橄欖苦苷通過激活AMPK信號通路緩解小鼠妊娠糖尿病＊

陳俊芳，王 霞，姚 霞，李 靜，陳愛香

（1. 長治醫學院附屬和濟醫院 長治 046000；2. 長治醫學院 長治 046000）

妊娠期糖尿病（GDM）表現為妊娠期不同程度的高血糖，GDM的發病率很高，是迄今為止導致新生兒和孕產婦死亡的主要原因之一[1]。GDM 的病因尚未完全闡明，以往的研究表明，胎盤分泌的激素如胎盤催乳素（HPL）、雌激素和黃體酮等對胰島素的拮抗作用是導致GDM發病的主要原因[2]。在治療糖尿病時，胰島素主要用于降低血糖，但胰島素的劑量因人而異，除了胰島素抵抗外，還影響了其在減少母嬰并發癥方面的效果[3]。因此，尋找新的具有降低血糖和對抗胰島素抵抗能力的藥物，是臨床上治療GDM亟需解決的問題。

橄欖苦苷（Oleuropein，Ole）是一種類環烯醚萜，是橄欖葉、種子、果肉和未成熟橄欖果皮中最主要的酚類成分，因其抗炎、抗氧化、抗腫瘤以及心臟和神經保護作用而被廣泛應用于臨床[4-5]。胎盤炎癥和氧化應激與GDM的發生發展密切相關，兩者在塑造胎兒環境中起著至關重要的作用[6]。在正常妊娠中炎癥受到高度調節，這對于維持良好的胎兒發育環境至關重要。研究表明GDM 與胎盤營養轉運蛋白的表達和活性失調有關，這可能源于胎盤、母親和胎兒的炎癥狀態改變。先前的研究已經證明橄欖苦苷在不同的糖尿病動物模型中的功效，例如四氧嘧啶[7]誘導的和肥胖[8]誘導的糖尿病大鼠模型，使橄欖苦苷成為GDM臨床治療的潛在藥物。

腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）是能量代謝的關鍵酶，可調節脂肪組織、肝臟和骨骼肌中葡萄糖和脂質的攝取、儲存和利用[9]。已經發現抑制AMPK 信號傳導與胰島素抵抗、炎癥和氧化應激相關[10-11]。AMPK還參與調節過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）和CCAAT/增強子結合蛋白α（C/EBPα），它們是脂肪生成的中心調節劑[12]。因此，激活AMPK的藥物可能會逆轉肥胖相關代謝疾病的影響，例如2型糖尿病和胰島素抵抗[13]。先前的研究還指出AMPK 抑制和葡萄糖攝取減少之間的聯系，這是導致高血糖的一個重要因素[14]。因此，AMPK激活劑已成為研發糖尿病和肥胖癥等代謝疾病治療劑的重點。鑒于AMPK在GDM中的重要作用以及橄欖苦苷在激活AMPK信號傳導中的潛力，有必要對橄欖苦苷緩解GDM的作用進行全面評估。

在本研究中，旨在研究橄欖苦苷在GDM小鼠模型中的治療作用。在有或沒有橄欖苦苷治療的GDM 小鼠中比較了GDM癥狀，包括增加的血糖水平、體質量、血漿胰島素水平和肝糖原含量。通過測量肝臟氧化應激標志物來檢測氧化應激水平，通過檢測血清和骨骼肌中IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 的水平來評估炎癥水平。還研究了AMPK 信號通路與橄欖苦苷治療之間的聯系，以探索橄欖苦苷緩解GDM 癥狀的機制。該研究的結果可以深入了解橄欖苦苷緩解GDM癥狀的功效，并為其臨床轉化鋪平道路。

1 材料和方法

1.1 動物實驗

6-8 周齡的C57BL/KsJ Lepdb/+(db/+)和C57BL/KsJ+/+(WT)小鼠購自Jackson Laboratories。喂食高脂肪飲食（17%脂肪、47%碳水化合物和29%蛋白質，Harlan Teklad）。將小鼠安置在溫度為22±2℃的無菌環境中，保持12 h 光照和12 h 黑暗循環，自由獲取食物和水。10-12 周齡的雌性小鼠在單獨的籠子中交配，交配后的第2 天表示為妊娠天（GD0）。妊娠小鼠隨機分組如下：正常妊娠對照組（WT小鼠），GDM組C57BL/KsJ Lepdb/+(db/+)，GDM+橄欖苦苷組（10 mg·kg-1·d-1，腹腔注射），正常妊娠對照組和GDM 組腹腔注射等量生理鹽水。在GD15 進行腹腔葡萄糖耐量實驗（GTT）和腹腔胰島素耐量實驗（ITT）測定，并檢測炎癥因子水平和血清葡萄糖含量。

1.2 腹腔內葡萄糖和胰島素耐量試驗

GTT 和ITT 在GD15 進行。對于GTT，在禁食6 h后以2.0 g·kg-1的劑量腹腔注射葡萄糖，使用ACCUCHEK 血糖儀（Roche Diagnostics，Switzerland）測量基線和葡萄糖注射后（注射后30、60、90 和120 min）的血糖水平。對于ITT，在禁食6 h 后以0.75 U·kg-1的劑量腹腔注射胰島素，并在基線和胰島素注射后（注射后30、60、90和120 min）測量血糖水平。

1.3 肝糖原含量的測量

根據制造商（BioVision，San Francisco，LA）的方案使用商業試劑盒處理肝組織，將肝裂解物與分析試劑混合后，使用酶標儀（Spectra Max 384，USA）測量肝糖原在340 nm波長處的吸光度。

1.4 血清葡萄糖和胰島素測量

分別于GD0、9、18 使用血糖儀測量葡萄糖水平，并用超靈敏小鼠胰島素ELISA 試劑盒（ALP CO Diagnostics，Salem，NH）分析血漿胰島素水平。

1.5 酶聯免疫吸附試驗

在GD18，根據制造商的方案，使用ELISA 試劑盒測量小鼠血清IL-1β（MLB00C，R&D Systems）、IL-6（SM6000B，R&D Systems）、TNF-α（SMTA00B，R&D Systems）和MCP-1（MJE00B，R&D Systems）的水平。

1.6 實時定量聚合酶鏈反應

使用TRIzol 試劑（Thermo Fisher）提取細胞總RNA，根據制造商的方案，使用cDNA 逆轉錄試劑盒（TaKaRa Bio，China）將總RNA 逆轉錄為cDNA。按照RT-PCR試劑盒說明書（TaKaRa Bio，China）進行操作，以GAPDH 做為內參，每個樣品設置3個復孔。引物如下：IL-6 正向5’-TGTGCTTTCTGGAGGGTCTACT-3’，反向5’-TGCCTCATCACCAACCATA AG-3’；IL-1β 正向5’-AGTAGCAGCGGTGGAAGT-3’，反向5’-CTTCC TGTATGTGCACTGGCGGTCCT-3’；TNF-α正向5’-GT CAGAAGACAAGATCACCGGA-3’，反向5’-AGGTGC ATTGATCACACCGA-3’；MCP-1正向5’-GGGTATTA GGGTTGGAATTTAATGT-3’，反向5’-CTTCCTTCTAA TTATTTCCATTTCTCTCA-3’；GAPDH正向5’-CTGG GCTACACTGAGCACC-3’，反向5’-AAGTGGTCGTTG AGGGCAATG-3’。qPCR 的反應條件設置為：95℃預變性5 min，然后進行39 個循環的95℃下變性30 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸60 s。采用相對表達量2-ΔΔCt的方法處理數據。

1.7 蛋白質印跡實驗

從肝組織中提取蛋白質樣品，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測（碧云天，上海）蛋白質濃度。進行SDSPAGE電泳，將分離的蛋白質轉移至PVDF膜，使用5%的脫脂奶粉封閉1 h。TBST洗膜3次，加入相應的一抗：AMPK（ab32047，1∶1000，Abcam），p-AMPK（ab92701，1∶1000，Abcam），HDAC4（ab235583，1∶1000，Abcam），p-HDAC4（ab39408，1∶1000，Abcam），G6Pase（ab93857，1∶1000，Abcam），β-actin（ab8226，1∶1000，Abcam），在4℃孵育過夜。TBST 洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，孵育1 h。ECL 底物化學發光顯色后用Image J軟件進行條帶分析。實驗重復3次。

1.8 統計學分析

結果以均數±標準差（±s）表示，采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，兩組之間的比較通過t檢驗進行分析，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），然后進行Tukey 事后檢驗，P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 橄欖苦苷可以改善GDM小鼠的糖尿病癥狀

首先，評估橄欖苦苷對整個妊娠期GDM小鼠體質量和血糖水平的影響。如圖1A 所示，3 組小鼠在懷孕期間體質量均有所增加。GD18，橄欖苦苷治療的GDM 小鼠的體質量明顯低于GDM 組小鼠，表明橄欖苦苷治療阻止了GDM 小鼠體質量的增加。相應地，GDM 小鼠從GD0 到GD18 的體質量增加顯著高于正常組小鼠（圖1B）。正常妊娠小鼠的血清葡萄糖水平在GD0、9 和18 保持穩定。與正常組小鼠相比，GDM小鼠在GD0、9和18的血糖水平顯著升高，橄欖苦苷治療顯著降低了GDM 小鼠GD9、18的血糖水平（圖1C）。數據表明橄欖苦苷改善了GDM小鼠的糖尿病癥狀。

圖1 橄欖苦苷對GDM小鼠的糖尿病癥狀的影響（n=5）

2.2 橄欖苦苷可以改善GDM 小鼠的葡萄糖和胰島素耐受性

檢測橄欖苦苷對GDM 小鼠葡萄糖和胰島素耐受性的影響。在葡萄糖注射前，與正常組小鼠相比，GDM 小鼠的血糖水平顯著升高，橄欖苦苷治療組小鼠血糖水平較GDM 組顯著下降。注射葡萄糖后，3 小鼠血糖均升高。在葡萄糖注射后的所有4 時間點（30、60、90 和120 min），GDM 組小鼠的血糖水平均顯著高于正常組小鼠，并且橄欖苦苷顯著降低了GDM小鼠的血糖水平（圖2A）。相應地，GDM 小鼠的葡萄糖曲線下面積（AUC）明顯大于正常組小鼠，橄欖苦苷治療組小鼠的AUC 顯著小于GDM 組小鼠。因此，數據表明橄欖苦苷改善了GDM 小鼠的葡萄糖耐量。如圖2B所示，注射胰島素導致所有小鼠的血糖水平降低。GDM組小鼠在注射胰島素后30、60、90和120 min的血糖水平顯著高于正常組小鼠，橄欖苦苷治療在所有4時間點都顯著降低了GDM小鼠的血糖水平。相應地，橄欖苦苷治療組小鼠的AUC 顯著低于GDM 小鼠。表明橄欖苦苷改善了GDM小鼠的葡萄糖和胰島素耐受性。

圖2 橄欖苦苷對GDM小鼠的葡萄糖和胰島素耐受性的影響（n=5）

2.3 橄欖苦苷抑制GDM小鼠的炎癥

為評估橄欖苦苷對GDM小鼠炎癥的影響，首先監測了血清中炎癥細胞因子的水平。與正常組小鼠相比，GDM 小鼠的血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 和MCP-1水平都顯著升高。與GDM組小鼠相比，橄欖苦苷治療組小鼠血清中這些炎癥因子的水平顯著降低（圖3A-3D）。在骨骼肌中也得到了相同的結果（圖3E）。表明橄欖苦苷可以抑制GDM小鼠的炎癥。

圖3 橄欖苦苷對GDM小鼠炎癥的影響（n=5）

2.4 橄欖苦苷促進肝臟中AMPK活化

為了研究橄欖苦苷治療GDM 的潛在機制，在GD18 時取小鼠肝臟組織，通過Western blot 檢測橄欖苦苷對AMPK 信號通路的影響。結果發現與正常組小鼠相比，GDM 組小鼠的AMPK 活化受到抑制，而橄欖苦苷顯著恢復了p-AMPK 的表達。組蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）和葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）是糖代謝中的關鍵酶，發現在GDM 小鼠中，HDAC4 激活和G6Pase 表達水平上調，而橄欖苦苷治療可以逆轉AMPK 相關蛋白的激活模式，降低G6Pase 的表達，見圖4。表明橄欖苦苷對GDM 小鼠的治療作用可能是通過激活AMPK信號通路介導的。

圖4 橄欖苦苷對AMPK信號通路的影響（n=5）

2.5 橄欖苦苷改善GD小鼠的生殖結果

為了解橄欖苦苷對妊娠結局的影響，檢查了各組小鼠的產仔數和出生體質量。結果發現橄欖苦苷顯著恢復了GDM 組小鼠增加的出生體質量（圖5A）和減少的產仔數（圖5B），表明橄欖苦苷的抗炎和抗氧化作用轉化為GDM小鼠妊娠結局的改善。

3 討論

GDM 是妊娠期間由胰島素抵抗和胰腺β 細胞功能障礙引起的一種暫時性葡萄糖不耐受形式，是最常見的妊娠并發癥之一，與孕產婦和新生兒結局風險的顯著增加有關，GDM 女性的后代更有可能患上糖尿病和代謝綜合征[15]。目前治療GDM 的方案十分有限，胰島素是主要的治療方法，但會導致低血糖的發生，并且和不良的胎盤、胎兒和母體結局相關[16]。雖然二甲雙胍能有效治療GDM，但它可以穿過胎盤，對胎兒的長期影響未知[17]。因此，迫切需要尋找能有效治療GDM且副作用小的藥物。

橄欖苦苷是橄欖果實、葉子、樹枝和油中最活躍的酚類化合物之一，具有多種生物學功能。由于橄欖苦苷在臨床前和臨床研究中對葡萄糖穩態的有益作用，越來越多的研究集中在橄欖苦苷的抗糖尿病功能上[18]。在本研究中，使用GDM 小鼠模型評估橄欖苦苷對GDM癥狀（母體體質量和血糖）、葡萄糖和胰島素耐量的治療作用。結果證明橄欖苦苷通過顯著降低體質量和血糖水平來緩解GDM小鼠的癥狀，并且改善了葡萄糖和胰島素耐受性。此外，橄欖苦苷還通過降低出生體質量和增加產仔數來改善GDM 小鼠的生殖結局。這些結果展現出了橄欖苦苷對GDM的保護作用，表明橄欖苦苷可能作為治療GDM的潛在藥物。

炎癥和氧化應激與母體胰島素抵抗的增加有關，是導致GDM 發病的兩個主要因素[19]，研究發現橄欖苦苷能夠恢復升高的炎癥反應和氧化應激水平。懷孕期間炎癥反應和氧化應激的失調可能是孕婦激素水平和能量代謝改變的結果[20]，增加的激素產生可以促進脂肪分解，進而導致炎癥因子分泌、脂質代謝和葡萄糖代謝異常以及胰島素抵抗，并且失調的蛋白質和脂質氧化也可能導致過度的氧化應激，從而進一步破壞胎兒發育環境[21]。TNF-α是炎癥反應中最早的細胞因子之一，被認為是胰島素抵抗的預測因子[22]。此外，TNF-α作為起始因子并激活IL-6的分泌，IL-6是炎癥反應中重要的促炎因子，GDM 患者處于慢性炎癥狀態，血清中IL-6和TNF-α等炎癥因子水平顯著高于正常妊娠[23]。在目前的研究中，證實GDM 小鼠的IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平顯著升高，橄欖苦苷治療后，GDM 小鼠肝臟中的氧化應激水平，以及血清和骨骼肌中的炎癥水平都顯著降低。許多研究描述了TNF-α 在胰島素抵抗的病理生理學中的直接作用[24]。與先前的研究結果一致，證明骨骼肌中TNF-α 的產生增加導致GDM小鼠的胰島素敏感性降低，而橄欖苦苷抑制TNF-α 的產生并改善GDM 小鼠的胰島素敏感性。總之，這些數據證實了橄欖苦苷的抗氧化和抗炎效力，以及在GDM小鼠中的治療作用。

AMPK 是調節葡萄糖代謝的關鍵代謝酶，運動和離體收縮可以激活AMPK 并刺激骨骼肌吸收葡萄糖，已有多項研究表明激活AMPK 通路可以增加胰島素敏感性，從而改善糖尿病癥狀[25-26]。為了探索橄欖苦苷治療GDM 的分子機制，重點研究了AMPK 信號通路。研究結果表明GDM 小鼠的AMPK 活化受損，這可能導致GDM 小鼠胰島素抵抗。橄欖苦苷治療增加了AMPK 活化，進而導致葡萄糖攝取增加和胰島素抵抗降低，這也與前人的研究結果相符合[27]。以前的研究建立了兩種橄欖苦苷降血糖的可能作用機制：①改善葡萄糖誘導的胰島素釋放；②增強外周葡萄糖攝取[28]。已經觀察到橄欖苦苷可以加速細胞對葡萄糖的攝取，從而導致血漿葡萄糖降低。AMPK信號傳導與葡萄糖的攝取相關[14]，這也解釋了橄欖苦苷增強細胞對葡萄糖攝取的原因。AMPK 信號抑制也與胰島素抵抗、炎癥和氧化應激有關。研究結果表明橄欖苦苷可以通過激活AMPK 信號通路改善GDM 小鼠癥狀，降低血糖和炎癥水平，并且改善小鼠妊娠結局，正如GDM 小鼠產仔數增加和出生體質量降低所示。此外，還需要在細胞水平上研究橄欖苦苷對胰島的影響，以更深入地了解橄欖苦苷治療GDM的機制。

總之，本研究報告了使用植物提取物橄欖苦苷治療GDM，結果表明橄欖苦苷可以緩解GDM 小鼠癥狀，恢復血清葡萄糖水平和胰島素敏感性，還能降低炎癥反應和氧化應激，改善妊娠結局，還證明橄欖苦苷可能通過激活AMPK信號通路發揮其治療作用。