高膽紅素血癥新生大鼠腦組織凋亡誘導因子、細胞色素C表達的實驗研究

摘要 目的：探討高膽紅素血癥新生大鼠腦組織凋亡誘導因子（AIF）、細胞色素C（Cty-C）表達的實驗研究。方法：將120只清潔級7 d齡SD大鼠隨機分為對照組、模型組、Z-VAD-FMK干預組，每組40只，3組分別于造模后6、24、48、72、96 h斷頭取腦組織，每時間點取8只。模型組制備采用膽紅素腹腔注射法（100 μg/g）。Z-VAD-FMK干預組在模型組基礎上即刻腹腔注射Z-VAD-FMK 3 μg/g（處死前每日1次）。分別應用原位缺口末端標記法（TUNEL）、免疫組化法測定腦組織海馬（CA1）區不同時間點細胞凋亡和Cty-C和AIF表達情況。結果：模型組、Z-VAD-FMK干預組海馬區腦組織6 h開始出現細胞凋亡和Cty-C、AIF表達，模型組、Z-VAD-FMK干預組6 h細胞凋亡指數分別為17.7±2.4、12.9±1. Cty-C陽性細胞平均灰度值分別為140.5±11.3、142.9±13. AIF陽性細胞平均灰度值分別為169.5±11.9、170.7±10.0；隨時間延長，細胞凋亡及Cty-C、AIF表達逐漸增多，96 h達高峰，模型組、Z-VAD-FMK干預組96 h細胞凋亡指數分別為38.0±6.0、33.6±3.8，Cty-C陽性細胞平均灰度值分別為109.6±8.0、127.3±9.8；AIF陽性細胞平均灰度值分別為139.7±9.4、141.0±7.1；對照組各時間點海馬區腦組織未見明顯細胞凋亡和Cty-C、AIF表達。結論：高膽紅素血癥所致腦損傷機制與線粒體損傷Cty-C、AIF表達增多有關，且非Caspase依賴性細胞凋亡也在一定程度上參與了此進程。

關鍵詞 高膽紅素血癥；腦組織；細胞色素C；凋亡誘導因子；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.15.013

Experimental Study on Expression of Apoptosis-inducing Factor and Cytochrome C in Brain Tissue of Neonatal Rats with Hyperbilirubinemia

BAI Dan， YIN Huaiqing， WU Shirun， YIN Chongjuan， LIANG Gang， LI Guojing

First Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 03000 Shanxi， China

Corresponding Author YIN Huaiqing， E-mail： yhq0351@163.com

Abstract Objective：To investigate experimental study on expression of apoptosis-inducing factor（AIF） and cytochrome C（Cty-C） in brain tissue of neonatal rats with hyperbilirubinemia.Methods：A total of 120 clean SD rats aged 7 days were randomly divided into control group，model group，and Z-VAD-FMK intervention group.Brain tissue was extracted from the three groups at 6，24，48，7 and 96 h after modeling.The model group was prepared by intraperitoneal injection of bilirubin（100 μg/g）.The Z-VAD-FMK intervention group was immediately intraperitoneally injected with Z-VAD-FMK 3 μg/g on the basis of the model group（once a day before death）.Apoptosis and the expression of Cty-C and AIF in hippocampus（CA1） were measured by in situ notch end labeling（TUNEL） and immunohistochemistry at different time points.Results：Apoptosis and Cty-C and AIF expression began to appear in hippocampus brain tissue of model group and Z-VAD-FMK intervention group at 6 h.The apoptotic indices of the model group and Z-VAD-FMK intervention group at 6 h were （17.7±2.4） and （12.9±1.1），respectively.The average gray values of Cty-C positive cells were （140.5±11.3） and （142.9±13.1），and the average gray values of AIF positive cells were （169.5±11.9） and （170.7±10.0），respectively.Apoptosis and expressions of Cty-C and AIF gradually increased with time，and reached the peak at 96 h.The apoptotic indices of the model group and Z-VAD-FMK intervention group at 96 h were （38.0±6.0） and （33.6±3.8），respectively.The average gray values of Cty-C positive cells were （109.6±8.0） and （127.3±9.8），respectively.The average gray values of AIF positive cells were （139.7±9.4） and （141.0±7.1），respectively.There were no obvious apoptosis and Cty-C and AIF expression in hippocampal brain tissue of control group at all time points.Conclusion：The mechanism of brain injury induced by hyperbilirubinemia is related to the increased expression of Cty-C and AIF in mitochondrial injury.Non-Caspase-dependent apoptosis also participated in this process with certain exten.

Keywords hyperbilirubinemia; brain tissue; cytochrome C; apoptosis-inducing factor; experimental study

高膽紅素血癥是新生兒期的常見疾病，嚴重者可因游離膽紅素過多透過血腦屏障并沉積于基底神經核、丘腦等部位造成嚴重腦損傷，即膽紅素腦病［1］，嚴重影響患兒生活質量。因此，研究高膽紅素血癥腦損傷可能的發病機制，進而尋找有效的干預措施具有重要意義。以往針對膽紅素導致腦組織損傷的研究多集中在Caspase依賴性細胞凋亡途徑。前期研究結果顯示，高膽紅素血癥腦損傷機制與腦細胞凋亡（促凋亡蛋白Bax及抑凋亡蛋白Bcl-2的表達）有關［2-3］。最近的研究認為，機體還有Caspase非依賴性的細胞死亡途徑，包括線粒體途徑、蛋白酶體的降解及細胞的自噬作用，而線粒體途徑是其中較為重要的途徑［4-6］。細胞損傷后線粒體膜的通透性發生改變，從而導致細胞死亡相關蛋白細胞色素C（Cty-C）和凋亡誘導因子（AIF），從線粒體釋放入細胞質中，其再分別觸發Caspase依賴性和Caspase非依賴性的細胞凋亡途徑［7］。膽紅素致腦組織損傷過程是否有Caspase非依賴性細胞凋亡參與，尤其是在新生大鼠高膽紅素血癥時AIF是否參與了腦損傷的過程，具體機制目前仍不清楚。Z-VAD-FMK是一種不可逆的廣譜Caspase抑制劑，可以穿透細胞膜進而抑制Caspase依賴性的細胞凋亡，所以常用于觀察組織細胞凋亡是否由Caspase激活來介導。本研究通過觀察新生大鼠高膽紅素血癥以及Z-VAD-FMK干預后，海馬區腦組織細胞凋亡和AIF、Cty-C表達情況，探討線粒體損傷在高膽紅素血癥腦損傷中的作用，從而為臨床治療新生兒高膽紅素血癥提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

選擇清潔級7 d齡健康SD新生大鼠120只，體質量13～19 g，雌雄不限，反應良好，購自山西醫科大學生理實驗室，動物許可證號：SYXK（晉）2018-001。

1.1.2 實驗儀器

高速離心機、電子秤、移液槍、自動脫水機、智能漂片器、－20 ℃冰箱、切片機、高速攪拌器、石蠟包埋機、奧林巴斯顯微鏡、電控恒溫干燥箱等。

1.1.3 主要試劑

膽紅素（MCE）、Z-VAD-FMK（MCE）、兔抗大鼠Cty-C抗體（博士德）、兔抗大鼠AIF抗體（博士德）、鏈霉親和素-生物素復合物（SABC）免疫組化試劑盒（博士德）、生物素化羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）抗體（博士德），二氨基聯苯胺（DAB）、二甲基亞砜（DMSO）、顯色試劑、PGE400、吐溫-80、原位缺口末端標記法（TUNEL）檢測試劑盒（博士德）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組

將7 d齡SD大鼠120只，隨機分為對照組、模型組、Z-VAD-FMK干預組，每組40只。根據處死時間不同，每組再隨機分成5個亞組：6 h組、24 h組、48 h組、72 h組、96 h組，每組8只。

1.2.2 膽紅素溶液的配制

參考陳舜年等［8］方法配制膽紅素溶液，稱取膽紅素溶于氫氧化鈉（0.5 mol/L）溶液中，每10 mg膽紅素溶于氫氧化鈉10 mL，全程注意避光。

1.2.3 干預劑配制及注射方法

Z-VAD-FMK制劑稀釋方法：取15 μL的澄清DMSO貯備液加入60 μL的PEG300中，混合均勻；向上述體系中加入7.5 μL的吐溫-80，混合均勻；然后繼續加入67.5 μL生理鹽水定容至150 μL。

1.2.4 動物模型制備方法

模型組腹腔注射膽紅素溶液每次100 μg/g［9］；Z-VAD-FMK干預組在高膽模型建立后即刻腹腔注射 Z-VAD-FMK 3 μg/g，處死前每日1次；對照組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水1次。3組新生大鼠均在注射完畢后回到原飼養環境中繼續由母鼠喂養。

1.2.5 大鼠腦組織提取及標本制備

各組大鼠依據不同時間點麻醉（吸入乙醚）后開胸暴露心臟，立即剪斷頸外靜脈，并將生理鹽水注入左心室至流出液轉為清亮，注入10%多聚甲醛后取腦，再將腦組織從視交叉及其后5 mm處做冠狀切口（大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm），最后置于10%多聚甲醛中固定。標本經常規脫水、石蠟包埋、連續冠狀切片（厚度4 μm）。

1.2.6 大鼠腦組織病理觀察

各組大鼠海馬區腦組織切片經蘇木精-伊紅（HE）染色、封片，用光學顯微鏡觀察其病理學改變。

1.2.7 免疫組化法測定大鼠海馬（CA1）區腦組織Cty-C及AIF

海馬CA1區腦組織切片按SABC免疫組化試劑盒要求逐步操作，最后光鏡下觀察陽性細胞表達。陰性對照切片使用代替一抗的5%磷酸緩沖鹽溶液（PBS），其余操作步驟按照SABC免疫組化試劑盒要求逐步操作。

1.2.8 TUNEL檢測細胞凋亡

將制備好的各組大鼠海馬區腦組織切片按TUNEL試劑盒驟步說明逐步操作。光鏡下找凋亡細胞（凋亡后細胞核呈黃棕褐色），高倍鏡下（400×）隨機選取5個視野，計算凋亡指數（apoptosisindex，AI）＝陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.2.9 圖像分析

在相同放大倍數（10×40）和同樣光強度下進行圖像采集，用Image Pro Plus 6.0軟件統計陽性細胞平均灰度值。平均灰度值越高表明陽性表達越弱，反之亦然。

1.3 統計學處理

應用SPSS 25.0統計軟件處理。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠異常行為改變情況

實驗前所有新生大鼠健康狀態均良好，造模至實驗結束未見新生大鼠死亡；造模后6～48 h模型組、Z-VAD-FMK干預組新生大鼠開始出現反應遲鈍、活動減少，很少發生翻滾、震顫，無抽搐發生；造模后72、96 h，模型組新生大鼠反應遲鈍明顯加重、翻滾動作，震顫次數明顯增加，抽搐表現明顯，Z-VAD-FMK干預組各時間點異常行為少于同時間點模型組；對照組大鼠未見明顯異常。

2.2 各組腦組織損傷情況

模型組新生大鼠6 h腦組織出現輕度水腫，隨時間延長腦組織損傷逐漸加重，24～48 h水腫明顯并可見不同程度腦組織萎縮，72 h出現液化壞死，96 h液化壞死進一步加重。與模型組比較，Z-VAD-FMK干預組各時間點腦組織損傷程度均有所減輕，72、96 h未見明顯液化及壞死；對照組各時間點腦組織未見明顯異常。

2.3 各組大鼠海馬區腦組織病理損傷程度比較

模型組、Z-VAD-FMK干預組大鼠腦組織均出現不同程度的神經細胞水腫、變性、壞死，核固縮和核碎裂出現在病灶中心；與模型組比較，Z-VAD-FMK干預組各時間點腦組織病理損傷程度有所減輕；對照組各時間點腦組織病理未見明顯異常。

2.4 各組海馬區腦組織Cty-C表達比較

造模后6 h，模型組、Z-VAD-FMK干預組大鼠海馬（CA1）區腦組織均出現Cty-C表達，隨時間延長Cty-C表達逐漸增多，造模后96 h達到高峰；24、48、72、96 h，Z-VAD-FMK干預組海馬區腦組織Cty-C表達低于模型組（P＜0.05）；對照組各時間點海馬區腦組織未見或僅有少量Cty-C表達。詳見圖1、表1。

2.5 各組海馬區腦組織AIF表達

造模后6 h，模型組、Z-VAD-FMK干預組大鼠海馬（CA1）區腦組織均出現AIF表達，隨時間延長AIF表達逐漸增多，造模后96 h達到高峰；Z-VAD-FMK干預組各時間點AIF表達與模型組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；對照組各時間點腦組織海馬區未見或僅有少量AIF表達。詳見圖2、表2。

2.6 各組不同時間海馬區腦組織神經細胞凋亡指數比較

造模后6 h，模型組、Z-VAD-FMK干預組大鼠海馬（CA1）區腦組織開始出現細胞凋亡，隨時間延長細胞凋亡數逐漸增多，于96 h達到高峰；與模型組比較，Z-VAD-FMK干預組各時間點海馬區腦組織神經細胞凋亡指數均低于模型組（P＜0.05）；各時間點對照組海馬區腦組織均未見或僅有少量凋亡細胞。詳見圖3、表3。

3 討 論

高膽紅素血癥是新生兒期的常見疾病，其發生率為37.6%［10］。由于間接膽紅素的神經毒性作用，嚴重者可表現出不同的神經功能障礙［11-12］。 目前，膽紅素所致腦損傷機制仍不十分清楚，有研究認為與神經細胞凋亡密切相關。細胞凋亡是機體在正常的生長發育、細胞分化和病理狀態中，細胞受到內外刺激后發生的自主性自殺過程［13］。目前，研究者認為Caspases是介導細胞凋亡的主要酶類［14］。然而，最近的研究認為，機體還有Caspase 非依賴性的細胞死亡途徑，其中線粒體途徑是其中較為重要的途徑［4-6］。

線粒體是細胞凋亡調控的關鍵原件［15］，線粒體膜通透性改變是凋亡最主要的標志之一。Rodrigues等［16］通過體外細胞培養發現，未結合膽紅素的細胞毒性作用是通過改變線粒體膜的通透性，進而釋放Cty-C，并作用于半胱氨酸水解酶，最終導致神經細胞凋亡。Wang等［17］研究認為，Caspase-9和AIF在成肌細胞的拉伸誘導細胞凋亡中起重要作用，并且AIF誘導細胞凋亡的方式與Caspase-9無關。Yang等［18］研究表明，在X射線誘導的乳腺癌細胞死亡中，AIF以不依賴于Caspase的方式誘導了細胞凋亡。Ding等［19］研究認為，在谷氨酸引起的神經細胞凋亡中，AIF的上調起到了非常重要的作用。

本研究結果顯示，模型組、Z-VAD-FMK干預組于造模后6 h腦組織海馬區出現細胞凋亡和Cty-C、AIF表達，隨時間延長細胞凋亡和Cty-C、AIF表達逐漸增多，均于96 h達到高峰；各時間點對照組海馬區腦組織均未見明顯細胞凋亡和Cty-C、AIF表達；Z-VAD-FMK干預組海馬區腦組織Cty-C表達低于模型組，而Z-VAD-FMK干預組各時間點AIF表達與模型組比較差異無統計學意義，凋亡細胞的出現和Cty-C、AIF表達趨勢基本一致，一定程度上說明了細胞凋亡參與了高膽紅素血癥腦損傷的進程，且高膽紅素血癥時線粒體損傷Cty-C、AIF表達在一定程度上引起了腦細胞凋亡；非Caspase依賴的細胞凋亡途徑也在一定程度上參與了高膽紅素血癥腦損傷的進程。

4 小 結

綜上所述，本實驗一定程度上說明了細胞凋亡參與了高膽紅素血癥腦損傷的進程，其機制與線粒體損傷Cty-C、AIF表達增多有關，且非Caspase依賴的細胞凋亡途徑也在一定程度上參與了高膽紅素血癥腦損傷的進程。

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（收稿日期：2023-01-23）

（本文編輯郭懷印）

基金項目 山西省衛生健康委員會科研課題（No.2022007）

通訊作者 陰懷清，E-mail：yhq0351@163.com

引用信息 白丹，陰懷清，武師潤，等.高膽紅素血癥新生大鼠腦組織凋亡誘導因子、細胞色素C表達的實驗研究［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，202 21（15）：2785-2789.