344、iroB、iucA、prmpA、prmpA2和鐵載體產量＞30 g/mL可用來區(qū)分HvKp與cKp菌株[2]。

1.3 臨床治療與預后

目前對于HvKP的治療主要包括抗生素治療和外科干預。具體的治療方案取決于醫(yī)生對病情的評估，主要根據感染部位及嚴重程度進行評估，如腦、硬膜外間隙等危險部位或已經破裂的膿腫應考慮立即進行手術。肝臟等部位的膿腫則根據膿腫大小決定治療方案，＞5 cm的肝膿腫一般采取大口徑導管引流或切開引流，甚至同時進行肝切除，對于較小的膿腫，也可根據情況僅使用抗生素治療。

2 HvKP的毒力影響因子

2.1 莢膜

2.1.1 莢膜多糖 莢膜是肺炎克雷伯菌最外層的結構，是造成HvKP黏液表型的重要原因，主要成分是莢膜多糖。其具有很強的防御功能，包括粘附、形成生物膜、抗中性粒細胞吞噬作用，抑制抗菌肽（人β-防御素、乳鐵蛋白），抑制補體的殺傷和抑制炎癥反應，如活性氧（reactive oxygen species, ROS）、白介素-6（interleukin-6, IL-6）、白介素-8（interleukin-8,IL-8）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等炎癥因子下降。故莢膜多糖產量增多是造成HvKP高毒性的重要原因之一。HvKP高毒力的遺傳決定因素通常存在于大毒力質粒（plasmid-LVPK, p-LVPK）和染色體可移動遺傳元件上。cpsB與cpsG等基因負責多糖的合成[6]，位于毒性質粒p-LVPK上的黏液表型調節(jié)基因A（regulator of mucoid phenotypegene A, rmpA）/rmpA2[7]通過調控染色體上的莢膜合成基因cps的表達從而調控莢膜多糖的產量[8]，另外莢膜合成基因rcsA、rcsB的上調也是造成莢膜多糖合成增加的原因。2004年首次報道的毒力基因magA一般位于染色體上[7]，編碼莢膜組裝過程中的重要蛋白。

2.1.2 莢膜血清型 由于莢膜相關等位基因wzi的核酸序列不同，莢膜多糖的成分各不相同，根據莢膜多糖的成分不同，可將肺炎克雷伯菌分成不同的血清型。目前確定的血清型至少有134種，HvKP最常見的血清型有K1、K2、K5、K20、K54、K57，其中K1、K2最為常見。這些血清型高毒的原因可能是由于莢膜成分缺少巨噬細胞吞噬病原體時與細菌表面結合所需的糖分子（如病原體表面重復的甘露糖或鼠李糖）[9]。

2.2 菌毛

菌毛是細菌外部的突起，有助于細菌的粘附和定植，故也是細菌重要的毒力因素，肺炎克雷伯菌主要有Ⅰ型和Ⅲ型兩種菌毛。Ⅰ型菌毛為線狀突起，編碼基因是fimB，能定植于尿道和膀胱，與尿路感染密切相關。Ⅲ型菌毛為螺旋狀細絲，由mrk-ABCDF基因編碼，與K2血清型密切相關，主要介導導管相關感染。

2.3 脂多糖

也叫做內毒素，是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，由脂質A、O抗原與核心多糖構成，其中O1型是HvKP最常見的O抗原，可阻止補體與細菌結合[10]，如阻止補體C1q與細菌結合，從而抑制補體途徑的激活[11]。wabG和uge等基因與脂多糖相關[12]。

2.4 鐵攝入系統(tǒng)

鐵對于細菌新陳代謝至關重要，但細菌自身不合成鐵，需從外界攝入，故鐵攝取系統(tǒng)是細菌重要的毒力分子機制，鐵載體作為一種低分子量的鐵螯合劑是細菌從外界攝取和轉運鐵的蛋白，有研究證明HvKP比cKP產生更多的鐵載體，總鐵載體產量與菌株的毒力大小密切相關。肺炎克雷伯菌合成4種鐵載體：腸桿菌素、耶爾森菌素、沙門菌素、氣桿菌素[13]。編碼鐵載體的基因主要有kfuBC、iucB、aer、iroNB等。HvKP中氣桿菌素最多，占80%～90%，由iucABCD-iucA基因編碼，有研究證明氣桿菌素能顯著提高細菌在人腹水、血清等體液及小鼠全身及肺部等組織中的存活率[14]。宿主產生鐵載體結合蛋白脂質運載蛋白2，阻礙鐵的獲取而抗菌。沙門菌素是高度糖基化的腸桿菌素，能逃逸脂質運載蛋白2的結合，主要通過調控iroA基因簇和iroBCDE，所以攜帶沙門菌素的肺炎克雷伯菌，更容易在鼻咽部定植[8]。

2.5 其他毒力因素

菌株序列類型和毒力質粒也是重要的毒力因素。通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)，HvKP來的序列大多為ST11、ST23、ST65幾種類型，序列類型通常與血清型之間存在一定的關聯(lián)，ST23型菌株絕大多數為K1血清型，肝膿腫患者的膿液標本中分離菌株常為此種類型。ST65型菌株大多為K2血清型，與各種侵襲性感染相關。HvKP的毒力基因位于染色體、共軛元件、毒力質粒上，目前發(fā)現(xiàn)的毒力質粒主要有pLVPK、pK2044等，rmpA、rmpA2、iro、iuc、peg-344等重要的毒力基因位于毒力質粒上，所以毒力質粒對于HvKP的高毒因素至關重要。

3 流行病學及分子流行病學研究現(xiàn)狀

3.1 血清型差異

不同地區(qū)HvKP的莢膜血清型存在很大的區(qū)別，其中K1和K2型在亞洲地區(qū)最為常見而在歐美地區(qū)不常見。這可能也是造成HvKP地理分布差異的原因。

3.2 分子流行病學研究現(xiàn)狀

由于各地HvKP的感染情況各不相同，對當地HvKP菌株進行分子流行病學研究成為一種必要。各地學者常通過藥敏試驗、毒力基因和莢膜血清型檢測及多位點序列分型（multilocus sequence typing, MLST）分析進行研究。如金曉立等[15]研究了HvKP菌導管相關血流感染的菌株莢膜血清型和MLST，發(fā)現(xiàn)引起導管相關敗血癥的HvKP菌株相比cKP對多數抗菌藥物耐藥率較低，其莢膜血清型分布以K1、K2為主，MLST分型以ST23、ST86、ST65為主。另一研究顯示腹腔感染患者分離的KPN中，HvKP的莢膜血清分型以K1型為主，毒力基因以peg-344和icuA為主（61.9%、54.6%）。徐水寶等[16]研究了某3家醫(yī)院侵襲HvKP，發(fā)現(xiàn)HvKP組中以K1血清型為主，總體上HvKP組的毒力基因陽性率較cKP組更高，尤其是rmpA2、magA、fimH、aero iutA、kfuBC。

4 HvKP的耐藥機制

4.1 HvKP耐藥機制

HvKP在發(fā)現(xiàn)初期除了對氨芐西林和替卡西林天然耐藥以外，對其他抗菌藥物普遍比較敏感。然而，隨著廣譜抗菌藥物的使用，耐藥率逐漸升高并出現(xiàn)了多重耐藥的HvKP。這可能與質粒或可移動元件的水平轉移有關：一方面，HvKP獲得了耐藥質粒或含有耐藥基因的結合元件轉移到HvKP內部并整合于染色體上造成HvKP的高耐藥性。另一方面，多重耐藥的cKP也能獲得毒力質粒從而變成高毒力的耐藥菌株。另外，HvKP外排泵系統(tǒng)的激活也是HvKP耐藥的原因。

4.2 高耐藥HvKP的種類

4.2.1 產超廣譜β內酰胺酶的HvKP（extendedspectrum β-lactamases-hypervirulent klebsiella pneumoniae, ESBLs-HvKP） β內酰胺酶如AmpC能水解頭霉素造成細菌對頭孢類藥物耐藥，超廣譜β內酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases, ESBLs）是一種經修飾的β內酰胺酶，可水解一代至三代頭孢菌素及部分四代頭孢菌素、單酰胺類抗生素、青霉素等造成耐藥。ESBLs-HvKP是最常見的多重耐藥HvKP，菌株攜帶blaCTX-M、blaTEM等基因，產生CTX-M、TEM、OXA等種類的ESBLs。

4.2.2 耐碳青霉烯的HvKP（carbapenem resistance-HvKP, CR-HvKP） 我國CR-HvKP檢出率也相對較高，如2014—2017年我國58%的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem resistance-klebsiella pneumoniae, CRKP）攜帶毒力編碼質粒，其中13%的CRKP菌株表現(xiàn)出高毒力表型[17]。如一項針對寧波地區(qū)收集的150例HvKP的研究中，發(fā)現(xiàn)CR-HvKP占比高達9.33%[18]。菌株對碳青霉烯類抗生素耐藥是由于細菌產生了KPC、OAX-48、NDM等類型的碳青霉烯酶，CR-HvKP產生酶的種類不同其高毒耐藥融合機制也不一樣。劉巖等[19]收集江西省11個地級市3年分離的CRKP共749株進行研究，發(fā)現(xiàn)CR-HvKP共126株（占比16.82%），以K64型為主（占比88.10%），ST分型均為ST11型，CR-HvKP所攜帶的耐藥基因大多為blaKPC（占比80.91%）。有研究發(fā)現(xiàn)，我國CR-HvKP主要攜帶blaKPC-2耐藥基因，產生KPC-2型碳青霉烯酶[20]。序列類型主要為ST11、ST65，可能原因為CR-cKP獲得了pLVPK樣毒力質粒。

4.2.3 其他耐藥類型的HvKP 如多粘菌素或替加環(huán)素耐藥菌株的發(fā)現(xiàn)使HvKP的防治難度進一步加大，多粘菌素是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌的最后一道防線，造成耐藥可能的原因是攜帶耐藥基因mcr-1的質粒在細菌之間的水平傳播，具體的機制及治療措施還不明確，仍需進一步的研究。

4.3 多重耐藥HvKP的防控措施

耐藥使得HvKP的治療尤為棘手，國內外均有院內感染造成多起死亡病例發(fā)生的案例，如2019年發(fā)生于溫州某醫(yī)院重癥監(jiān)護室的HvKP院內感染，造成8位患者死亡，病死率為100%。因此，多重耐藥HvKP的防控一定要嚴格遵守當地院感防控政策，主要表現(xiàn)在檢驗科微生物室及時出具報告并作為危急值報告臨床科室，隨后醫(yī)生下解除隔離醫(yī)囑，護士執(zhí)行醫(yī)囑并進行環(huán)境消毒，同時應對該科室的環(huán)境衛(wèi)生、醫(yī)務人員手衛(wèi)生等進行定期的監(jiān)測。院感科應定期對該地區(qū)或醫(yī)院檢出的菌株進行耐藥率分析、報告。

5 結語

綜上所述，通過不斷對HvKP的研究，很大程度上了解了HvKP的臨床特征，毒力因素及相關機制，并提出了一些診斷方法。目前常見的診斷方法主要是臨床癥狀結合拉絲試驗、基因檢測、鐵載體含量測定等。但由于目前尚未有一種公認的精準診斷HvKP感染的方法，所以研究仍需進行。一方面，需要進一步研究HvKP的毒力機制，尋找準確快速診斷HvKP的方法，提高HvKP的治療效果；另一方面，各地區(qū)也需要進行分子流行病學的研究，為各地區(qū)的防治工作提供理論依據，減少耐藥菌株的產生。