酶解制備蠶蛹免疫肽條件優(yōu)化

李慶榮 陳敏儀 邢東旭 肖 陽 張偉龍 楊 瓊

酶解制備蠶蛹免疫肽條件優(yōu)化

李慶榮 陳敏儀 邢東旭 肖 陽 張偉龍 楊 瓊

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 廣東廣州 510610）

蠶蛹蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，在畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中備受關(guān)注。文章以新鮮蠶蛹為原料，以抑菌活性為目標(biāo)，采用酶解法制備具有較好抑菌活性的酶解產(chǎn)物，并通過單因素試驗(yàn)的方法優(yōu)化酶解工藝條件。結(jié)果顯示：在pH=3.0、酸性蛋白酶量6 000 U/g、酶解溫度43 ℃、酶解時(shí)間4 h的工藝條件下，得到的酶解液抑菌活性較強(qiáng)。期望研究結(jié)果為蠶蛹蛋白源生物活性肽的制備提供一定的理論基礎(chǔ)，并為其在淡水養(yǎng)殖飼料中的應(yīng)用提供參考。

蠶蛹；酶解；免疫肽

隨著漁業(yè)的迅速發(fā)展與擴(kuò)張，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)進(jìn)入了高密度、高產(chǎn)量的精養(yǎng)模式，水產(chǎn)養(yǎng)殖病害日益嚴(yán)重。抗生素等魚藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖與疾病控制中起著不可替代的作用。然而，由于魚藥大多是仿制獸藥、人用藥和農(nóng)藥等，存在科學(xué)性不足、針對性不強(qiáng)、藥效不高、對環(huán)境影響大等問題。根據(jù)《中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第194號》，飼料用抗生素自2020年7月1日起全面退出市場，為保障畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖的生產(chǎn)效益和食品安全，開發(fā)安全、高效的抗生素替代品成為養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的難點(diǎn)和熱點(diǎn)[1-2]。

我國蠶桑資源豐富，桑園種植面積超過1 300萬畝，蠶蛹年產(chǎn)量達(dá)30萬t以上。蠶蛹中蛋白質(zhì)含量較高，占其干物質(zhì)重的45%～50%，蠶蛹蛋白是一種比大豆蛋白更具營養(yǎng)價(jià)值的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源。近幾年，蠶蛹蛋白在鳊魚、草魚、鴨嘴魚、南美白對蝦、羅氏沼蝦等水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用研究表明，其能明顯降低飼料成本，提高生長速度，降低餌料系數(shù)等[3-5]。

蠶蛹不僅是優(yōu)質(zhì)蛋白原料來源，還富含黃酮、抗菌肽、誘食肽等功能性活性物質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)的功能性飼料原料。蠶蛹作為一種蛋白源添加進(jìn)魚類飼料中，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，將在水產(chǎn)養(yǎng)殖與飼料優(yōu)化方面的發(fā)展中起到重要作用[6]。酶解和發(fā)酵處理是常用的制備蠶蛹蛋白活性肽和改善飼料用蠶蛹原料品質(zhì)的方法。Rangacharyulu等發(fā)現(xiàn)蠶蛹經(jīng)特殊微生物發(fā)酵后作為魚飼料進(jìn)行投喂，能夠顯著提高魚苗的成活率和產(chǎn)量[7]，這為淡水養(yǎng)殖魚類疾病提供了新的治療方案。酶解是一種以蛋白質(zhì)為底物，在酶的催化下，大分子蛋白質(zhì)經(jīng)過水解反應(yīng)轉(zhuǎn)化為小分子的肽或氨基酸的過程，條件溫和，安全且價(jià)格低廉，原料易取[8]。有研究表明，蠶蛹粉經(jīng)酶解后大分子蛋白降解為小分子多肽，這些肽可能具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、促生長和抗腫瘤等多種功能[9-10]。由于不同蛋白酶的酶解產(chǎn)物不同，蠶蛹蛋白的酶解液功能也有很大差異。因此，為了獲取一種能夠提高淡水魚類免疫力的蠶蛹免疫肽的制備方法，本文以新鮮蠶蛹為原料，以提高酶解液對水產(chǎn)病原菌的抑菌活性為目標(biāo)，篩選合適的蛋白酶并優(yōu)化了該蛋白酶的酶解工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮蠶蛹由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供。所用水產(chǎn)病原菌包括嗜水氣單胞菌（）、熒光假單胞菌（）和哈維氏弧菌（），皆為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所蠶桑南藥與微生物資源加工利用研究室保存。酶解選用的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶，為上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)。腦心浸出液肉湯（BHI）培養(yǎng)基為環(huán)凱生物科技有限公司生產(chǎn)。抗生素對照選取慶大霉素，為北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 不同蛋白酶酶解液制備

稱量一定質(zhì)量的新鮮蠶蛹，與水混合（蠶蛹與水的質(zhì)量比為1∶1），由勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理。選用不同的蛋白酶作為候選酶解酶，按表1的酶解條件進(jìn)行酶解，收集酶解液，煮沸5 min滅活后，滅活的酶解液通過75 μm孔徑濾布過濾，收集濾液用于抑菌圈試驗(yàn)。

表1 不同蛋白酶酶解條件

1.3 平板抑菌法

采用平板打孔法測定酶解液的抑菌效果。首先，配制LB培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方見表2，若配制液體培養(yǎng)基則不加瓊脂）和BHI培養(yǎng)基，按1%的接種比例接種嗜水氣單胞菌和熒光假單胞菌到LB液體培養(yǎng)基中，接種哈維氏弧菌到BHI液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。然后，分別在LB固體培養(yǎng)基及BHI固體培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)好的嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌及哈維氏弧菌（菌株終濃度約為1×106CFU/mL～5×106CFU/mL），搖勻，倒入培養(yǎng)皿，凝固后用打孔器打孔。最后，用制得的酶解液在孔中點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量均為60 μL，培養(yǎng)基中間加入慶大霉素作為陽性對照，待吸收干燥后，30 ℃倒置培養(yǎng)過夜，觀察抑菌圈。

圖1 不同蛋白酶酶解液的抑菌效果

圖中A、B、C分別為含哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌和熒光假單胞菌的平板；1、2、3、4分別為木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶酶解液；箭頭所指為酸性蛋白酶酶解液對所檢病原菌的抑菌圈，短線所示為抑菌圈半徑大小；中間為抗生素對照。

表2 LB固體培養(yǎng)基配比

1.4 酸性蛋白酶酶解條件優(yōu)化

根據(jù)不同蛋白酶酶解液抑菌圈試驗(yàn)的結(jié)果（具體見2.1節(jié)），選擇酸性蛋白酶為本試驗(yàn)的目標(biāo)蛋白酶，進(jìn)一步對酸性蛋白酶酶解蠶蛹漿液的條件進(jìn)行優(yōu)化。按照1.2節(jié)的試驗(yàn)方法對蠶蛹進(jìn)行勻漿，而后在其他條件一定的情況下，分別改變pH（3.0、4.0、5.0和6.0）、酶解溫度（37 ℃、40 ℃、43 ℃、46 ℃）、酸性蛋白酶量（4 000 U/g、5 000 U/g、6 000 U/g、7 000 U/g和8 000 U/g）、酶解時(shí)間（1 h、2 h、3 h、4 h和5 h）進(jìn)行酶解，以抑菌活性為目標(biāo)，針對嗜水氣單胞菌和熒光假單胞菌進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同蛋白酶酶解液抑菌效果比較

將用不同蛋白酶制備的酶解液濾液用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，采用平板抑菌法進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。可見酶解4 h后，酸性蛋白酶酶解液對所測病原菌都有顯著的抑菌效果，而其他3種蛋白酶酶解液則沒有明顯的抑菌圈，如圖1所示，箭頭所指為酸性蛋白酶酶解液的抑菌圈。基于本部分的結(jié)果，在后續(xù)試驗(yàn)中選擇酸性蛋白酶作為蠶蛹漿液的酶解酶。

2.2 不同酶解條件下酸性蛋白酶酶解液抑菌效果分析

2.2.1 不同pH

分別調(diào)節(jié)蠶蛹勻漿的pH為3.0、4.0、5.0、6.0，加入酶用量為6 000 U/g的酸性蛋白酶，在43 ℃下酶解4 h后，100 ℃煮沸使酶失活，用75 μm孔徑濾布過濾得到濾液，進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，可以看出，在pH=3.0條件下酶解的蠶蛹酶解液對2種細(xì)菌（嗜水氣單胞菌和熒光假單胞菌）的抑菌效果最好，其次是pH=4.0，而在pH=5.0和pH=6.0下酶解液沒有抑菌效果。

圖2 不同pH條件下酸性蛋白酶酶解液的抑菌效果

A為嗜水氣單胞菌平板，B為熒光假單胞菌平板。1、2、3、4分別代表酶解pH為3.0、4.0、5.0、6.0，中間為抗生素對照。

2.2.2 不同酶解溫度

調(diào)節(jié)蠶蛹勻漿的pH為3.0，加入酶用量為6 000 U/g的酸性蛋白酶，分別在37 ℃、40 ℃、43 ℃、46 ℃下酶解4 h后，100 ℃煮沸使酶失活，用75 μm孔徑濾布過濾得到濾液，進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，可以看出，在37 ℃下酶解的蠶蛹酶解液對2種細(xì)菌（嗜水氣單胞菌和熒光假單胞菌）的抑菌效果最差，在43 ℃下酶解的蠶蛹酶解液對2種細(xì)菌的抑菌效果最好。

圖3 不同酶解溫度下酸性蛋白酶酶解液的抑菌效果

A為嗜水氣單胞菌平板，B為熒光假單胞菌平板。1、2、3、4分別代表酶解溫度為37 ℃、40 ℃、43 ℃、46 ℃；A中間為抗生素對照，B中間為無菌水對照（排除假陽性的可能）。

2.2.3 不同酶量

調(diào)節(jié)蠶蛹勻漿的pH為3.0，加入酸性蛋白酶的用量分別為4 000 U/g、5 000 U/g、6 000 U/g、7 000 U/g、8 000 U/g，在43 ℃下酶解4 h后，100 ℃煮沸使酶失活，用75 μm孔徑濾布過濾得到濾液，進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，可以看出，在6 000 U/g、7 000 U/g、8 000 U/g酶量下酶解的蠶蛹酶解液對2種細(xì)菌（嗜水氣單胞菌和熒光假單胞菌）的抑菌效果比在4 000 U/g和5 000 U/g下更好。

圖4 不同酶量條件下酸性蛋白酶酶解液的抑菌效果

A為嗜水氣單胞菌平板，B為熒光假單胞菌平板。1、2、3、4、5分別代表酶解的酶量為4 000 U/g、5 000 U/g、6 000 U/g、7 000 U/g、8 000 U/g；中間為抗生素對照。

2.2.4 不同酶解時(shí)間

調(diào)節(jié)蠶蛹勻漿的pH為3.0，加入酶用量為6 000 U/g的酸性蛋白酶，在43 ℃下分別酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后，100 ℃煮沸使酶失活，用75 μm孔徑濾布過濾得到濾液，進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，可以看出，不同酶解時(shí)間的蠶蛹酶解液對2種細(xì)菌（嗜水氣單胞菌和熒光假單胞菌）的抑菌效果差別不大。

圖5 不同酶解時(shí)間下酸性蛋白酶酶解液的抑菌效果

A為嗜水氣單胞菌平板，B為熒光假單胞菌平板。1、2、3、4、5分別代表酶解時(shí)間為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h；A中間為抗生素對照，B中間為無菌水對照（排除假陽性的可能）。

3 分析與討論

蠶蛹作為一種飼料用蛋白源在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛，在水產(chǎn)養(yǎng)殖與飼料配方優(yōu)化中起到重要作用。大分子蛋白經(jīng)蛋白酶酶解后變成小分子多肽，利于動物的消化與吸收，更提高了抗菌、免疫及抗氧化等活性。根據(jù)蛋白酶的作用機(jī)理，不同蛋白酶因?yàn)樽饔梦稽c(diǎn)的差異，酶解產(chǎn)物不同，蠶蛹蛋白的酶解液功能也有很大差異。

本文通過對蠶蛹進(jìn)行不同蛋白酶酶解，篩選出適宜的酶解酶為酸性蛋白酶，而其他幾種候選蛋白酶的酶解產(chǎn)物對目標(biāo)病原菌無顯著的抑制效果。這可能是因?yàn)椴煌鞍酌傅淖饔梦稽c(diǎn)差異導(dǎo)致酶解產(chǎn)物不同，小分子的肽段活性也有所不同。利用單因素試驗(yàn)，獲得了酶解后抑菌活性顯著增強(qiáng)的酶解工藝：pH=3.0、酶解溫度43 ℃、酶量6 000 U/g、酶解時(shí)間4 h。在其他條件下，比如酶解溫度46 ℃、酶量7 000 U/g～8 000 U/g、酶解時(shí)間5 h等，獲得的酶解液也有較好的抑菌效果，但考慮到生產(chǎn)上的成本控制及酶解效率等，優(yōu)先選擇上述酶解工藝。本研究明確了制備針對哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌及熒光假單胞菌等水產(chǎn)病原菌具有高抑菌活性的蠶蛹免疫肽的工藝，為蠶蛹在健康養(yǎng)殖中的高值化利用提供參考。

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S886.9

A

2095-1205(2023)11-01-04

10.3969/j.issn.2095-1205.2023.11.01

佛山市財(cái)政專項(xiàng)資金2022年度高水平廣東省農(nóng)業(yè)科技示范市建設(shè)項(xiàng)目“多功能蠶蛹蛋白增強(qiáng)淡水養(yǎng)殖魚類免疫力的研究及其應(yīng)用”

李慶榮（1977—），女，漢族，山東濰坊人，博士研究生，副研究員，研究方向?yàn)樾Q桑資源綜合利用。

楊瓊（1970—），女，漢族，廣東潮州人，碩士研究生，研究員，研究方向?yàn)樾Q桑資源綜合利用。