脂蛋白相關性磷脂酶A2促進血管平滑肌細胞泡沫化機制的研究

摘要 目的：探究脂蛋白相關性磷脂酶A2（LP-PLA2）在氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）作用下的血管平滑肌細胞（VSMC）泡沫化中的作用及其相關分子途徑。方法：采用組織塊貼壁法分離小鼠原代主動脈VSMC，α-肌動蛋白（α-SAM）標記的免疫熒光染色進行鑒定；采用脂質體轉染技術將過表達LP-PLA2質粒（oe-LP-PLA2）與陰性對照質粒（oe-NC）轉染入細胞中，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）與蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測轉染后細胞中LP-PLA2 mRNA和蛋白表達水平；采用ox-LDL和大胞飲抑制劑LY294002處理VSMC，并將細胞分為4組，正常培養的control組，ox-LDL處理的轉染oe-LP-PLA2細胞的ox-LDL＋oe-LP-PLA2組、ox-LDL＋oe-NC組、聯合使用ox-LDL和LY294002處理的轉染oe-LP-PLA2細胞的ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組。油紅O染色檢測各組VSMC中脂質聚積水平，試劑盒檢測細胞內總膽固醇含量，酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測各組細胞上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和單核細胞趨化因子-1（MCP-1）的表達水平，DCFH-DA法檢測各組VSMC細胞中活性氧（ROS）含量，Western Blot檢測各組細胞中LP-PLA2和泡沫化信號通路中固醇?；D移酶1（ACATl）、細胞外信號調節蛋白激酶1/2（ERK1/2）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）/應激活化蛋白激酶（SAPK）蛋白的表達水平。結果：成功分離了原代VSMC，且α-SAM標記的陽性細胞比率達95%以上；與control組比較，轉染oe-LP-PLA2質粒后細胞中LP-PLA2 mRNA和蛋白表達水平均升高（P＜0.01）；與control組比較，ox-LDL＋oe-NC組、ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組細胞的油紅O染色陽性面積、細胞中總膽固醇含量、細胞上清液中TNF-α、IL-6、MCP-1的表達水平和細胞中活性氧含量均增加（P＜0.05或P＜0.01）；與ox-LDL＋oe-NC組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2組油紅O染色陽性面積、細胞中總膽固醇含量、細胞上清液中TNF-α、IL-6、MCP-1的表達水平和細胞中活性氧含量均增加（P＜0.05）；與ox-LDL＋oe-LP-PLA2組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組中上述檢測指標均降低（P＜0.05）；Western Blot檢測結果顯示，與control組比較，ox-LDL＋oe-NC組、ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組中LP-PLA2、ACATl、ERK1/2和JNK/SAPK蛋白表達均升高（P＜0.05或P＜0.01）；與ox-LDL＋oe-NC組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2組LP-PLA2、ACATl、ERK1/2、JNK/SAPK蛋白表達水平升高（P＜0.05），ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組中除LP-PLA2升高外（P＜0.05），其他蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與ox-LDL＋oe-LP-PLA2組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組細胞中ACATl、ERK1/2、JNK/SAPK蛋白表達水平均降低（P＜0.05）。結論：上調LP-PLA2表達可通過大胞飲機制促進ox-LDL作用下的VSMC的泡沫化進程，而這可能與ERK和JNK/SAPK通路的表達上調有關。

關鍵詞 脂蛋白相關性磷脂酶；血管平滑肌細胞；泡沫細胞；氧化型低密度脂蛋白；大胞飲；小鼠；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.15.012

動脈粥樣硬化是導致包括冠狀動脈阻塞在內的多種心血管疾病的主要病因［1］。在動脈粥樣硬化過程中，泡沫細胞在內皮下的不斷形成與累積及其壞死所引發的炎癥反應，加劇了斑塊的不穩定性，從而誘導冠狀動脈阻塞，導致急性心肌梗死等心血管疾病的發生［2］。既往研究表明，巨噬細胞是泡沫細胞的主要來源，但越來越多的數據表明，特定環境下發生表型改變的血管平滑細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）不僅具有巨噬細胞的特征，同時也能在細胞內積聚膽固醇，且在中晚期的動脈硬化中，VSMC是斑塊

中泡沫細胞和炎癥反應的主要來源［3］。這提示在動脈粥樣硬化中，VSMC同樣具有泡沫樣變的能力。盡管一些清道夫受體參與了泡沫細胞形成過程中的脂質攝取，但導致VSMC發生泡沫化的具體機制尚未明確。脂蛋白相關性磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A LP-PLA2）又稱血小板活化因子乙酰水解酶，其主要來源于巨噬細胞、單核細胞、泡沫細胞等炎性細胞的分泌［4］。LP-PLA2可與低密度脂蛋白（LDL）結合，促進動脈粥樣硬化的炎癥反應與氧化應激，并導致內皮細胞的結構與功能破壞，加速斑塊的形成與發展［5］。然而，關于LP-PLA2是否參與VSMC泡沫樣變及其具體作用尚未明確。因此，本研究通過探討LP-PLA2在VSMC泡沫化中的作用，旨在進一步揭示動脈粥樣硬化的發生機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

無特定病原體（SPF）級雄性4周齡C57BL/6小鼠6只，體質量（16.0±1.5）g，購自海南藥物研究所有限責任公司。大鼠抗小鼠α-SAM抗體（美國Abacm公司）；FITC標記的山羊抗兔二抗（美國BD公司）；過表達LP-PLA2質粒（oe-LP-PLA2）與陰性對照質粒（oe-NC）（廣州銳博生物公司）；大胞飲抑制劑LY294002、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）、DCFH-DA試劑盒、膽固醇檢測量試劑盒（美國Sigma公司）；Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（美國Applied Biosystems公司）；TRIzol試劑、反轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）；Lipofectamine 2000試劑（美國Thermo公司）；二喹啉甲酸法（BCA）蛋白定量試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和單核細胞趨化因子-1（monocyte chemoattractant protrin- MCP-1）表達的酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（江蘇碧云天生物技術公司）；大鼠抗LP-PLA2、固醇酰基轉移酶1（cholesterol acyltransferases ACATl）、細胞外信號調節蛋白激酶1/2（extracellular-signal regulated kinase1/ ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，JNK）/應激活化蛋白激酶（stress activated protein kinase，SAPK）和β-actin抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；辣根過氧化物酶標記的兔抗大鼠二抗（美國Jackson ImmunoResearch公司）；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）引物設計與合成（上海生工生物工程有限公司）。細胞培養箱（MCO-175型，日本三洋公司）；紫外分光光度計（Du-640型，美國Beckman公司）；熒光顯微鏡（DM IL LED型，德國Lecia公司）。

1.2 小鼠原代主動脈VSMC的培養和鑒定

參考文獻［6］方法分離培養小鼠原代主動脈VSMC。解剖小鼠主動脈，并除去外膜和內皮組織，將血管中膜剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，并置入培養瓶中使用含20%FBS和1%青鏈霉素-抗真菌劑的DMEM/F12培養基，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。培養至5～7 d時組織塊邊緣可見有VSMC爬出，10 d時VSMC可融合生長。使用含EDTA的0.25%胰蛋白酶進行常規消化并傳代進行擴大培養，取傳至3代以后的VSMC進行后續相關實驗。采用針對平滑肌的特異性抗體α-SAM進行鑒定VSMC。取生長良好的VSMC，常規消化后接種于載玻片上，37 ℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞貼壁后，棄原培養液，4%多聚甲醛溶液固定細胞，Triton X-100破膜，加入α-SAM抗體（1∶200），4 ℃下孵育過夜，次日加入FITC標記的熒光二抗（1∶500），室溫下避光孵育1 h，加入DAPI試劑進行染核，最后加入防熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 細胞轉染和分組

取生長狀態良好的VSMC，常規消化后，調整細胞密度，按2×105個/孔接種于6孔板中，待細胞生長融合至70%時，按轉染試劑Lipofectamine 2000操作說明書方法將oe-LP-PLA2質粒及陰性對照質粒oe-NC轉染入VSMC中。取轉染48 h的細胞，用于后續實驗。取轉染后的細胞，按處理方式的不同將VSMC分為4組：正常培養的control組，采用100 μg/mL ox-LDL處理的轉染oe-LP-PLA2的ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-NC組，聯合使用100 μg/mL ox-LDL與33μmol/L LY294002處理的轉染oe-LP-PLA2的x-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組。ox-LDL與LY294002的使用濃度參考文獻［7-8］。上述各組細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h后用于后續實驗檢測。

1.4 油紅O染色

取各組VSMC，棄原培養液，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）充分洗滌細胞后采用4%多聚甲醛于室溫下固定30 min，PBS再次洗滌，加入油紅O工作液在室溫下進行染色30 min，蒸餾水洗滌細胞，隨后在倒置顯微鏡下觀察，每組至少隨機選取5個低倍率視野進行拍照。Image J軟件對細胞中的紅色脂滴面積進行計算分析。

1.5 細胞內總膽固醇的測定

取各組VSMC，按試劑盒操作說明書方法采用異丙醇提取細胞內脂質成分，并使用耦合酶測定法測定細胞內總膽固醇（total cholesterol，TC）含量。實驗單獨重復3次。

1.6 ELISA檢測炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1含量

取各組VSMC上清液，4 ℃下1 000 r/min離心10 min后，按照ELISA試劑盒使用說明書方法檢測上清液中TNF-α、IL-6和MCP-1含量。實驗單獨重復3次。

1.7 DCFH-DA法檢測活性氧（ROS）水平

取各組VSMC，使用DCFH-DA法檢測細胞中ROS含量。根據DCFH-DA試劑盒說明書方法，加入含10 mmol/L的DCFH-DA工作液在37 ℃下避光孵育30 min后，PBS溶液充分洗滌細胞后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強度。

1.8 RT-PCR檢測細胞中LP-PLA2 mRNA表達水平

用TRIzol試劑提取待測細胞中的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書方法進行合成cDNA。使用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒在StepOne系統進行RT-PCR。LP-PLA2引物序列，正向引物：5′-CGGATTGATGAGATGCCTGA-3′，反向引物：5′-CTTGTTGGGCTTGCCAAACT-3′；β-actin-引物序列，正向引物：5′-TCCTGTGGCATCCACGAAACT- 反向引物：5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。以β-actin為內參基因，采用2－△△Ct方法分析LP-PLA2 mRNA的相對表達水平，并將其與對照組進行標準化處理。實驗單獨重復3次。

1.9 蛋白質免疫印跡法（Western Blot）檢測細胞中泡沫化信號通路相關蛋白的表達

采用細胞裂解液在冰上裂解待測細胞，離心后收集總蛋白。用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品置于15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，并轉移到聚偏氟乙烯膜上。膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后加入一抗：LP-PLA2（1∶500）、ACATl（1∶800）、ERK1/2（1∶800）、JNK/SAPK（1∶800）和β-actin（1∶1 000），4 ℃下孵育過夜，在三乙醇胺緩沖鹽溶液（TBS）中洗滌后，在室溫下與辣根過氧化物酶偶聯的二抗（1∶5 000）孵育2 h。最后，在Tanon-5500化學發光成像系統中進行蛋白條帶灰度成像并拍照，應用Image J軟件進行定量。以β-actin為內參，分析目的蛋白表達水平。實驗單獨重復3次。

1.10 統計學處理

采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 6.0軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 原代VSMC的鑒定

光鏡觀察結果顯示，采用組織塊貼壁法培養至5～7 d時可見有VSMC從組織塊邊緣爬出，10 d左右時VSMC可融合生長，呈多角形、梭形或不規則形（見圖1）。免疫熒光染色結果表明，VSMC顯示出α-SAM標記的綠色熒光，且陽性細胞比例達95%以上（見圖2）。上述結果提示，本實驗分離培養的細胞為VSMC，且純度可滿足后續實驗要求。

2.2 轉染后VSMC中LP-PLA2的表達

RT-PCR與Western Blot法檢測轉染后VSMC中LP-PLA2 mRNA和蛋白表達的結果顯示，與control組比較，轉染oe-LP-PLA2質粒后細胞中LP-PLA2 mRNA和蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.01），而轉染oe-NC的細胞中無明顯變化（P＞0.05）。詳見圖3～圖5。

2.3 過表達LP-PLA2對VSMC源性泡沫細胞形成的影響

油紅O染色結果顯示，細胞形態增大變圓，胞核突出，胞質內出現大量紅色脂滴，并呈“戒環”狀聚集在細胞周邊，符合VSMC泡沫樣變。與control組比較，ox-LDL＋oe-NC組、ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組細胞的油紅O陽性面積明顯增加（P＜0.01）；與ox-LDL＋oe-NC組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2組油紅O陽性面積明顯增加（P＜0.05）；與ox-LDL＋oe-LP-PLA2組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組油紅O陽性面積明顯減少（P＜0.05）。詳見圖6、圖7。

細胞內總膽固醇含量測定結果表明，與control組比較，ox-LDL＋oe-NC組、ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組VSMC中總膽固醇含量升高（P＜0.01）；與ox-LDL＋oe-NC組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2組總膽固醇含量升高（P＜0.05），但ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組無改變（P＞0.05）；與ox-LDL＋oe-LP-PLA2組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組VSMC中總膽固醇含量降低（P＜0.05）。詳見圖8。

2.4 過表達LP-PLA2對VSMC源性泡沫細胞炎癥與氧化應激的影響

ELISA檢測結果顯示，與control組比較，ox-LDL＋oe-NC組、ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組上清液中TNF-α、IL-6、MCP-1含量升高（P＜0.05或P＜0.01）；與ox-LDL＋oe-NC組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2組TNF-α、IL-6、MCP-1含量升高（P＜0.05）；與ox-LDL＋oe-LP-PLA2組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組中TNF-α、IL-6、MCP-1含量降低（P＜0.05）。詳見表1。

DCFH-DA法檢測各組VSMC源性泡沫細胞中ROS水平的結果顯示，與control組比較，ox-LDL＋oe-NC組、ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組細胞中ROS表達水平升高（P＜0.01）；與ox-LDL＋oe-NC組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2組ROS表達升高（P＜0.05）；與ox-LDL＋oe-LP-PLA2組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組細胞中ROS表達降低（P＜0.05）。詳見圖9、圖10。

2.5 過表達LP-PLA2對VSMC源性泡沫化信號通路的影響

Western Blot檢測結果顯示，與control組比較，ox-LDL＋oe-NC組、ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組VSMC源性泡沫細胞中LP-PLA2和泡沫化信號通路中ACATl、ERK1/2、JNK/SAPK蛋白表達均升高（P＜0.05或P＜0.01）；與ox-LDL＋oe-NC組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2組LP-PLA2、ACATl、ERK1/2、JNK/SAPK蛋白表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01），ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組中除LP-PLA2升高外（P＜0.05），其他蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與ox-LDL＋oe-LP-PLA2組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組細胞中ACATl、ERK1/2、JNK/SAPK蛋白表達水平均降低（P＜0.05），而LP-PLA2蛋白表達水平無統計學差異（P＞0.05）。詳見圖11、圖12。

3 討 論

研究表明，靶向VSMC的泡沫化進程可能是緩解動脈粥樣硬化的關鍵策略［9］。本研究結果表明，上調VSMC中LP-PLA2表達可通過大胞飲機制和ERK1/2、JNK/SAPK途徑促進ox-LDL作用下的細胞中脂質累積與炎性因子和ROS的產生，從而加速誘導VSMC的泡沫化轉變。

在動脈粥樣硬化形成過程中，多種炎性細胞可分泌LP-PLA 如單核細胞、巨噬細胞、泡沫細胞等［5，10］。同時，單核細胞成熟為巨噬細胞也伴隨著LP-PLA2 mRNA和蛋白水平的明顯增加，且在用ox-LDL處理巨噬細胞以誘導其泡沫化過程中，LP-PLA2表達水平也呈現出明顯的升高趨勢［11］，這與在臨床中動脈粥樣硬化斑塊中觀察到的結果一致［12］，均表明LP-PLA2是巨噬細胞發生泡沫化的關鍵因子。而在VSMC來源的泡沫化細胞中，LP-PLA2的具體作用尚不明確。細胞中脂質積累和炎癥反應及氧化應激是VSMC發生泡沫化最為明顯的、相互關聯的病理變化［13］。而ox-LDL作為內源性脂質配體的主要成分，其可導致內皮細胞損傷，并積聚在巨噬細胞和VSMC中，可進一步誘導細胞炎癥反應的發生［14］。研究顯示，LP-PLA2參與ox-LDL誘導的炎癥反應和ROS生成［15］。本課題組通過ox-LDL處理原代分離的小鼠VSMC發現，細胞中脂質累積和促炎因子TNF-α、IL-6、MCP-1和ROS的表達水平均明顯升高，而上調VSMC中LP-PLA2表達則明顯促進了上述現象的發生。表明VSMC泡沫化進程中LP-PLA2同樣具有重要作用。TNF-α和IL-6作為炎癥性標志物，其在動脈粥樣硬化中能夠介導內皮細胞損傷，參與凝血功能障礙與炎癥級聯反應的放大，并影響粥樣斑塊的穩定性［16］。而MCP-1是一種在動脈粥樣斑塊中發現的，可被單核細胞、VSMC和內皮細胞等多種細胞表達的一種C-C型促炎趨化因子［17］。研究發現，MCP-1不僅能促進內皮細胞與單核細胞之間的黏附，還能促進VSMC的增殖，使其由收縮型轉變為合成型，而后者可大量攝取ox-LDL并發生泡沫化［18］。同時，發生泡沫樣變的VSMC對MCP的分泌能力也明顯增強，這與在人類動脈粥樣硬化中發現的VSMC高表達MCP-1的現象一致［17-18］。此外，促炎因子TNF-α、IL-6等還能直接激活與內皮細胞膜結合的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶，進而催化產生ROS，作為信號分子調節血管與細胞內黏附分子基因的轉錄與表達，從而加速動脈粥樣硬化的形成與發展［19］。

大胞飲是一種可無需肌動蛋白參與的細胞外物質進入胞內的途徑之一，其與細胞的免疫反應，營養物質的攝取和粥樣硬化中細胞的泡沫樣變等多種生理及病理學改變均密切相關［20-21］。在巨噬細胞來源的泡沫細胞中，Anzinger等［22］研究表明，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子誘導的小鼠巨噬細胞可通過大胞飲機制攝取LDL，使其發生泡沫化，并促進主動脈的脂質積聚。而對于VSMC的泡沫化進程，陳雪等［23］研究表明，炎癥可誘導VSMC通過大胞飲機制來攝取天然低密度脂蛋白，從而增加細胞內脂質的聚集，促進細胞的泡沫化形成。本研究在上述研究的基礎上，通過應用胞飲抑制劑LY294002測試，結果表明阻滯VSMC的胞飲途徑可降低過表達LP-PLA2所促進的VSMC的泡沫化進程。提示大胞飲機制可能是LP-PLA2促進VSMC發生泡沫化的重要途徑。ACATl是細胞內催化游離膽固醇和脂肪酸合成膽固醇酯的關鍵酶，其在細胞發生泡沫化進程中具有重要作用［24］。而抑制ACATl在一定程度上可改善動脈粥樣硬化的發展［25］。ERK和JNK/SAPK作為絲裂素活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路的兩條重要途徑，均參與了動脈粥樣硬化的病理過程［26］。研究表明，ox-LDL所致的內皮細胞功能紊亂、VSMC的增殖與遷移及其與巨噬細胞中脂質代謝穩態的失衡等都與ERK和JNK/SAPK途徑有關［26-27］。本研究結果表明，上調VSMC中LP-PLA2表達水平可促進ox-LDL刺激作用下的細胞中ERK和JNK/SAPK通路，而大胞飲抑制劑則能削弱LP-PLA2對ERK和JNK/SAPK蛋白表達水平的促進作用。

4 小 結

綜上所述，本實驗結果表明，上調LP-PLA2表達可通過大胞飲機制促進ox-LDL作用下的VSMC的泡沫化進程，而這可能與ERK和JNK/SAPK通路的表達上調有關。本研究進一步補充了VSMC發生泡沫化的相關機制，有望LP-PLA2成為今后預防和治療動脈粥樣硬化思路與策略的研究靶點提供新的思路與策略。

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（收稿日期：2022-07-28）

（本文編輯鄒麗）

基金項目 海南省衛生健康行業科研項目（No.20A200521）

通訊作者 林莉，E-mail：linli66718458@126.com

引用信息 梁榮珍，王太成，林德文，等.脂蛋白相關性磷脂酶A2促進血管平滑肌細胞泡沫化機制的研究［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，202 21（15）：2777-2784.