金槍魚復合蛋白體系乳化特性分析與工藝優化

王晉,高飛,江燕,方巧飛,余海霞,張小軍,4

1(浙江海洋大學 食品與藥學學院,浙江 舟山,316022)2(浙江融創食品工業有限公司,浙江 舟山,316100) 3(浙江大學舟山海洋研究中心,浙江 舟山,316021)4(浙江省海洋水產研究所,浙江 舟山,316021)

金槍魚肌肉蛋白質含量高且氨基酸種類豐富,是一種優質蛋白資源[1]。但是金槍魚蛋白溶解性較差,乳糜液體系不穩定,蛋白變性后其功能特性會隨著熱穩定性和化學穩定性的降低而降低,出現油水分離、蛋白沉淀、肉質粗糙等現象,使其在食品加工業的應用受到限制[2]。因此要大力開發具有優良特性的蛋白質資源,添加混合物對現有的蛋白質進行改造[3]。隨著營養健康需求的不斷增長,雙蛋白乳糜液體系由于卓越的營養和功能特性而備受關注,有研究表明將動植物蛋白混合能夠改善單個蛋白的特性并幫助解決環境和資源稀缺問題,在大多數情況下,雙蛋白乳糜液體系在食品工業的應用過程中表現出出色的凝膠性、成膜性和其他表面功能特性[4]。

大豆蛋白營養價值高,具有良好的乳化性,廣泛應用于嬰幼兒配方食品中,且有研究表明在肉制品中適量添加大豆蛋白可以增加肉品穩定性和持水性,增強口感[4-6]。乳清蛋白屬于全價蛋白,必需氨基酸含量明顯高于普通的食用蛋白,易被人體吸收[7-8]。在食品生產中將乳清蛋白代替部分水產蛋白,與植物蛋白搭配形成的共混體系,在降低生產成本的同時可以更好地起到乳化的效果,提高產品的穩定性[9-10]。任廣旭等[11]研究發現由乳清蛋白和大豆蛋白組成的雙蛋白體系具有優良的消化特性,能維持血液中必需氨基酸的持續性供給,從而促進肌肉蛋白的合成。此外,為使制品獲得良好的乳化性能和細膩口感,添加適量的油脂能夠促使混合蛋白與脂質相互作用形成蛋白-脂質復合物,從而明顯改善制品的乳化性,獲得較好口感[12-14]?？傮w而言,動植物蛋白-油脂混合體系具有較為全面的營養和功能特性,為開發新型營養功能性食品提供了一種有廣泛應用前景的方法。

本研究選取油脂、大豆蛋白和乳清蛋白作為混合蛋白體系的關鍵影響因素,在單因素的實驗基礎上,以大豆蛋白、乳清蛋白、油脂含量為自變量,以金槍魚混合蛋白乳糜液的乳化特性為響應值,使用Design-Expert 13軟件對蛋白體系的乳化性和乳化穩定性進行響應面試驗,根據分析優化獲得最佳的金槍魚-植物蛋白濃度,建立穩定的金槍魚-植物蛋白乳糜體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槍魚柳,浙江融創食品工業有限公司;葵花油,益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司;大豆蛋白,山東嘉華保健品股份有限公司;乳清蛋白,潤嘉生物科技有限公司;十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),北京索萊寶有限公司。

1.2 儀器與設備

JYL-C16V料理機,九陽股份有限公司;XHF-DY高速分散器,寧波新芝生物股份有限公司;高速冷凍離心機,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;T6新世紀紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司;SQP電子天平秤,賽多利斯科技儀器有限公司;VORTEX-5旋渦混合器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;ColorFlex EZ 45/0 Hunterlab色度計,德國HunterLab公司;Zetasizer NanoZS90粒徑電位儀,英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 復合蛋白乳糜液的制備

選取金槍魚靠近背鰭的中段魚肉,手動去除皮膚、骨骼和暗色肌肉,并將背部的白色肉切成小塊(邊長約1 cm的立方體),然后將魚塊和冰水以料液比1∶9(g∶mL)漂洗2次,每次漂洗10 min,然后用濾網去除多余的水分。將300 g沖洗過的魚肉與200 g純凈水充分混合并用料理機在250 W下強力粉碎5 min得到魚肉漿。將不同質量分數的油脂(5%、10%、15%、20%、25%)、大豆蛋白(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)、乳清蛋白(1%、2%、3%、4%、5%)加入金槍魚分散液中,使用高速均質機以7 000 r/min的轉速分別在4 ℃條件下均質,樣液循環均質3次,制備出乳糜液,4 ℃下貯藏備用。

1.3.2 持水力的測定

參照BUAMARD等[15]的方法測定持水力,并做適當修改。將5 g(X)的金槍魚混合蛋白乳糜液與25 mL (V1) 的超純水在50 mL塑料離心管中混合。渦旋振蕩后以5 000 r/min離心10 min。通過帶有單層濾紙的布氏漏斗收集上層中過量的水(V2),重復測定3次,并使用公式(1)計算:

(1)

式中:X為金槍魚乳糜液的質量;V1和V2分別代表加入金槍魚乳糜液體系中水的體積和金槍乳糜液離心之后釋放的水的體積;持水力為每克金槍魚乳糜液保留水的體積。

1.3.3 白度的測定

將金槍魚乳糜液倒入透明培養皿中,以黑色杯子為背景。用色差計在室溫下3次重復測量樣品的白度值。白度按公式(2)計算:

(2)

式中:W為白度值;L*表示明度;a*和b*表示色度,且a*正值表示偏紅,負值表示偏綠;b*正值表示偏黃,負值表示偏藍。

1.3.4 粒徑的測定

采用THAGELE等[16]的方法對乳糜液粒徑進行測定。將10 g金槍魚乳糜液置于50 mL離心管中,蓋好蓋子在90 ℃水浴中加熱20 min。用粒徑電位儀測定蒸煮液的粒徑。設定樣品折射率為1.42,分散介質折射率為1.33。

1.3.5 乳化活性和乳化穩定性的測定

參照LI等[17]的方法測定其乳化性和乳化活性,從金槍魚乳糜液底部吸取50 μL乳糜液,與5 mL的0.1 g/mL SDS溶液混合,用可見分光光度計在波長500 nm處測定吸光度。乳糜液乳化性(emulsifying activity index,EAI)、乳化穩定性(emulsifying stability index,ESI)的計算分別如公式(3)、公式(4)所示:

(3)

(4)

式中:A0,勻漿后的吸光度;N為稀釋因子,100;C為樣品的質量濃度,g/mL;F為原油乳狀液的體積分數(25%);A0,0 min時所測吸光值;A10,10 min時所測吸光值。

1.3.6 乳糜液穩定性優化設計

根據單因素比較試驗結果,依據Box-Behnken試驗設計原理,考察3因素之間的交互作用并結合實際考慮。以乳化活性和乳化穩定性為響應值,設計3因素3水平的試驗見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface method experiment

1.4 數據處理

實驗結果每組重復3次,數據采用Excel 2017、Origin 2018和IBM SPSS Statistics 22.0進行圖像繪制及處理,采用Design Expert 13.0軟件對響應面數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白和油脂添加量對乳糜液白度和持水力的影響

持水力的大小反映出蛋白質分子之間的相互作用和結構狀態,會影響產品的組織狀態、口感以及穩定性[18-19]。白度的變化一定程度上反映了物質內部結構的變化[20-21]。由表2可知,隨著油脂和蛋白添加量的增加,亮度(L*)、紅色(a*)和黃色(b*)逐漸增加,金槍魚乳糜的白度從54.49連續增加到72.77,可能是親水基團的暴露使大豆蛋白和乳清蛋白的顏色中和掉部分暗灰色金槍魚乳液,動植物蛋白溶解在一起形成致密的網狀結構,蛋白質作為乳化劑對油脂進行乳化,增加了乳液的白度[22-23]。隨著油脂和蛋白添加量的增加,持水力均呈先增大后減小的趨勢,低于20%的油脂添加量可增加乳糜液的保水能力,大豆蛋白的添加量為1.5%左右時持水力達到最大值,為0.49 mL/g,乳清蛋白的添加量為3%左右時持水力達到最大值,為0.52 mL/g,表明適當的疏水基團暴露有利于蛋白質重新聚集,形成孔隙均勻的網狀結構,具有較好持水力。但過量添加則作用相反,可能是由于過多的油脂會使乳糜液體系過稀,肌原纖維蛋白分子過度展開而難以再形成致密凝膠網絡,不利于水分子包埋于凝膠網絡,從而降低持水力[24]。

表2 蛋白和油脂的添加量對乳糜液白度和持水力的影響Table 2 Effect of protein and oil addition on the whiteness and water retention of chylous fluid

2.2 蛋白和油脂添加量對乳糜液粒徑的影響

乳糜液屬于熱不穩定體系,會依據動力學穩定性原理以一定速度分離成互不相容的油、水兩相,出現絮凝、聚集、粒徑偏移等現象[25-26],乳狀液粒子越小,乳析速度越慢,乳析率越低,乳液也就越穩定[27]。由圖1可知,隨著油脂添加量的增加,乳糜液平均粒徑從5%油脂添加量的531.2 nm逐漸增大到15%油脂添加量的651.2 nm,當油脂添加量達到25%時,平均粒徑達到了695.01 nm,說明蛋白質在乳化體系中結合油的能力有限,過多的油會析出,導致體系不穩定。隨著大豆蛋白和乳清蛋白添加量的增加,乳糜液的平均粒徑均呈現先增加而減小的趨勢,乳狀液的穩定性也明顯改善。HU等[28]在研究蛋白質量濃度對乳糜液穩定性的影響中也得到了同樣的結論。結合圖2,大豆蛋白和乳清蛋白的添加可以增加乳糜液蛋白濃度,乳糜液粒徑減小,絮凝現象減少,蛋白分子之間結構更加致密均勻。因此,大豆蛋白添加量應高于1%,乳清蛋白應高于2%,以此來控制乳糜液平均粒徑在600 nm以下,從而改善產品細膩度及適口性。

a-油脂;b-大豆蛋白;c-乳清蛋白圖1 蛋白和油脂添加量對乳糜液粒徑的影響Fig.1 Effect of the addition of different mass fractional proteins and oils on chylac fluid particle size

2.3 蛋白和油脂添加量對乳糜液乳化活性和乳化穩定性的影響

乳化活性一定程度上反映出水油結合形成乳化液的能力,乳化穩定性則反映油水混合乳狀液維持穩定的能力,二者受物質顆粒大小、加工方式、加工溫度和蛋白質質量濃度等因素綜合影響[29]。由圖2可知,隨著油脂含量升高,界面面積增大,乳糜液的乳化活性也隨之提高,而乳化穩定性減小,可能是由于油含量的增加使乳狀液油滴形成的保護膜較薄,導致蛋白質相互聚集下沉或油滴相互聚集上浮,蛋白在油滴外圍形成的剛性結構強度不大,從而失去穩定性。結合實際生產狀況考慮到添加過多的油脂容易析出,且不利于人體健康,因此油脂添加應控制在10%左右。大豆蛋白和乳清蛋白的添加可顯著增加乳糜液的乳化活性,說明乳糜液凝膠網絡結構的形成以及在界面上的吸附和擴散作用增加,促使疏水性基團的暴露,蛋白質分子彼此靠在一起形成膠束,更迅速地轉移至油-水界面,有效降低了表面張力[9,30]。但當大豆蛋白濃度繼續增加至2%、乳清蛋白濃度增加至4%,即達到膠束臨界濃度后,乳糜液乳化性和乳化穩定性趨于平穩。

a-油脂;b-大豆蛋白;c-乳清蛋白圖2 蛋白和油脂添加量對乳糜液乳化活性和乳化穩定性的影響Fig.2 Effect of the addition of different mass fractional proteins and oils on the emulsification activity and emulsification stability of chylous fluid

2.4 響應曲面法優化設計

依據表3的實驗數據,對響應值進行最小二乘法擬合回歸分析,得到二次多元回歸方程模型為:

Y1=98.75+8.66×A-5.04×B+0.103 8×C-0.392 5×AB+3.01×AC-5.50×BC-5.49×A2-14.46×B2-10.05×C2

Y2=77.33+8.68×A-3.95×B-0.692 5×C-0.742 5×AB+2.77×AC-5.28×BC-5.56×A2-12.31×B2-8.60×C2

方差分析結果見表4。

表3 Box-Benhnken試驗設計方案及響應值Table 3 Program of Box-Behnken experimental design and response value

表4 Y1回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for regressive equation

由表4可知,該模型P<0.000 1,表明模型極顯著(P<0.01);失擬項P值不顯著,表明建立的模型擬合度較好;方程的校正決定系數R1Adj=0.980 3,表明約有98.03%的響應值變化能由該模型進行解釋,實際實驗與模型建立的方程擬合度較好,能用于分析和預測混合蛋白金槍乳糜液的工藝優化。結合圖3可知,對乳糜液乳化性的影響極顯著(P<0.01)的因素為A、B、BC、A2、B2、C2,其他因素均不顯著。模型的F值越大對乳濁液乳化活性的影響越大?？梢?各因素對乳糜液乳化活性的影響程度為:A(油脂)>B(大豆蛋白)>C(乳清蛋白)。

圖3 Y1=f(A,B,0);Y1=f(A,C,0);Y1=f(B,C,0)響應曲面Fig.3 Response surface of f(A,B,0), f(A,C,0), f(B,C,0)

由表5可知,P<0.000 1,表明模型極顯著(P<0.01);失擬項P值不顯著,表明建立的模型擬合度較好;方程的校正決定系數R2Adj=0.985 3,表明約有98.53%的響應值變化能由該模型進行解釋,實際實驗與模型建立的方程擬合度較好,能用于分析和預測混合蛋白金槍乳糜液的工藝優化。結合圖4可知,對乳糜液乳化穩定性的影響極顯著(P<0.01)的因素為A、B、BC、A2、B2、C2,對乳糜液乳化穩定性的影響顯著(P<0.05)的因素為AC,其他因素均不顯著。模型的F值越大對乳糜液乳化活性的影響越大。可見,各因素對乳糜液乳化活性的影響程度為:A(油脂)>B(大豆蛋白)>C(乳清蛋白)。

表5 Y2回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance for regressive equation

圖4 Y2=f(A,B,0);Y2=f(A,C,0);Y2=f(B,C,0)響應曲面Fig.4 Response surface of f(A,B,0), f(A,C,0), f(B,C,0)

經Design-Expert 13軟件分析得出最佳配方為:油脂含量9.41%、大豆蛋白1.47%、乳清蛋白2.99%;相應的模型預測乳糜液乳化活性為96.10 mL/g,乳化穩定性為74.55%。選取最佳配比制備復合蛋白乳液,測定其乳化性和乳化穩定性。乳液乳化活性為95.34 mL/g,乳化穩定性為76.87%。實際值與預測值相近,說明該模型能夠較好地預測乳液穩定性條件。

3 結論

a)油脂的添加可提高金槍魚乳糜液的持水力,但過多的油脂會使乳糜液體系過稀,結果顯示持水力降低,添加量超過20%后油脂析出,粒徑達到了695.01 nm,乳化穩定性降低。大豆蛋白和乳清蛋白的添加對金槍魚乳糜體系乳化作用顯著(P<0.05),適量添加可增加產品白度和持水力,疏水基團的暴露有利于蛋白質重新聚集,乳糜液粒徑減小,絮凝現象減少,同時乳糜液界面面積增大,乳化活性上升,乳化穩定性趨于平穩,產品細膩度及適口性得到改善。

b)以乳糜液乳化活性和乳化穩定性為響應值,在單因素實驗基礎上,采用響應曲面分析法對復合蛋白金槍魚乳糜液進行優化,建立的二次回歸方程高度顯著,模型擬合度好。根據模型及響應面分析,進行修正后確定較理想乳化劑的復配條件為:油脂含量9.41%、大豆蛋白含量1.47%、乳清蛋白含量2.99%,此時的乳化活性為96.10 mL/g,乳化穩定性為74.55%,乳糜液產品穩定性好,不易析出。