基于miR-126-5p/Bcl-2/mPTP通路探究穩心湯對缺氧/復氧誘導H9c2心肌細胞損傷修復的作用機制

摘要 目的：觀察穩心湯對缺氧/復氧誘導的H9c2心肌細胞損傷的影響，并基于miR-126-5p/Bcl-2/心肌細胞線粒體通透性轉換孔（mPTP）調控通路明確其作用機制。方法：使用5%CO2、1%O2、94%N2培養箱構建H9c2心肌細胞缺氧/復氧模型，并通過細胞轉染技術達到miR-126-5p的過表達與抑制。待干預結束后觀察心肌細胞上清液乳酸脫氫酶（LDH）釋放水平、心肌細胞活性氧（ROS）含量；原位末端轉移酶標記技術（TUNEL）檢測心肌細胞凋亡；流式細胞儀檢測心肌細胞線粒體mPTP開放水平；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測細胞色素C（Cyt-C）釋放水平與Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平；實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測miR-126-5p及Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的RNA表達水平。結果：與miR-126-5p低表達組比較，miR-126-5p過表達可顯著降低LDH釋放水平；減少心肌細胞ROS含量；改善心肌細胞凋亡率；提高心肌細胞CalceinAM水平，減少mPTP開放。miR-126-5p過表達可以減少H9c2心肌細胞Cyt-C釋放水平，miR-126-5p低表達可部分減少H9c2心肌細胞Cyt-C釋放水平。miR-126-5p過表達可上調Bcl-2蛋白與基因表達，下調Caspase-3與Caspase-9蛋白與基因表達。miR-126-5p低表達可部分上調miR-126-5p表達水平與Bcl-2蛋白與基因表達；部分下調Caspase-3與Caspase-9蛋白與基因表達。結論：穩心湯改善缺氧/復氧誘導的H9c2心肌細胞損傷可能與調控miR-126-5p/Bcl-2/mPTP信號通路有關，從而減輕氧化應激反應，降低線粒體膜通透性，抑制心肌細胞凋亡，延緩心肌損傷。

關鍵詞 穩心湯；H9c2心肌細胞；miR-126-5p/Bcl-2/心肌細胞線粒體通透性轉換孔（mPTP）；缺氧/復氧；心肌損傷

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.15.009

The Effect of Wenxin Formula on the Damage and Repair of H9c2 Myocardial Cells Induced by Hypoxia/Reoxygenation Based on miR-126-5p/Bcl-2/mPTP Regulatory Pathway

XIE Zicong， LIU Yongmei， CHEN Hengwen， TAN Yuqing， LI Jun

Guang ′anmen Hospital， China Academy of Chinese Medicine Science， Beijing 10005 China

Corresponding Author LI Jun， E-mail： gamyylj@163.com

Abstract Objective：To observe the effect of Wenxin Formula on H9c2 myocardial cell injury induced by hypoxia/reoxygenation，and to clarify its mechanism based on the regulatory pathway of miR-126-5p/Bcl-2/mitochondrial permeability conversion pore（mPTP）.Methods：The hypoxia and reoxygenation model of H9c2 myocardial cells were constructed in a three-gas incubator，and the overexpression and inhibition of miR-126-5p were achieved by cell transfection.After the intervention，the release level of lactate dehydrogenase（LDH）and the content of reactive oxygen species（ROS）in cardiomyocytes were observed.Myocardial cell apoptosis was detected by TUNEL.The open level of mPTP was detected by flow cytometry.The release level of cytochrome-C（Cyt-C）and the expression levels of Bcl- Caspase- and Caspase-9 were detected by Western Blot.Real-time quantitative fluorescence polymerase reaction（qRT-PCR）was used to detect the expression levels of miR-126-5p，Bcl- Caspase-3 and，Caspase-9 RNA.Results：Compared with miR-126-5p low expression group，miR-126-5p overexpression significantly reduced the LDH release level;reduced ROS content in cardiomyocytes;improved myocardial cell apoptosis rate;calceinam level increased and mPTP opening decreased.Overexpression of miR-126-5p could reduce the Cyt-C release level of H9c2 cardiomyocytes，and low expression of miR-126-5p could partially reduce the Cyt-C release level of H9c2 cardiomyocytes.Overexpression of miR-126-5p could up-regulate the expression of Bcl-2 protein and gene，and down-regulate the expression of Caspase-3 and Caspase-9 protein and gene.When miR-126-5p expression was low，the expression level of miR-126-5p and Bcl-2 could be partially up-regulated.Partially down-regulated the expression levels of Caspase-3 and Caspase-9.Conclusion：The Wenxin Formula could improve H9c2 myocardial cells injury induced by hypoxia/reoxygenation which may be related to the regulation of miR-126-5p/Bcl-2/mPTP signaling pathway，so as to reduce oxidative stress response，reduce mitochondrial membrane permeability，inhibit cardiomyocyte apoptosis，and delay myocardial injury.

Keywords Wenxin Formula; H9c2 myocardial cells; miR-126-5p/Bcl-2/mPTP; hypoxia/reoxygenation; myocardial injury

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary heart disease，CHD）已成為重大公共衛生問題。據《中國心血管健康與疾病報告2021》［1］推算，中國心血管病現患人數約3.3億人，其中冠心病病人1 139萬人，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患病率與死亡率均呈上升趨勢，心血管病死亡率已高于腫瘤及其他疾病，居于首位。目前，冠心病可通過經皮冠狀動脈支架植入術（percutaneous coronary intervention，PCI）、冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass grafting，CABG）及口服常規二級預防藥物等治療，多數病人可從中獲益［2］。仍有部分病人病情復雜，如存在手術風險、冠狀動脈病變程度嚴重、PCI術后再狹窄、支架內血栓等，均可不同程度影響冠心病病人的療效。中醫藥運用益氣溫陽、活血通絡、解毒等方法治療冠心病，療效確切，可改善病人臨床癥狀，減輕炎癥反應，提高病人生活質量，但作用機制仍待闡明［3-4］。

穩心湯是本課題組結合多年臨床實踐與名老中醫經驗總結出的有效方劑，藥物組成有姜黃、黃芪、黨參、赤芍、川芎、莪術、肉桂、瓜蔞、大黃、細辛、甘草，可益氣活血、散寒止痛、通陽降濁，善治冠心病氣虛血瘀證［5］。方中以姜黃、黃芪為君藥，可補氣活血，其中黃芪有效成分黃芪甲苷、姜黃有效成分姜黃素均已證實在治療冠心病中具有較好效果，可調節炎癥反應，改善血管內皮功能，緩解心肌缺血［6-7］。本課題組通過穩心湯干預急性心肌梗死大鼠，觀察其作用機制，發現穩心湯可改善大鼠心功能、抑制心肌纖維化、調節心室重構，其機制可能與上調miR-126-5p，并調控其下游Bcl-2、Caspase-9等基因表達相關［8-9］。因此，本研究在前期實驗基礎上，通過缺氧/復氧誘導H9c2心肌細胞損傷模型，模擬冠心病心肌受損，基于miR-126-5p/Bcl-2/心肌細胞線粒體通透性轉換孔（mPTP）調控通路觀察穩心湯改善心肌損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

H9c2心肌細胞系購于中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。

1.2 實驗藥物

實驗用穩心湯購自中國中醫科學院廣安門醫院。實驗用黃芪甲苷標準品（貨號：110781）與姜黃素標準品（貨號：110823）均購自中國食品藥品鑒定研究院。實驗用鹽酸曲美他嗪片（每片20 mg）購自中國中醫科學院廣安門醫院。藥物用不含胎牛血清（FBS）的DMEM培養基充分溶解（使用DMSO助溶），配制成2 mg/mL的母液，分裝于凍存管中，－20 ℃保存。每次實驗時需用不含FBS的DMEM培養基根據所需濃度進行稀釋。

1.3 實驗試劑

DMEM高糖培養基（Gibco，C11995500BT）；FBS（四季青，11011-8611）；青鏈霉素混合液（P1400）、磷酸緩沖液（PBS，P1020）、通用細胞凍存液（24800）、RIPA裂解液（R0010）、二喹啉甲酸法（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（PC0020）、5×蛋白上樣緩沖液（含DTT，P1040）、10×電泳轉移緩沖液（D1060）、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（T1070）、20×TBST（T1080）、彩虹245plus廣譜蛋白Marker（5-245KD）（PR1930-50T）均購自Solarbio公司；Trypsin0.25%胰蛋白酶溶液（HyClone，SH30042.01）；細胞增殖毒性檢測（CCK-8）試劑盒（日本同仁，CK04）；乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒（碧云天生物，C0017）；純化線粒體氧化應激活性氧（ROS）魯米諾化學發光法定量檢測試劑盒（GENMED SCIENTIFICS，GMS10112.2）；二甲基亞砜（DMSO，D2650）、Tunel（11684795910）、DAPi（D9542）購自Sigma公司。氯仿、異丙醇、無水乙醇購自北京化學試劑公司；Trizol試劑（Invitrogen公司，14105）；FastQuant RT Kit 逆轉錄試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司，N2625］；SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒（美國應用生物公司，1403448）；miR-126-5p、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9引物購自賽百盛生物科技有限公司；LipofectamineTMRNAiMAX轉染試劑（Thermo，13778150）；Bcl-2 Rabbit pAb（A0208）、Caspase-9 Rabbit pAb（A11451）、Caspase-3（A2156）、Cytochrome C Rabbit pAb（A0225）購自Abclonal公司；Omni-EasyTM一步法PAGE凝膠快速制備試劑盒（10%，PG212）、Omni-ECLTM增強型化學發光檢測試劑盒（皮克級，SQ101）購自雅酶公司；脫脂奶粉（普利萊，P1622）；eBlot L1 PVDF膜轉膜試劑A（L00791C）、eBlot L1 PVDF膜轉膜試劑B（L00793C）、eBlot L1 PVDF膜平衡濃縮液（L00734C）購自GenScript；甲醇（天津賽孚瑞）；山羊抗兔IgG（H＋L），HRP（111035003）、山羊抗鼠IgG（H＋L），HRP（115035003）購自Jackson公司；β-actin鼠單抗（銳爾康生物，REK0001）。

1.4 實驗儀器

CO2細胞培養箱（Thermo，3111）；CO2細胞培養箱（ESCO，CCL-050T-8-IVF）；超凈臺（上海蘇凈實業有限公司，SW-CJ-2D）；低速離心機（上海安亭科學儀器廠，KA-1000）；多功能酶標儀（TECAN，Spark）；電熱恒溫水浴鍋［林茂科技（北京）有限公司，DZKW-4］；倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS，CKX53）；流式細胞儀［碧迪醫療器械（上海）有限公司，Calibur II型］；化學發光儀（Molecμlar Devices，SpectraMax L）；低溫高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，TGL-16）；qTower3（Analytikjena，3107A-1368），聚合酶鏈式反應（PCR）擴增儀（AGS，AGT9601）；生物安全柜（北京東聯哈爾儀器制造有限公司，BSC-1360II A2）；渦旋震蕩儀（寧波市鄞州群安實驗儀器有限公司，MIX-28）；電泳儀（Thermo scientific，Mini Ge Tank）；轉膜儀（GenScript eBlotTM L1）；搖床（泰州諾米醫療科技有限公司，NYC-80）；曝光儀（上海易孛特，eBlot）。

1.5 實驗方法

1.5.1 細胞培養

H9c2心肌細胞所用完全培養基由DMEM高糖培養基、10%FBS、1%青鏈霉素混合液組成。培養環境為37 ℃、5%CO2細胞培養箱。培養過程中需定期觀察細胞形態及數量，待細胞融合度達到80%～90%時，使用胰蛋白酶消化，進行細胞傳代、凍存及相關檢測。

1.5.2 缺氧/復氧模型構建

取對數生長期的H9c2心肌細胞鋪于細胞培養瓶中，待細胞貼壁過夜后，將細胞置于含5%CO2、1%O2、94%N2的培養箱缺氧24 h，再將細胞放于正常培養箱內培養12 h，構建H9c2心肌細胞缺氧/復氧模型。

1.5.3 細胞轉染

細胞經常規消化終止后調整細胞密度為5×104個/mL，鋪于6孔細胞培養板內，每孔1 500 μL，繼續常規培養24 h，待細胞融合度達到70%以上時，無菌狀態下無血清培養基稀釋miRNA至200 nmol/L，同時加入4 μL的lipo2000轉染試劑，室溫反應15 min進行細胞轉染。轉染24 h后，根據細胞分組進行實驗。

1.5.4 細胞分組及處理

將轉染后的miR-126-5p過表達細胞和低表達細胞分別進行分組。1）

miR-126-5p過表達H9c2心肌細胞分組：mim-Control組正常培養；mim-Model組缺氧/復氧培養；mim-WXT-H組在缺氧/復氧培養基礎上，同時予穩心湯20 μg/mL干預；mim-WXT-M組在缺氧/復氧培養基礎上，同時予穩心湯10 μg/mL干預；mim-WXT-L組在缺氧/復氧培養基礎上，同時予穩心湯5 μg/mL干預；mim-Cur組在缺氧/復氧培養基礎上，同時予姜黃素50 μg/mL干預；mim-AS-IV組在缺氧/復氧培養基礎上，同時予黃芪甲苷50 μg/mL干預；mim-QMTQ組在缺氧/復氧培養基礎上，同時予鹽酸曲美他嗪片10 μg/mL干預。2）miR-126-5p低表達H9c2心肌細胞分組：in-Control組正常培養；in-Model組缺氧/復氧培養；in-WXT-H組在缺氧/復氧培養基礎上，同時予穩心湯20 μg/mL干預；in-WXT-M組在缺氧/復氧培養基礎上，同時予穩心湯10 μg/mL干預；in-WXT-L組在缺氧/復氧培養基礎上，同時予穩心湯5 μg/mL干預；in-Cur組在缺氧/復氧培養基礎上，同時予姜黃素50 μg/mL干預；in-AS-IV組在缺氧/復氧培養基礎上，同時予黃芪甲苷50 μg/mL干預；in-QMTQ組在缺氧/復氧培養基礎上，同時予鹽酸曲美他嗪片10 μg/mL干預。

1.5.5 檢測心肌細胞上清LDH釋放水平

調整細胞密度為5×104個/mL，鋪于96孔細胞培養板內，每孔100 μL，予不同處理后，按照說明書操作步驟，每孔分別加入60 μL的LDH檢測工作液，混勻，室溫避光孵育30 min，然后在490 nm處測定吸光度。

1.5.6 檢測心肌細胞ROS含量

調整細胞密度為5×104個/mL，鋪于6孔細胞培養板內，每孔1 500 μL，予不同處理后，棄上清，按照說明書加入試劑，打開化學發光儀，整合測讀10 s，獲得相對發光單位（relative light unit，RLU）。

1.5.7 原位末端轉移酶標記技術（TUNEL）檢測心肌細胞凋亡

調整細胞密度為5×104個/mL，鋪于24孔細胞培養板內，每孔500 μL，予不同處理后，棄培養基，使用TUNEL進行檢測，熒光顯微鏡拍照，其中TUNEL為綠熒光，DAPi為藍色熒光。

1.5.8 心肌細胞線粒體通透性轉換孔開放檢測

調整細胞密度為5×104個/mL，鋪于6孔細胞培養板內，每孔1 500 μL，予不同處理后，消化細胞，調整細胞密度為1×106/mL，每個樣品體積為1 mL；使用流式細胞儀檢測Calcein AM水平，Calcein AM染色后經CoCl2處理會導致僅線粒體內呈現Calcein的綠色熒光，當線粒體膜通透性轉換孔開放，通透性增加時，Calcein AM熒光強度降低。

1.5.9 蛋白質免疫印記法（Western Blot）檢測細胞色素C（Cyt-C）釋放水平及Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表達水平

調整細胞密度為5×104個/mL，鋪于100 mm直徑的細胞培養皿內，每培養皿8 mL。予不同處理后，消化細胞，取細胞上清保存備用。使用RIPA蛋白抽提試劑進行蛋白提取，用BCA法檢測蛋白濃度，加入4×LDS和超純水使各樣品濃度值相同，沸水浴變性5 min。然后制備PAGE凝膠、電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育，然后將ECL加到PVDF膜上后避光反應3～5 min，eBlot曝光儀進行曝光，選擇合適曝光時間的圖片，通過Image J軟件進行灰度值分析。一抗具體信息見表1。

1.5.10 實時熒光定量逆轉錄PCR法（qRT-PCR）檢測miR-126-5p及Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9表達水平調整細胞密度為5×104個/mL，鋪于6孔細胞培養板內，每孔1 500 μL，予不同處理后，消化細胞，收集混懸液至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入Trizol 1 mL重懸細胞。提取細胞RNA，根據試劑盒進行反轉錄，在95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，40個循環；72 ℃ 8 min條件下進行PCR擴增。引物序列見表 以2－△△Ct計算。

1.6 統計學處理

采用SPSS 28.0軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用ANOVA單因素分析；不符合正態分布的定量資料以中位數或四分位間距［M（Q Q3）］表示，采用Kruskal-Wallis檢驗。定性資料以例數或百分比（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 心肌細胞上清LDH釋放水平

miR-126-5p過表達各組結果顯示，與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細胞上清中LDH含量明顯升高（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組LDH含量明顯降低（P＜0.05）。miR-126-5p低表達各組結果顯示，與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細胞上清中LDH含量明顯升高（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-H組、in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組LDH含量均明顯降低（P＜0.05）。詳見表3。

miR-126-5p過表達心肌細胞與低表達心肌細胞不同處理條件下比較，發現兩Control組、兩WXT-H組、兩QMTQ組LDH釋放水平比較差異無統計學意義（P＞0.05），兩Model組、兩WXT-M組、兩WXT-L組、兩Cur組、兩AS-IV組LDH釋放水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。整體說明miR-126-5p高表達可以減少LDH釋放水平。詳見圖1。

2.2 心肌細胞ROS水平

miR-126-5p過表達各組結果顯示，與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細胞ROS含量明顯升高（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組的ROS含量均明顯降低（P＜0.05）。miR-126-5p低表達各組結果顯示，與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細胞ROS含量明顯升高（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-H組、in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組的ROS含量均明顯降低（P＜0.05）。詳見表4。

miR-126-5p過表達心肌細胞與低表達心肌細胞不同處理條件下比較，發現兩Control組、兩Model組、兩WXT-H組、兩WXT-M組、兩WXT-L組、兩Cur組、兩AS-IV組、兩QMTQ組ROS含量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。miR-126-5p高表達可以減輕心肌受損后氧化應激反應。詳見圖2。

2.3 心肌細胞凋亡情況

miR-126-5p過表達各組結果顯示，與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-QMTQ組凋亡率均明顯降低（P＜0.05），mim-AS-IV組凋亡率有降低趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。miR-126-5p低表達各組結果顯示，與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-H組、in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組的凋亡率雖有降低趨勢，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。說明miR-126-5p低表達心肌細胞凋亡率較高，且用藥后改善效果不佳。詳見圖3、圖4、表5。

miR-126-5p過表達心肌細胞與低表達心肌細胞不同處理條件下比較，發現兩Control組心肌細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），兩Model組、兩WXT-H組、兩WXT-M組、兩WXT-L組、兩Cur組、兩AS-IV組、兩QMTQ組心肌細胞凋亡率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），說明miR-126-5p表達較低時，容易發生心肌細胞凋亡。詳見圖5。

2.4 mPTP開放結果

miR-126-5p過表達各組結果顯示，與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細胞CalceinAM水平明顯降低（P＜0.05），mPTP開放程度升高；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組的CalceinAM水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），mPTP開放程度降低。miR-126-5p低表達各組結果顯示，與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細胞CalceinAM水平明顯降低（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-H組、in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組的CalceinAM水平明顯升高（P＜0.05）。詳見表6。

miR-126-5p過表達心肌細胞與低表達心肌細胞不同處理條件下比較發現，兩Control組、兩Model組、兩WXT-H組、兩WXT-M組、兩WXT-L組、兩AS-IV組、兩QMTQ組

CalceinAM水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），說明miR-126-5p過表達與低表達，可以降低線粒體膜通透性，從而抑制心肌細胞凋亡。詳見圖6。

2.5 心肌細胞Cyt-C含量

miR-126-5p過表達各組結果顯示，與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細胞Cyt-C釋放水平明顯升高（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組的Cyt-C釋放水平明顯降低（P＜0.05）。說明miR-126-5p過表達心肌細胞缺氧后Cyt-C釋放增加，經穩心湯及其有效成分干預后可以減少Cyt-C的釋放。詳見圖7、圖8。

miR-126-5p低表達組結果顯示，與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細胞Cyt-C釋放水平明顯升高（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-H組、in-WXT-M組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組的Cyt-C釋放水平明顯降低（P＜0.05），in-WXT-L組未見降低趨勢。說明miR-126-5p低表達心肌細胞缺氧后Cyt-C釋放增加，經穩心湯及其有效成分干預后可以減少Cyt-C的釋放。詳見圖9、圖10。

2.6 Western Blot檢測Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達

miR-126-5p過表達組結果顯示：1）就Caspase-9、Caspase-3蛋白相對表達而言，與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細胞Caspase-9、Caspase-3表達明顯升高（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組Caspase-9、Caspase-3表達水平明顯降低（P＜0.05）；mim-WXT-H組未見明顯降低。2）就Bcl-2蛋白相對表達而言，與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細胞Bcl-2表達明顯降低（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組的Bcl-2表達水平明顯升高（P＜0.05）；mim-Cur組Bcl-2表達有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。說明miR-126-5p過表達心肌細胞缺氧后Caspase-9、Caspase-3蛋白表達水平均呈上升趨勢，Bcl-2蛋白表達水平呈下降趨勢；經穩心湯及其有效成分干預后可以減少Caspase-9、Caspase-3蛋白表達，提高Bcl-2表達水平。詳見圖11、圖12。

miR-126-5p低表達各組結果顯示：1）就Caspase-9、Caspase-3蛋白相對表達而言，與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細胞Caspase-9、Caspase-3蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組的Caspase-9、Caspase-3表達水平明顯降低（P＜0.05）；in-WXT-H組Caspase-9有降低趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）；in-WXT-H組的Caspase-3表達水平明顯降低（P＜0.05）。2）就Bcl-2蛋白相對表達而言，與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細胞Bcl-2蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-AS-IV組、in-QMTQ組的Bcl-2表達水平明顯升高（P＜0.05）；in-WXT-H組Bcl-2表達無明顯變化，in-Cur組Bcl-2表達明顯降低（P＜0.05）。說明miR-126-5p過表達心肌細胞缺氧后Caspase-9、Caspase-3蛋白表達水平均呈上升趨勢，Bcl-2蛋白表達水平呈下降趨勢；經穩心湯及其有效成分干預后可以減少Caspase-9、Caspase-3蛋白表達，提高Bcl-2表達水平。詳見圖13、圖14。

2.7 miR-126-5p、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3基因表達水平

miR-126-5p過表達各組結果顯示：與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細胞miR-126-5p、Bcl-2水平明顯降低（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組的miR-126-5p、Bcl-2基因表達水平明顯升高（P＜0.05）。與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細胞Caspase-3、Caspase-9水平明顯升高（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組的Caspase-3表達水平明顯減少（P＜0.05），mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組的Caspase-9表達水平明顯減少（P＜0.05），mim-WXT-H組、mim-WXT-M組Caspase-9表達差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表7。

miR-126-5p低表達各組結果顯示：與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細胞miR-126-5p水平明顯降低（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-H組、in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組miR-126-5p水平明顯升高（P＜0.05）；與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細胞Bcl-2水平明顯降低（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-AS-IV組、in-QMTQ組Bcl-2水平明顯升高（P＜0.05）；in-WXT-H組、in-Cur組Bcl-2水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細胞Caspase-3水平明顯升高（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-H組、in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組Caspase-3水平明顯降低（P＜0.05）；與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細胞Caspase-9水平明顯升高（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組Caspase-9水平明顯降低（P＜0.05），in-WXT-H組Caspase-9水平差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表8。

3 討 論

冠心病在中醫理論中可歸屬于“胸痹”“心痛”范疇。《金匱要略》曰：“夫脈當取太過不及，陽微陰弦，即胸痹而痛，所以然者，責其極虛也”。說明胸痹心痛的基本病機為“陽微陰弦”，胸痹病人常虛實夾雜，以虛為主。目前，多數學者認為冠心病的發生發展多與“氣”“血”相關。史大卓教授認為冠心病的基本病機為“虛在氣，留在瘀”，常用治法為“益氣活血法”［10］。有學者通過觀察冠心病的中醫證候分布特點，發現氣虛血瘀證居于首位，且男性與女性一致［11］。因此，可認為氣虛血瘀是冠心病的主要病機。益氣活血法則是冠心病的主要治法。通過觀察益氣活血法在冠心病方面的應用，發現常用的益氣活血劑有補氣劑、活血化瘀劑、穩心湯、養心顆粒、補陽還五湯、益氣活血通脈湯等，主要藥物包含黃芪、黨參、丹參、三七，且作用機制主要集中在炎癥反應、細胞凋亡等方面［12］。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一種小型非編碼RNA，其長度為18～22 nt，可以通過識別同源序列干擾、轉錄、翻譯表觀遺傳學過程來調節基因的表達［13］。已有研究證明，miRNA可以參與諸多生物學過程如細胞生長、組織分化、細胞增殖、胚胎發育與細胞凋亡，與心血管疾病、腫瘤和衰老等診斷、治療及預測密切相關［14］。冠心病及急性心肌梗死等常伴有心肌損傷［15］。近年來，隨著科技的進步，研究發現miRNA可以參與諸多冠心病及心肌梗死的病理改變及治療，在改善心功能、抑制細胞凋亡、促進血管新生從而改善心肌損傷等方面具有獨特的臨床價值［16-18］。李婭琳［19］通過觀察冠心病病人外周血中miR-126的表達與炎性因子的相關性，發現miR-126與冠心病嚴重程度呈正相關，當miR-126下調時，可促進機體內血管細胞黏附因子-1（sVCAM-1）及IL-1、IL-6、TNF-α的釋放，從而參與冠心病發生發展。已有研究者分析發現，細胞凋亡可通過Beclin-Bcl-2/Bcl-xl復合物、mTOR及TNF-α、內質網應激等途徑激活［20-21］。

Bcl-2相關蛋白與細胞凋亡密切相關。有遺傳學表明，Bcl-2對控制細胞程序性死亡至關重要，而Bcl-2蛋白家族則是導致半胱氨酸蛋白酶家族激活的關鍵調節因子［22］。Caspase可參與細胞生長分化與凋亡調節，與真核細胞的凋亡密切相關。劉嘉爍等［23］通過觀察藥物對H2O2誘導的心肌細胞凋亡作用機制，發現橙皮苷可以顯著促進抗凋亡基因與Bcl-2蛋白的表達，進而抑制促凋亡基因（Bax）和Caspase蛋白表達，從而阻抑細胞凋亡。研究表明，當大鼠腦動脈發生栓塞時，Bcl-2的表達明顯降低，Bax與p-p38 MAPK的表達明顯升高，用藥干預后則Bcl-2表達增多，Bax表達減少，說明活化p-p38 MAPK通路可調節Bcl-2與Bax的表達進而改善血管缺血再灌注損傷［24］。亦有研究發現，當細胞凋亡率明顯升高時，Bcl-2蛋白表達顯著降低，Caspase-3蛋白表達顯著升高，說明細胞凋亡可能與激活Bcl-2/Caspase-3信號通路有關［25］。

本研究結果顯示，當心肌細胞缺氧損傷后，miR-126-5p表達降低，可以負向調節LDH與ROS的釋放，同時增加心肌細胞凋亡率，提高線粒體膜通透性，增加心肌細胞Cyt-C釋放水平，減少Bcl-2表達，進而上調Caspase-3及Caspase-9表達。用穩心湯及黃芪甲苷與姜黃素干預后，可以上調miR-126-5p表達。miR-126-5p高表達可以明顯降低心肌細胞LDH釋放水平，減少ROS釋放，改善心肌細胞凋亡率，減少mPTP開放，降低線粒體膜通透性，同時減少凋亡因子釋放。其機制可能與上調Bcl-2表達水平、下調Caspase-3和Caspase-9表達水平相關。

綜上所述，本研究通過構建心肌細胞缺氧/復氧模型模擬冠心病心肌損傷過程，證明穩心湯可減輕氧化應激反應，降低線粒體膜通透性，減少Cyt-C等凋亡因子釋放，進而抑制心肌細胞凋亡，延緩心肌損傷。其作用機制可能與miR-126-5p/Bcl-2/mPTP調控通路有關，為臨床使用益氣活血法治療冠心病提供科學依據。

參考文獻：

［1］中國心血管健康與疾病報告2021編寫組.《中國心血管健康與疾病報告2021》概述［J］.中國心血管病研究，202 20（7）：577-596.

［2］林深，馬涵萍，袁碩，等.復雜冠心病血運重建策略內外科專家共識［J］.中國循環雜志，202 37（11）：1073-1085.

［3］林鵑，鄭夢丹，琚杰.扶陽活血方治療氣滯血瘀型不能進行血運重建的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病臨床研究［J］.河南中醫，202 43（2）：262-266.

［4］高健，李軍.運用扶陽活血法治療冠心病［J］.北京中醫藥，2020，39（7）：710-713.

［5］李軍，張振鵬，熊興江，等.穩心湯治療不穩定性心絞痛的隨機對照研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2016，22（4）：154-158.

［6］俞鵬.黃芪甲苷聯合遠程缺血后適應對急性心肌梗死大鼠保護作用及機制研究［D］.南京：南京中醫藥大學，2016.

［7］王峰，武維恒.姜黃素在冠心病中的研究進展［J］.醫學綜述，201 17（9）：1380-1382.

［8］武慶娟.基于miR-126-5p/Bcl-212凋亡通路的穩心湯治療冠心病不穩定性心絞痛陽虛血瘀證機制研究［D］.北京：中國中醫科學院，2019.

［9］趙薇.基于miR-126-5p/Bcl-2通路的穩心湯抑制大鼠心梗后心肌細胞凋亡的機制研究［D］.北京：中國中醫科學院，2021.

［10］崔源源，李圣耀，史大卓.介入后冠心病“虛在氣、留在瘀”的中醫病機認識初探［J］.中國中西醫結合雜志，202 42（3）：360-362.

［11］劉靜.冠心病不穩定型心絞痛中醫證候分布特點的分析［D］.哈爾濱：黑龍江中醫藥大學，2022.

［12］鄒麗娜，于睿.益氣活血法在冠心病領域研究的可視化分析［J/OL］.實用中醫內科雜志：1-7［2023-08-07］.http：//kns.cnki.net/kcms/detail/21.1187.R.20230310.1752.016.html.

［13］CHEN L，HEIKKINEN L，WANG C L，et al.Trends in the development of miRNA bioinformatics tools［J］.Briefings in Bioinformatics，2019，20（5）：1836-1852.

［14］HILL M，TRAN N.miRNA interplay：mechanisms and consequences in cancer［J］.Disease Models amp; Mechanisms，202 14（4）：dmm047662.

［15］楊志偲，王坤鋒，羅文平.自擬補腎活血湯治療無法進行血運重建的冠心病的臨床研究［J］.中醫藥導報，2018，24（23）：77-81.

［16］LEW J K，PEARSON J T，SAW E，et al.Exercise regulates microRNAs to preserve coronary and cardiac function in the diabetic heart［J］.Circ Res，2020，127（11）：1384-1400.

［17］WOJCIECHOWSKA A，BRANIEWSKA A，KOZAR-KAMINSKA K.microRNA in cardiovascular biology and disease［J］.Advances in Clinical and Experimental Medicine，2017，26（5）：865-874.

［18］孟憲杰，劉蕊，曹麗慧，等.基于生物信息學探討miRNA在糖尿病合并冠心病患者中的意義［J］.中國煤炭工業醫學雜志，202 26（1）：6-11.

［19］李婭琳.冠心病病人外周血miR-126與sVCAM-1的表達及其相關性研究［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2020，18（3）：470-473.

［20］DONG Y，CHEN H W，GAO J L，et al.Molecular machinery and interplay of apoptosis and autophagy in coronary heart disease［J］.Journal of Molecular and Cellular Cardiology，2019，136：27-41.

［21］胡珍珍.miR-92a-3p在乙醇誘導的H9c2心肌細胞凋亡中的作用及機制研究［D］.濟南：山東大學，2022.

［22］WILLIS S，DAY C L，HINDS M G，et al.The Bcl-2-regulated apoptotic pathway［J］.Journal of Cell Science，200 116（20）：4053-4056.

［23］劉嘉爍，彭燦，湯少勛，等.橙皮苷調控Bcl-2/Bax-Caspase3通路阻抑H2O2誘導的奶牛乳腺上皮細胞凋亡［J/OL］.南方農業學報：1-11［2023-08-07］.http：//kns.cnki.net/kcms/detail/45.1381.S.20230313.1018.006.htm.

［24］高賽紅，張小良，楊迎春，等.高脂血癥大鼠腦缺血/再灌注后p38 MAPK活化及對Bax和Bcl-2表達的影響［J］.解剖學報，202 54（1）：50-55.

［25］張立坤，邵東風，王東海，等.綠原酸通過Bax/Bcl-2/Caspase-3信號通路對喉癌Hep-2細胞增殖、凋亡的影響［J］.中國醫院用藥評價與分析，202 22（10）：1206-1210.

（收稿日期：2023-05-06）

（本文編輯鄒麗）

基金項目 國家自然科學基金資助項目（No.81973836）；中國中醫科學院科技創新工程重大攻關項目（No.CI2021A00902）；首都衛生發展科研專項（No.2020-1-4151）

通訊作者 李軍，E-mail：gamyylj@163.com

引用信息 解紫從，劉詠梅，陳恒文，等.基于miR-126-5p/Bcl-2/mPTP通路探究穩心湯對缺氧/復氧誘導H9c2心肌細胞損傷修復的作用機制［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，202 21（15）：2754-2765.