大麻二酚灌胃對博來霉素誘導的小鼠肺纖維化改善作用及其機制

張飛宇，孫夢迪，楊慧聰，盧芳，于棟華，劉樹民

1 黑龍江中醫藥大學研究生院，哈爾濱 150040；2 黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院

肺纖維化（pulmonary fibrosis， PF）是一種由反復炎癥反應引起的以成纖維細胞增生、大量細胞外基質（Extracellular matrix， ECM）沉積、肺組織結構破壞為特征的間質性肺疾?。?］，表現為肺順應性下降、氣體交換障礙、呼吸困難、活動耐量下降，嚴重時可引起呼吸衰竭甚至死亡。細胞焦亡又稱細胞炎性壞死，是近年來發現的一種新的程序性細胞死亡方式，表現為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致細胞內容物大量釋放進而激活強烈的炎癥反應。研究［2］顯示，細胞焦亡能誘發肺部炎癥反應和肺纖維化的進展。肺纖維化可發生于任何年齡段，多見于45～70 歲中老年人，給個人、家庭和社會帶來了沉重的負擔［3］。近年來上市的吡非尼酮［4］和尼達尼布［5］，不良反應較多［6］且價格昂貴，迫切需要尋找預防和治療肺纖維化的有效藥物。大麻二酚（Cannabidiol，CBD）是提取自植物漢麻葉和花的一種非精神活性成分［7］，分子式為C21H30O2，具有保護神經［8］、抗焦慮［9］、抗炎［10］、抗氧化［11］、抗腫瘤［12］、改善失眠［13］、提高皮膚自我修復力［14］等多方面的作用。全球多個國家已經把CBD 批準為藥用或食品添加劑，我國云南、黑龍江已對漢麻的種植和銷售合法化［15］。2018年7月，美國食品和藥物管理局批準了第一種含有CBD 的處方藥Epidiolex，用于兒童難治性癲癇的治療［16］。近年來研究發現CBD 具有抗器官纖維化的作用，2022年3—7月，我們觀察了大麻二酚灌胃對博來霉素誘導的小鼠肺纖維化改善作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 CBD、小鼠、試劑與儀器 CBD 購自西安綠如泉生物科技有限公司。SPF 級Balb/c 小鼠60 只，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，體質量18～20 g，8 周齡，許可證號：SCXK（遼）2020-0001。實驗動物飼養于黑龍江中醫藥大學中藥研究院動物室，自由進食飲水，溫度22℃～26℃，相對濕度在55%～65%之間，晝夜循環，保持12 h光照。本實驗經過黑龍江中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，編號2022032901。博來霉素購自索萊寶生物科技有限公司，醋酸潑尼松片購自浙江仙琚制藥股份有限公司。羥脯氨酸（Hydroxyproline， HYP）試劑盒、涎液化糖鏈抗原-6（Krebs Von den Lungen-6， KL-6）試劑盒、基質金屬蛋白酶-7（Matrix metalloproteinase-7，MMP-7）試劑盒、IL-1β 試劑盒、IL-18 試劑盒均購自上海研抗生物科技有限公司。Tecan 酶標儀購自瑞士Tecan 公司；高速冷凍離心機購自安徽科大創新股份有限公司中佳分公司；Haier-80℃冰箱購自Haier 公司；Nikon Eclipse Ci-L 型正置白光拍照顯微購自日本Nikon 公司；超聲振蕩器購自昆山市超聲儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱購自杭州艾普儀器設備有限公司；病理組織漂烘儀購自常州中威電子儀器廠；萊卡轉輪式切片機購自德國萊卡公司；包埋機購自常州中威電子儀器廠；全自動封閉式組織脫水機購自常州中威電子儀器廠；Myi QTM Optics Module 單色Real-time PCR 檢測系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2 肺纖維化小鼠模型制備、分組、CBD 給予方法 實驗第1 天，60 只Balb/c 小鼠，適應性飼養7 天后，用隨機數字表法隨機分為對照組、模型組、潑尼松組、CBD 低劑量組、CBD 中劑量組、CBD 高劑量組，每組10 只。模型組、潑尼松組、CBD 低劑量組、CBD 中劑量組、CBD 高劑量組小鼠腹腔注射博來霉素（2 mg/mL）35 mg/kg，每周2 次，連續4 周，制作肺纖維化小鼠模型；對照組腹腔注射等體積生理鹽水，每周2次，連續4周。將醋酸潑尼松片用生理鹽水溶解成混懸液備用（1 mg/mL），CBD 用玉米油溶解備用（1 mg/mL、3 mg/mL、9 mg/mL）。實驗第29天，潑尼松組、CBD 低劑量組、CBD 中劑量組、CBD 高劑量組分別以潑尼松（12 mg/kg）、CBD（12 mg/kg、36 mg/kg、108 mg/kg）進行灌胃，每天1 次，連續28天。模型組、對照組灌入同體積生理鹽水。

1.3 各組小鼠肺組織病理學觀察 實驗第56 天，麻醉處死小鼠后取肺組織，左肺組織用4%多聚甲醛浸泡24 h以上，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理后以石蠟包埋。將石蠟切片切成4 μm厚的切片，脫蠟后置于梯度乙醇中浸泡處理，用蘇木精伊紅（HE）試劑盒、馬松（Masson）試劑盒染色后，生理鹽水漂洗1次，再次經脫水、透明后封片，顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.4 各組小鼠肺泡炎、肺纖維化嚴重程度評分 ①根據SZAPIEL 等的方法對各組小鼠肺泡炎嚴重程度進行評分。0 分：無肺泡炎，肺組織正常；1 分：輕度肺泡炎，單核細胞浸潤、肺泡間隔增厚，病變局限于胸膜下，病變范圍＜20%；2 分：中度肺泡炎，炎癥病變主要位于胸膜下，病變范圍為20%～50%；3 分：重度肺泡炎，炎癥病變彌漫，病變范圍＞50%。②根據HUBNER 等的方法對各組小鼠肺纖維化嚴重程度進行評分。0 分：肺泡結構正常、無膠原沉積；1 分：散在少量膠原沉積灶，肺泡間隔厚度≤3 倍正常值，部分肺泡腔擴大，肺泡壁變薄，但無成團肺纖維化；2 分：肺泡間隔厚度＞3 倍正常值，明顯的膠原沉積，并伴有繩結樣改變，但病變未融合，部分肺泡腔擴大，肺泡壁變薄，但無成團肺纖維化；3 分：連續肺纖維化，肺泡間隔厚度＞3 倍正常值，部分肺泡腔擴大，肺泡壁變??；4 分：單個成團膠原沉積灶，病灶范圍＜10%視野；5 分：融合成團肺纖維化灶，病灶范圍10%～50%視野，肺形態結構嚴重受損但還能依稀可見；6 分：大片融合成團肺纖維化灶，病灶范圍＞50%視野，大部分肺泡間隔消失，大部分肺結構毀損；7 分：肺泡內幾乎充滿成片的纖維組織，肺泡間隔消失，但仍可見至少5個氣泡樣改變；8 分：滿視野成團的纖維組織。

1.5 各組小鼠肺組織HYP 及肺纖維化診斷生物標志物檢測 ①稱取200 mg 的Balb/c 小鼠肺組織，加入2 mL 的組織提取液，置于110 ℃電熱鼓風干燥箱，水解6～12 h，用提取液定容至2 mL，4 ℃條件下12000 g 離心20 min，取上清，根據試劑盒說明書檢測HYP。②末次給藥后3 h，麻醉小鼠，經腹部心臟采血，室溫下自然放置30 min 凝固，4 ℃條件下3000 r/min 離心20 min，仔細吸取上清，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書操作檢測肺纖維化診斷生物標志物KL-6、MMP-7。

1.6 各組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 及血清IL-1β、IL-18檢測 ①小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 檢測采用Real-time PCR 法。取肺組織，按照試劑盒說明書TRIzol 法提取總RNA 后，逆轉錄成cDNA，采用Real-time PCR試劑盒進行擴增，以GAPDH 為內參基因，每個目的基因的待測樣本設3個復孔。擴增反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火31 s，40 個循環，95 ℃擴增15 s。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。②小鼠血清IL-1β、IL-18 檢測采用ELISA 法，檢測步驟參照“1.5”。

1.7 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。計量資料呈正態分布時以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織病理形態比較 HE染色結果顯示，對照組小鼠肺組織及肺泡結構完整、清晰，肺泡壁與肺泡間隔形態完整，無滲出物，未變厚，無炎性細胞浸潤和充血水腫；模型組小鼠肺組織病理變化主要為肺泡炎，肺泡壁和肺間質大量單核細胞、中性粒細胞、漿細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤，嚴重的有膿腫灶出現，肺泡間隔變厚，血管炎病變和局灶肺水腫，少量肺泡腔內巨噬細胞滲出等；潑尼松組、CBD 低劑量組、CBD 中劑量組、CBD 高劑量組肺泡結構基本正常，炎性細胞浸潤情況不同程度減輕。Masson 染色結果顯示，對照組小鼠肺泡結構完整，肺泡壁及血管壁膠原纖維排列規整；模型組肺泡結構不完整，肺泡壁增厚，其中膠原纖維明顯增多，結構排列紊亂，肺泡毛細血管擴張，部分肺泡腔內有滲出；潑尼松組、CBD 低劑量組、CBD 中劑量組、CBD高劑量組肺泡結構基本正常，肺泡壁增厚、肺泡腔內滲出、膠原纖維含量及排列情況呈不同程度減輕。

2.2 各組小鼠肺泡炎、肺纖維化嚴重程度評分比較 ①對照組鼠肺泡炎、肺纖維化嚴重程度評分為（0.73± 0.49）分、（0.94± 0.66）分，模型組小鼠肺泡炎、肺纖維化嚴重程度評分為（2.32± 0.58）分、（2.92± 1.02）分，兩組相比，P均＜0.05。②各組小鼠肺泡炎、肺纖維化嚴重程度評分見表1。由表1可知，與模型組相比，CBD 低劑量組、CBD 中劑量組、CBD 高劑量組、潑尼松組小鼠肺泡炎、肺纖維化嚴重程度評分均降低（P均＜0.05），且CBD各劑量組之間有劑量依賴性（P均＜0.05），CBD 高劑量組與潑尼松組之間差異無統計學意義（P均＞0.05）。

表1 各組小鼠肺泡炎、肺纖維化嚴重程度評分比較（分，-x± s）

2.3 各組小鼠肺組織HYP 及血清KL-6、MMP-7 水平比較 ①對照組小鼠肺組織HYP 及血清KL-6、MMP-7 水平分別為（11.82± 2.21）μg/mg、（287.19± 121.36）pg/mL、（19.21± 2.07）pg/mL，模型組小鼠肺組織HYP及血清KL-6、MMP-7水平分別為（27.17± 1.50）μg/mg、（354.43± 185.19）pg/mL、（38.84± 2.04）pg/mL，兩組相比，P均＜0.05。②各組小鼠肺組織HYP 及血清KL-6、MMP-7水平比較見表2。由表2 可知，與模型組相比，CBD低劑量組、CBD 中劑量組、CBD 高劑量組、潑尼松組小鼠肺組織HYP 及血清KL-6、MMP-7 水平均降低（P均＜0.05），且CBD 各劑量組之間有劑量依賴性（P均＜0.05），CBD 高劑量組與潑尼松組之間差異無統計學意義（P均＞0.05）。

表2 各組小鼠肺組織HYP、血清KL-6、MMP-7水平比較（±s）

表2 各組小鼠肺組織HYP、血清KL-6、MMP-7水平比較（±s）

注：與模型組相比，*P＜0.05；與CBD 低劑量組相比，#P＜0.05；與CBD中劑量組相比，△P＜0.05。

MMP-7（pg/mL）38.84± 2.0434.52± 2.69*31.48± 1.61*#26.97± 1.95*#△25.79± 1.71*#△組別模型組CBD低劑量組CBD中劑量組CBD高劑量組潑尼松組HYP（μg/mg）27.17± 1.5024.48± 1.95*22.46± 1.24*#20.73± 1.69*#△20.36± 2.35*#△KL-6（pg/mL）354.43± 185.19346.78± 179.82*313.29± 133.21*#294.24± 125.28*#△306.67± 149.83*#△

2.4 各組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對表達量及血清IL-1β、IL-18水平比較檢測

2.4.1 各組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對表達量比較 ①對照組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對表達量分別為0.83± 0.11、0.82± 0.11、0.88± 0.25、0.72±0.14、0.77± 0.13，模型組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對表達量分別為2.10± 0.11、2.16± 0.14、2.42±0.26、2.15± 0.15、2.20± 0.16，兩組相比，P均＜0.05。②各組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA相對表達量比較見表3。由表3可知，與模型組相比，CBD 低劑量組、CBD中劑量組、CBD高劑量組、潑尼松組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對表達量均降低（P均＜0.05），且CBD 各劑量組之間有劑量依賴性（P均＜0.05），CBD 高劑量組與潑尼松組之間差異無統計學意義（P均＞0.05）。

表3 各組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對表達量比較（±s）

表3 各組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對表達量比較（±s）

注：與模型組相比，*P＜0.05；與CBD低劑量組相比，#P＜0.05；與CBD中劑量組相比，△P＜0.05。

組別模型組CBD低劑量組CBD中劑量組CBD高劑量組潑尼松組Gasdermin D mRNA 2.20± 0.161.92± 0.11*1.71± 0.14*#1.49± 0.16*#△1.56± 0.11*#△NF-κB p65 mRNA 2.10± 0.111.79± 0.13*1.63± 0.08*#1.50± 0.11*#△1.48± 0.12*#△NLRP3 mRNA 2.16± 0.141.98± 0.12*1.81± 0.10*#1.45± 0.19*#△1.62± 0.20*#△ASC mRNA 2.42± 0.262.03± 1.51*1.83± 0.09*#1.67± 0.12*#△1.58± 0.16*#△Caspase-1 mRNA 2.15± 0.151.94± 0.07*1.73± 0.17*#1.47± 0.22*#△1.66± 0.14*#△

2.4.2 各組小鼠血清IL-1β、IL-18 水平比較 ①對照組小鼠血清IL-1β、IL-18 水平分別為（11.13±1.79）pg/mL、（19.58± 1.44）pg/mL，模型組小鼠血清IL-1β、IL-18 水平分別為（24.49± 1.78）pg/mL、（28.31± 2.08）pg/mL，兩組相比，P均＜0.05。②各組小鼠血清IL-1β、IL-18 水平比較見表4。由表4 可知，與模型組相比， CBD 低劑量組、CBD 中劑量組、CBD 高劑量組、潑尼松組小鼠血清IL-1β、IL-18水平水平均降低（P均＜0.05），且CBD各劑量組之間有劑量依賴性（P均＜0.05），CBD 高劑量組與潑尼松組之間差異無統計學意義（P均＞0.05）。

表4 各組小鼠血清IL-1β、IL-18水平比較（pg/mL，±s）

表4 各組小鼠血清IL-1β、IL-18水平比較（pg/mL，±s）

注：與模型組相比，*P＜0.05；與CBD 低劑量組相比，#P＜0.05；與CBD中劑量組相比，△P＜0.05。

IL-1828.31± 2.0825.35± 0.88*23.49± 1.58*#20.97± 1.24*#△21.64± 1.35*#△組別模型組CBD低劑量組CBD中劑量組CBD高劑量組潑尼松組IL-1β 24.49± 1.7821.77± 1.56*19.87± 1.38*#15.48± 1.97*#△17.90± 1.87*#△

3 討論

博來霉素是一種化療藥物，因肺組織中酰胺酶活性低，博來霉素代謝較慢，具有明顯的肺毒性，其與鐵離子形成的復合物嵌入DNA 后引起DNA 鏈的斷裂［17］。因博來霉素引起的癥狀、肺功能變化和影像學改變與肺纖維化較為相似，是肺纖維化實驗中最常用的造模藥物。本實驗通過多次腹腔注射博來霉素發現，小鼠肺組織HE 染色、Masson 染色結果相對于對照組出現了明顯的肺泡炎和肺纖維化病變，表明多次腹腔注射博來霉素法可以制作小鼠肺纖維化模型，這與蘇敏紅等［18］研究結果一致。依據SZAPIEL肺泡炎評分法和HUBNER 肺纖維化評分法，評分結果發現相對于模型組，各給藥組肺泡炎程度如肺泡壁和肺間質炎性細胞浸潤、局灶肺水腫、肺泡腔內巨噬細胞滲出等情況和肺纖維化程度如膠原纖維明顯增多、結構排列紊亂、肺泡毛細血管擴張等情況均不同程度緩解，且CBD 的緩解作用呈劑量依賴性。

肺纖維化是由多種致病因素引起的反復創傷愈合反應，造成肺間質成纖維細胞增殖及大量ECM 異常增生，最終導致肺泡空間結構破壞、肺血管重塑、肺硬度的增加［19］。Ⅱ型肺泡上皮細胞具有干細胞特性，在各種刺激因素作用下可通過上皮間充質轉化逐漸轉化為成纖維細胞和肌成纖維細胞，大量分泌膠原蛋白，導致肺間質膠原蛋白含量增多、肺組織收縮、變硬。膠原蛋白是ECM 的主要成分，膠原蛋白含量增加引起ECM 重構是纖維化的最重要表現形式。HYP 是膠原蛋白中特有的一種亞氨基酸，來源固定的膠原蛋白其含量穩定，是衡量膠原蛋白的標尺，HYP 含量的變化可以間接反應組織膠原蛋白的含量［20］，是衡量纖維化程度的重要指標。我們研究發現，模型組小鼠肺組織HYP 含量相對于對照組明顯升高，表明博來霉素引起了肺組織纖維蛋白含量增加，是肺纖維化發生的直接證據。各給藥組肺組織HYP含量均有所下降，且CBD 的緩解作用呈劑量依賴性，這與Masson染色結果相互印證。

KL-6 在退變的Ⅱ型肺泡上皮細胞表達增強，是判斷Ⅱ型肺泡上皮細胞功能的特異性指標。KL-6在肺部基底膜受損，血管通透性增加時可導致KL-6入血，血清中KL-6能敏感地反應肺泡上皮和間質的損傷程度，其含量與損傷程度正相關，已被多國確定為肺纖維化診斷與判斷預后的生物標志物［21］。MMP-7在肺組織損傷階段，可降解基底膜和ECM 成分；在修復階段，引起異常的組織重構，從而引起肺泡結構的重建形成肺纖維化，血清中MMP-7 水平升高與肺纖維化程度正相關。KL-6 和MMP-7 是肺纖維化的獨立預測因子，二者同時升高，可提高肺纖維化診斷的特異性。模型組小鼠血清KL-6 和MMP-7含量對于對照組明顯增加，符合魯未等［22］確診肺纖維化的標準。CBD 低、中、高給藥組血清KL-6 和MMP-7 含量相對于模型組均明顯下降且成劑量依賴性，多角度證明了CBD對肺纖維化的緩解作用。

肺纖維化的發生與炎癥關系密切，炎癥損傷后發生的異常修復最終導致形成局部瘢痕性變化，影響肺換氣功能。因此，抑制炎癥反應是緩解肺纖維化發生的重要途徑。細胞焦亡是機體一種重要的天然免疫反應，在感染性疾病發生發展中發揮重要作用。經典的細胞焦亡途徑也稱為依賴Caspase-1 的細胞焦亡途徑，在刺激因素的作用下NLRP3 蛋白、ASC 蛋白、半胱天冬酶-1 前體（Pro-Caspase-1）蛋白表達量增加，三者組裝成NLRP3 焦亡小體，進一步產生成熟的Caspase-1，Caspase-1 切割Gasdermin D蛋白，生成Gasdermin D 氮端游離的活性域多肽（GSDMD-N）在細胞膜上形成眾多的小孔，使細胞膜完整性受損，導致細胞失去調控物質進出的能力，最終膨脹破裂，釋放出細胞內容物；同時促進白細胞介素-1β 前體（pro-IL-1β）和白細胞介素-18 前體（pro-IL-18）成熟，生成大量IL-1β 和IL-18，擴大炎癥反應。我們通過Real-time PCR 檢測發現模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對表達量相對于對照組均顯著升高，ELISA 檢測模型組小鼠血清中IL-1β、IL-18 含量相對于對照組均顯著升高，提示博來霉素誘導的肺纖維化模型發生了經典細胞焦亡。NF-κB p65 蛋白是NF-κB 信號通路中的重要產物，做為轉錄因子與DNA 相應序列結合后，可上調相應基因的轉錄。實驗結果表明，各給藥組肺組織NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD mRNA 相對表達量和血清中IL-1β、IL-18含量均不同程度降低，CBD 高劑量組的降低作用較低劑量更明顯，呈劑量依賴性，其原因可能是通過NF-κB信號通路抑制了細胞焦亡發生的強度，但具體是通過NF-κB信號通路的哪個環節發揮作用還有待進一步研究。

綜上所述，CBD 對博來霉素誘導的肺纖維化動物模型的改善作用呈劑量依賴性，其作用機制可能是通過抑制NF-κB 信號通路，減少NLRP3 炎癥小體相關蛋白的表達，抑制細胞焦亡發生的程度，從而減輕了肺纖維化。