局部應用傅山風濕外治方對膠原誘導性關節炎大鼠炎性細胞因子和Notch2通路的影響＊

高玉亭，李 振，趙彩虹，趙雨薇，王 澤，郝慧琴

（山西中醫藥大學基礎醫學院 晉中 030619）

類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，其特征是炎癥、腫脹和關節破壞，主要影響外周關節[1]。治療RA 的傳統藥物主要有非甾體抗炎藥和改善病情的抗風濕藥物等。目前用于治療RA 的藥物價格昂貴，并且經常對患者的健康造成不利影響，迫切需要通過更加安全、有效和廉價的治療方法應用于RA 治療，而針對RA 炎癥的局部應用藥物是潛在的治療方法[2]。中醫藥在RA 治療中具有巨大的潛力，局部使用中藥膏劑用于治療關節炎等肌肉骨骼損傷和疼痛有著悠久的歷史并廣泛應用于臨床[3-4]。

傅山風濕外治方來源于清代山西名醫傅山《大小諸證方論》，由牛皮膠、天南星、生姜、羌活、乳香和沒藥6 味藥組成，具有祛風勝濕、散寒止痛、活血消腫等功效，局部應用于治療“痹證”[5]。課題組前期研究結果顯示，傅山風濕外治方對RA 的治療作用可能與抑制Notch1/Jagged1 通路激活，調節Th1/Th2 細胞因子平衡有關[6]，但其對Notch2/DLL1 通路的影響尚不明確。Notch2 調控破骨細胞生成介導RA 骨破壞，而RA 以慢性炎癥和關節破壞為主要特征，因此，本研究探討局部應用傅山風濕外治方對膠原誘導性關節炎（Collagen-induced arthritis，CIA）大鼠炎性細胞因子和Notch2 表達的影響，以期為局部應用傅山風濕外治方治療RA提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

1.2 傅山風濕外治方外治方的制備

黃明膠（Cat. No.1812001）購自東阿阿膠股份有限公司，天南星（Cat. No.180101）和羌活（Cat. No.181101）購自山西元和堂中藥有限公司，乳香（Cat.No.18180405402）購自河北百合中藥飲片有限公司，沒藥（Cat. No.465180701）購自安國市遠元藥業有限公司，經鑒定質量符合國家藥典標準。將以上藥物冷凍干燥后分別使用粉碎機粉碎30 s，過80目篩后按4∶1∶1∶1∶1比例混合。生姜購自當地農貿市場，經鑒定質量符合國家藥典標準，清洗后在攪拌機中磨碎，3000 r·min-1離心20 min，取上清。將獲得的生姜汁加入前述混合物中，85℃下以300 r·min-1轉速攪拌20 min，常溫下繼續攪拌至冷卻得到膏劑，濃度為1 g·mL-1

1.3 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原（Cat. No. 20022）購自美國Chondrex公司；完全/不完全弗氏佐劑（Cat. No. F5881、F5506）購自美國Sigma 公司；腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）和干擾素-γ（Interferon- γ，IFN- γ）ELISA 試劑盒（Cat. No.E02T0008, E02I0006, E02I0309, E02I0345）購自上海藍基生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒（Cat. No.9108）、反轉錄試劑盒（Cat. No. RR047A）和熒光定量試劑盒（Cat. No. 639676）購自寶生物工程（大連）有限公司；Notch2 抗體（Cat. No. bs-21664R）、核因子-κBp65（nuclear factor-κBp65，NF-κBp65）抗體（Cat.No. Bioss bs-0465R）購自北京博奧森生物技術有限公司，Delta-like 配體蛋白1（delta-like ligand protein-1，DLL1）抗體（Cat. No. A14277）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，GAPDH 抗體（Cat. No. ab181602）購自Abcam 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗（Cat. No. SE134）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Cat. No.PC0020）、ECL 顯色液（Cat. No. PE0010）購自北京索萊寶科技有限公司。天冬氨酸轉氨酶（Aspartate transaminase，AST）、丙氨酸轉氨酶（Alanine transaminase，ALT）、血尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）和肌酐（Creatinine，Cr）測定試劑盒（Cat. No.C010-2-1、C009-2-1、C013-2-1、C011-2-1）購自南京建成生物工程研究所。

正置顯微鏡購自德國徠卡公司，酶標儀購自美國賽默飛公司，高速冷凍離心機購自德國Eppendorf股份公司，熒光定量PCR 儀購自新加坡Life Technologie 公司；化學發光成像分析系統購自美國Bio-Rad公司。

1.4 CIA大鼠模型構建、分組和給藥

采用隨機數字表法將36 只大鼠隨機分為正常組10 只和造模組26 只。CIA 大鼠模型構建參考已有方法進行[7]，簡而言之，按1∶1 將牛Ⅱ型膠原溶液和完全弗氏佐劑混合并乳化，按每只5 mL在大鼠尾跟和背部進行多點皮下注射。第7 天，將弗氏完全佐劑替換成不完全弗氏佐劑，按每只0.3 mL 腹腔注射進行加強免疫。第14天，對造模組大鼠進行關節炎指數評分[8]，評分≥4分則判定為造模成功用于后續實驗[9]。將造模成功的20 只大鼠按隨機數字表法平均分為模型組和傅山風濕外治方組各10 只。第14 天，將0.4 mL（根據“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”換算）傅山風濕外治方藥膏均勻涂抹于大鼠踝關節，覆蓋紗布并使用塑料薄膜固定以防止被大鼠舔食。正常組和模型組給予等體積生理鹽水局部涂抹。每天更新2次，連續使用42天。

1.5 標本采集

第56天，大鼠禁食過夜，3%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，腹主動脈取血，3000 r·min-1離心10 min，收集血清。取左踝關節滑膜組織液氮凍存，右踝關節、肝和腎組織4%多聚甲醛固定，取脾臟凍存。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1 關節炎指數評分

2.4 王屋鎮各樹種的保護級別 王屋鎮古樹名木一級古樹21株，所占比例為22.3%；二級古樹48株，所占比例為51.1%；三級古樹25株，所占比例為26.6%(表4)。

第14天開始每周進行關節炎指數評分，評分于給藥前實施。由非實驗參與人員通過視覺檢查大鼠四肢關節的腫脹程度評估關節炎的嚴重程度。評分標準[8]為：0分：無關節紅腫；1分：踝關節或足趾的輕度紅腫；2 分：踝關節的中度紅腫；3 分：包括趾關節在內的全足明顯紅腫；4 分：全足明顯紅腫伴關節變形、功能障礙。評分最高為16分。

1.6.2 HE 染色檢測大鼠踝關節、肝和腎組織病理學變化

4%多聚甲醛固定大鼠踝關節（10% EDTA 脫鈣5 周）、肝和腎組織，脫水透明后石蠟包埋，切成4 μm薄片，將切片進行HE 染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察病理學變化。采用盲法對踝關節H&E 染色進行病理學評分，評分標準[10]為：0 分：正常踝關節；1 分：正常滑膜，偶見單核細胞；2分：明確關節炎，滑膜襯里細胞幾層扁圓形，單個核細胞散在分布，單核細胞密集浸潤；3分：滑膜明顯增生，3層以上內襯細胞層排列松散，單核細胞密集浸潤；4分：嚴重滑膜炎伴血管增生，關節軟骨及軟骨下骨質侵蝕。

1.6.3 ELISA 檢測大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ水平變化

分別設置空白對照孔、標準孔和待測樣本孔，分別加入100 μL樣品。在各孔中加入酶標記溶液50 μL，密封后37℃孵育反應1 h。各孔依次加入顯色劑A、B 50 μL，25℃避光反應10 min，加入終止液50 μL，使用酶標儀檢測450 nm 波長處光密度值，根據標準曲線計算大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 濃度。實驗重復3次，取平均值。

1.6.4 qRT-PCR 檢測大鼠踝關節滑膜和脾臟組織Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA表達水平變化

使用Primer Premier 5.0 軟件分別設計Notch2、DLL1、NF-κBp65和β-actin基因引物并合成（表1）。提取大鼠踝關節滑膜組織和脾臟總RNA 并檢測其濃度和純度，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，反轉錄條件37℃ 15 min，85℃ 5 s。qRT-PCR 檢測Notch2、DLL1、NF-κBp65mRNA 水平，20 μL 反應體系包括qPCR 預混液Mix 10 μL、正反向引物各0.5 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 7.0 μL，反應程序：95℃ 10 s，95℃5 s，60℃ 25 s，45 個循環。將基因表達水平標準化為肌動蛋白基因，并使用2－△△Ct分析方法進行計算。實驗重復3次，取平均值。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6.5 Western blot 檢測大鼠踝關節滑膜和脾臟組織Notch2、DLL1和NF-κBp65蛋白表達水平變化

提取大鼠踝關節滑膜組織和脾臟組織總蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。取20 μg 蛋白上樣，SDS-PAGE 電泳，半干轉膜法將蛋白轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Notch2（1∶1000）、DLL1（1∶1000）、NF-κBp65（1∶1000）和GAPDH（1∶3000）一抗4℃孵育過夜。加入二抗（1∶3000）室溫孵育1 h，ECL 顯色液顯色并曝光拍照。使用Gelpro32軟件測定目標條帶灰度值。實驗重復3次，取平均值。

1.6.6 免疫組織化學檢測大鼠踝關節滑膜和脾臟組織Notch2、DLL1和NF-κBp65蛋白陽性表達變化

將固定的踝關節修剪、脫鈣、脫水處理，石蠟包埋，切成4 μm 薄片。切片烘干并脫蠟脫水處理后，在高溫高壓下使用枸櫞酸緩沖液抗原修復3 min。室溫下山羊血清封閉液封閉20 min 后，加入Notch2（1∶100）、DLL1（1∶100）、NF-κBp65（1:200）一抗，濕盒內4℃孵育過夜。滴加二抗，37℃恒溫20 min。滴加DAB顯色液進行顯色。使用蘇木精復染細胞核1 min，脫水透明，使用中性樹膠封片。使用顯微鏡觀察并拍照。Image J 軟件統計免疫組化陽性區域比例。實驗重復3次，取平均值。

1.6.7 大鼠肝腎功能水平變化檢測

按照試劑盒說明書，檢測各組大鼠血清肝功能ALT、AST水平變化情況及腎功能BUN、Cr水平變化情況。實驗重復3次，取平均值。

1.7 統計方法

使用SPSS 26.0 軟件進行統計分析。所有數據以均值±標準差（±s）表示，如果符合正態分布，采用雙因素方差分析統計關節炎指數評分，其他實驗數據采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD 法進行多重比較，方差不齊時則采用Tamhance’s T2 法進行多重比較。如果不符合正態分布，則采用非參數檢驗。以P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠關節炎指數評分變化

大鼠關節炎指數評分結果顯示（表2），第14天，模型組和傅山風濕外治方大鼠關節炎指數評分顯著高于正常組，評分均大于4 分，表明CIA 大鼠模型構建成功。第14-42 天，傅山風濕外治方組大鼠關節炎指數評分與模型組相比無顯著差異（P>0.05）。第49-56天，傅山風濕外治方組大鼠關節炎指數評分顯著低于模型組（P<0.05，P<0.01）。

表2 各組大鼠關節炎指數評分變化（±s，n=10）

表2 各組大鼠關節炎指數評分變化（±s，n=10）

注：與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

組別正常組模型組傅山風濕外治方組第14天0.00±0.00 5.50±2.66##8.17±1.47第21天0.00±0.00 6.50±2.88##6.83±2.14第28天0.00±0.00 7.33±3.20##6.67±2.94第35天0.00±0.00 8.33±3.72##7.33±2.73第42天0.00±0.00 8.17±2.86##6.33±2.42第49天0.00±0.00 10.17±1.94##6.50±3.83*第56天0.00±0.00 9.67±2.94##5.17±5.17**

2.2 各組大鼠踝關節病理學變化

通過HE 染色對各組大鼠踝關節病理學的評估表明，與正常組相比，模型組大鼠踝關節結構破壞增加，滑膜細胞增生，關節軟骨被侵蝕且炎性細胞浸潤。與模型組相比，傅山風濕外治方組大鼠異常明顯減輕（圖1）。病理學評分結果表明（表3），與正常組相比，模型組大鼠踝關節病理學評分顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，傅山風濕外治方大鼠大鼠踝關節病理學評分顯著降低（P<0.01）。

表3 各組大鼠踝關節病理學評分及血清TNF-α、IL-6、IL-17和IFN-γ表達水平變化（±s，n=10，pg·mL-1）

表3 各組大鼠踝關節病理學評分及血清TNF-α、IL-6、IL-17和IFN-γ表達水平變化（±s，n=10，pg·mL-1）

注：與正常組相比， ##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。

組別正常組模型組傅山風濕外治方組滑膜病理學評分0.00±0.00 2.80±0.52##1.35±0.28**TNF-α 1.61±0.11 6.18±0.25##2.68±0.14**IL-6 1.15±0.05 81.40±4.54##18.82±0.74**IL-17 2.50±0.13 8.82±0.60##5.14±0.15**IFN-γ 1.41±0.11 10.64±0.36##3.38±0.12**

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17和IFN-γ 表達水平變化

ELISA 檢測結果顯示（表3），與正常組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 表達水平顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，傅山風濕外治方組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 表達水平顯著降低（P<0.01）。

2.4 各組大鼠踝關節滑膜和脾臟Notch2、DLL1 和NF-κBp65 mRNA表達水平變化

qRT-PCR 結果顯示（表4），與正常相比，模型組大鼠踝關節滑膜和脾臟組織中Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA的表達顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，傅山風濕外治方組大鼠踝關節滑膜和脾臟組織中Notch2、DLL1和NF-κBp65mRNA的表達顯著降低（P<0.01）。

表4 各組大鼠踝關節滑膜和脾臟Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA表達水平（±s，n=10）

表4 各組大鼠踝關節滑膜和脾臟Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA表達水平（±s，n=10）

注：與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。

組別正常組模型組傅山風濕外治方組關節脾臟NF-κBp65 1.00±0.00 4.26±0.03##0.84±0.06**Notch2 1.00±0.00 4.17±0.06##1.51±0.19**DLL1 1.00±0.00 2.35±0.11##1.40±0.07**NF-κBp65 1.00±0.00 3.52±0.37##1.85±0.14**Notch2 1.00±0.00 4.22±0.30##1.02±0.08**DLL1 1.00±0.00 2.43±0.04##0.87±0.04**

2.5 各大鼠踝關節滑膜和脾臟Notch2、DLL1 和NFκBp65蛋白表達水平變化

Western blot 檢測結果顯示（圖2 和表5），與正常組相比，模型組大鼠踝關節滑膜和脾臟組織中Notch2、DLL1 和NF-κBp65 蛋白的表達顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，傅山風濕外治方組大鼠踝滑膜關節和脾臟組織中Notch2、DLL1 和NF-κBp65 表達顯著降低（P<0.01）。

圖2 各大鼠踝關節滑膜和脾臟Notch2、DLL1和NF-κBp65蛋白表達水平

表5 各組大鼠踝關節滑膜和脾臟Notch2、DLL1和NF-κBp65 蛋白表達水平（±s，n=10）

表5 各組大鼠踝關節滑膜和脾臟Notch2、DLL1和NF-κBp65 蛋白表達水平（±s，n=10）

注：與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。

組別正常組模型組傅山風濕外治方組關節脾臟NF-κBp65 0.77±0.24 1.21±0.18##0.16±0.05**Notch2 0.58±0.30 2.31±0.59##0.80±0.06**DLL1 0.98±0.21 3.87±0.27##2.00±0.06**NF-κBp65 0.83±0.22 1.26±0.28##0.24±0.09**Notch2 0.82±0.19 2.74±0.06##1.20±0.06**DLL1 0.67±0.61 1.79±0.04##0.28±0.01**

2.6 各組大鼠踝關節Notch2、DLL1和NF-κBp65免疫組織化學分析

免疫組織化學檢測顯示（圖3 和表6），正常組、模型組、傅山風濕外治方組大鼠踝關節成纖維滑膜細胞和巨噬細胞等均有不同程度的Notch2、DLL1 和NFκBp65 陽性表達。與正常組相比，模型組大鼠踝關節Notch2、DLL1 和NF-κBp65 陽性表達增多（P<0.01）。與模型組相比，傅山風濕外治方組大鼠踝關節Notch2、DLL1和NF-κBp65陽性表達減少（P<0.01）。

圖3 各組大鼠踝關節Notch2、DLL1和NF-κBp65 免疫組化代表性圖像（×100）

表6 各組大鼠踝關節Notch2、DLL1和NF-κBp65免疫組化分析（±s，n=10）

表6 各組大鼠踝關節Notch2、DLL1和NF-κBp65免疫組化分析（±s，n=10）

注：與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。

NF-κBp65 3.59±0.49 40.82±2.12 ##28.13±3.20**組別正常組模型組傅山風濕外治方組Notch2 1.39±0.16 31.26±1.91##13.77±1.60**DLL1 3.14±0.66 41.60±2.10 ##19.38±1.10**

2.7 各組大鼠肝腎組織病理學和血清AST、ALT、BUN、Cr水平

肝腎組織病理學結果表明（圖4），模型組和傅山風濕外治方組大鼠的肝腎組織均未見明顯的病理損傷。血清AST、ALT、BUN和Cr水平檢測結果表明（表7），傅山風濕外治方組大鼠血清AST、ALT、BUN和Cr無顯著變化（P>0.05）。

表7 各組大鼠血清AST、ALT、BUN、Cr水平（±s，n=10）

表7 各組大鼠血清AST、ALT、BUN、Cr水平（±s，n=10）

組別正常組模型組傅山風濕外治方組AST（U·L-1）43.74±3.06 42.90±3.56 43.84±3.97 ALT（U·L-1）186.75±18.10 181.81±23.83 187.14±29.25 BUN（mmol·L-1）5.44±0.69 5.60±0.64 5.56±0.72 Cr（mmol·L-1）0.12±0.02 0.11±0.05 0.12±0.05

3 討論

傅山風濕外治方包括牛皮膠、天南星、生姜、羌活、乳香和沒藥等藥味，具有祛風勝濕、散寒止痛、活血消腫等功效。牛皮膠屬于皮膠類藥物，主要偏于外用，主要成分為明膠[11]。明膠作為一種變性膠原蛋白，已被證明是一種有吸引力的藥物載體材料[12]。膠原蛋白經酶水解后被吸收并分布到關節組織，具有鎮痛和抗炎特性[13]。天南星含有類黃酮成分，具有良好的抗炎、鎮痛等藥理作用[14]。生姜及其主要成分酚類化合物具有抗氧化和抗炎活性[15]。羌活被廣泛用于RA 治療，主要含有香豆素和酚酸類化合物，具有鎮痛和抗炎活性[16]。乳香和沒藥作為經典藥對，具有協同抗炎、鎮痛及促進透皮等作用[17]。本研究表明，傅山風濕外治方降低了CIA 大鼠的關節炎指數評分和病理學評分，減少了關節損傷，緩解了CIA大鼠的關節炎嚴重程度，說明傅山風濕外治方各味藥共同發揮了對關節炎的治療作用。

慢性炎癥是RA 的重要病理特征，炎性細胞因子在RA 中的表達水平與RA 患者慢性滑膜炎的嚴重程度呈正相關[18]。TNF-α、IL-6 和IFN-γ 炎性細胞因子滲入滑膜中將促進炎癥反應的產生，導致關節破壞[19]。而IL-17 會刺激RA 滑膜成纖維細胞產生炎性細胞因子，引發RA 的骨侵蝕和組織破壞[20]。因此，抑制炎性細胞因子將有助于改善RA 的炎癥反應和關節破壞。本研究對血清炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 的表達水平進行了檢測，發現傅山風濕外治方降低了炎性細胞因子的表達，表明傅山風濕外治方對RA的治療作用可能與其抗炎作用有關。

RA 的關節損傷往往和破骨細胞活性增強密切相關，Notch2 被認為是RA 破骨細胞活化的重要效應分子，Notch2/DLL1 軸對破骨細胞生成的調節可能是改善RA患者骨侵蝕的重要靶點[21]。同時，炎性細胞因子促進了Notch2 的表達和信號轉導，這種炎性細胞因子介導的Notch2激活依賴于NF-κBp65與啟動子之間的直接相互作用[22]。在炎癥環境中，Notch2 與NF-κB 和炎性細胞因子形成正反饋，增強破骨細胞活性、促進骨侵蝕、導致骨破壞[23]。因此，本研究重點從Notch2信號通路對傅山風濕外治方的治療機制進行了探討。本研究中，CIA 大鼠Notch2/DLL1 軸異常激活，NFκBp65 表達升高，而傅山風濕外治方治療降低了Notch2、DLL1和NF-κBp65在mRNA 和蛋白水平的表達，表明傅山風濕外治方可能通過抑制Notch2/DLL1軸在RA 中的激活，阻斷Notch2 與NF-κB 和炎性細胞因子的正反饋，發揮了對關節炎的治療作用。此外，傅山風濕外治方的安全性缺乏客觀證據，因此本研究主要通過檢測對肝腎功能的影響進一步探討了其安全性，結果表明對肝腎無毒副作用。

綜上，傅山風濕外治方可緩解CIA 大鼠的關節炎癥狀，減輕關節損傷，且對肝腎無毒副作用，其機制可能與降低炎性細胞因子，下調Notch2、DLL1 和NFκBp65的表達有關。但由于目前尚無公認的用于類風濕關節炎治療的外用藥物，本研究未設置陽性對照組。此外，本研究未能完全闡明傅山風濕外治方對炎性細胞因子的調節是否與Notch2/DLL2 軸以及NFκBp65 的協同作用有關，其相互作用和具體機制有待進一步探討。本研究為傅山風濕外治方治療RA 提供了研究基礎和思路，也為RA 外用藥物的發掘提供了參考，然而傅山風濕外治方作為一種治療RA 的外用藥物在臨床的應用和推廣仍然需要更深入的基礎和臨床研究。