關于牛結核病診斷方法及在疫病凈化中的應用

牛結核分歧桿菌的宿主范圍十分廣泛，感染基數相對較大，并且發病數量相對較少，給該種疾病的防控和凈化工作造成了很大難題。對此就需要對牛結核病的發生流行現狀進行進一步的調查和分析，然后明確結核病的診斷方法，并注重做好疫病的有效凈化處理，確保早發現早處理，在短時間內控制病情。本文主要結合實際工作經驗，首先就青海省互助縣牛結核病的防治現狀，然后探討了一種牛結核病的診斷方法，并明確了該種方法在疫病凈化中的具體應用，分析了牛結核病的防治方法和病死動物的無害化處理措施，希望對廣大同行有所幫助。

一、互助縣牛結核病的防治現狀

牛結核病是由牛結核分枝桿菌引起的一種人畜共患的慢性傳染病。近年來，人結核病陽性檢出率逐年上升，世界衛生組織在1993年4月宣布全球結核病緊急狀態，1998年又重申“遏制結核病的行動刻不容緩，并將每年3月24日定為世界防治結核病日。據報道，約有10.6%的人結核是由牛分枝桿菌引起的，牛結核病中的7%是由人結核桿菌引起。2002年至2020年互助縣共監測奶牛52761頭，監測出陽性404頭，陽性率0.77%，奶牛結核病依然威脅著廣大人民健康。根據奶牛結核病檢測技術標準，檢測奶牛結核病的方法為單純頸部皮內變態反應試驗、比對頸部皮內變態反應試驗和結核病γ-干擾素ELISA試驗。皮內變態反應試驗非特異性反應較高容易造成誤殺，而且耗費人力、財力和時間較多，存在人為因素影響結果的準確性等現象。結核病γ-干擾素ELISA試驗敏感性和特異性較皮內變態反應都高，是檢測奶牛結核病的最佳方法。

二、牛結核病的診斷方法

1、實驗基礎

首先，實驗室檢測設備。牛結核病的實驗室診斷需要配置，經過省級部門認定的獸醫實驗室要具備能夠開展郵件和資質。獸醫實驗室在規劃建造過程中應該確保相互獨立，并且各個功能區域之間相互獨立又能夠緊密聯系，在實驗室當中應該配備酶標儀、自動洗板機、微量震蕩器、生物安全柜、普通離心機、生物顯微鏡、恒溫培養箱、生化培養箱、PCR儀等齊全的血清學檢測及核酸檢測儀器設備，確保達到實驗操作要求標準及生物安全標準；其次，構建完善的實驗室管理體系。牛結核病是一種典型的人畜共患傳染性疾病和國家二類動物疫病感染范圍較為廣泛，能夠引發人類患病，所以，在開展實驗室診斷過程中一定要加強各項管理制度的建設，保障實驗室診斷的規范合理。制定《實驗室消毒管理制度》《獸醫實驗室生物安全管理制度》《獸醫實驗室生物安全管理手冊》《獸醫實驗室生物安全應急預案》《獸醫實驗室意外事故應急處置措施》等一系列制度措施，并不斷完善各項管理制度；最后，進一步提高實驗室的檢測能力。牛結核病在開展實驗室診斷過程中，要保證實驗室具有較強的檢測能力，可開展酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、血清學檢測、實時熒光PCR、細菌分離、培養、鑒定，血常規檢查、血液生化指標檢查、尿液常規檢查等。

2、結核病γ-干擾素ELISA試驗

①參照標準

此試驗參照《動物結核病診斷技術》GB/T18645-2020

②適用范圍

本試驗用于檢測牛全血培養上清中的牛γ-干擾素，根據檢測牛PPD、禽PPD和PBS刺激全血后上清中γ-干擾素量的不同，從而判斷牛結核的感染情況。

③試驗原理

牛γ-干擾素試驗是以刺激培養全血為基礎，檢測牛結核病的一種試驗方法。通常，感染分支桿菌的牛，其血液中的淋巴細胞能識別特異的分支桿菌抗原（包括結核菌素PPD），淋巴細胞識別分支桿菌抗原的過程涉及細胞因子的產生和釋放，γ-干擾素就是其中最重要的一種。用結核菌素（PPD）刺激培養牛全血，全血中的T淋巴細胞就會識別PPD，發生細胞免疫反應，其中一個直接的表現就是產生并釋放γ-干擾素。γ-干擾素可用γ-干擾素特異的單克隆抗體夾心法檢測。其它資料背景參考《牛γ-干擾素ELISA檢測試劑盒》的說明書。

④安全性

此試驗存在一定風險，盡管風險比較小。陽性反應的上清中可能會含有分支桿菌，因此，所有操作步驟都應嚴格遵守操作規程及實驗室生物安全相關規章制度。

⑤操作程序

首先，器材。酶標儀、Ⅱ級生物安全柜、二氧化碳培養箱或生化培養箱、混勻儀、冰箱（2℃～8℃，-15℃以下）、電子天平、高壓消毒鍋、微量可調移液器及吸頭、一次性無菌離心管（2mL或1.5 mL）、一次性肝素鋰或肝素鈉抗凝采血管、一次性注射器（5mL，10mL，20 mL）或一次性采血針、一次性無菌等；其次，試劑。《牛γ-干擾素ELISA檢測試劑盒》、去離子水等；再次，操作方法。用采血針或注射器無菌采集全血4mL以上，立刻轉移至肝素鋰或肝素鈉抗凝采血管中，輕輕顛倒混勻3～5次，18℃～25℃保存，30h內送達實驗室進行刺激培養。將抗凝血輕輕顛倒混勻，無菌分裝于培養容器，每份血液樣品分裝3孔，每孔加入定量全血，分別加入定量PPD-B、PPD-A和PBS，輕輕振蕩混勻，置37℃培養一定時間，收集上清，立即用于檢測，或保存于-15℃以下備用。用ELISA方法檢測上清液中的γ-干擾素。根據試劑盒說明調整酶標儀波長，讀取OD值，確定實驗結果成立與否，判定陰陽性。

⑥注意事項

首先，采血。在采血過程中，應注意生物安全，尤其注意個人防護及全血不得污染；其次，樣品運輸保存。全血應低溫保存，不得污染、不得腐敗、不得冷凍；再次，試驗配套。有相關實驗室及試驗設備的配套；第四，溫度恒定。培養全血時應注意溫度要恒定在37℃，要防止污染；第五，洗板。做ELISA洗板時，在拍干后不能留有氣泡，不能長時間干燥。顯色時應注意避光，加樣后應注意混勻；最后，痕跡資料。注意記錄的完整性與規范性，做到可追溯。

3、結核病γ-干擾素ELISA試驗方法在牛結核病凈化中的應用

為了加快牛結核病的凈化處理，從2021年開始，在發生過牛結核病的規?；馀ｐB殖場和奶牛養殖場推廣應用結核病γ-干擾素ELISA試驗方法，對肉牛和奶牛進行進一步的結核病凈化處理，發現結核病γ-干擾素ELISA試驗在實際應用中優勢明顯，同時也存在一定的不足，因此，通過進一步推廣探索出更優化的結核病γ-干擾素ELISA試驗及相關推廣方式，具體如下：一方面結核病γ-干擾素ELISA試驗，一個試驗周期約24h，通過推廣探索縮短試驗周期的方法。另一方面結核病γ-干擾素ELISA試驗技術要求用去離子水，通過推廣探索使用市面上售賣的飲用純凈水替代去離子水，使該試驗方法更容易在基層應用。再一方面通過結核病γ-干擾素ELISA試驗不同試劑盒實驗結果比對，篩選出敏感性和特異性更高的試劑盒。最后一方面通過推廣，探索出結核病γ-干擾素ELISA試驗關鍵細節，通過改進，優化試驗方法及推廣方式。

三、牛結核病的防控措施

1、加強檢疫檢驗

為了更好的推動牛結核病防控工作的高質量開展，應該構建完善的檢疫檢驗措施，對于從外地調運或者從當地調運的肉牛和奶牛，應該來自于非疫區，需要當地動物防疫機構出具相應的檢疫合格證明書。運輸之前，動物防疫監督機構應該對調運的奶牛和肉牛進行牛結核病的血清檢測，檢測合格之后出具檢疫證明書。從外地調運的牛應該放置在隔離室當中單獨隔離養殖4周以上，并在隔離養殖期間對牛群進行針對性的檢測，尤其是應該注重做好結核病的有效檢測，確保安全不存在帶病情況之后才能夠混合養殖。在新鮮的乳汁收購過程中，一定要詳細的對乳汁品質進行檢查，并索要奶牛健康證明。屠宰場在對牛進行屠宰處理過程中也需要掌握奶牛的健康證明，如果檢測成像陽性，要按照責任追溯機制查明疫病的來源。

2、注重做好消毒處理工作

為了有效防范結核病的發生流行，一定要構建完善的消毒管理制度，應該交替使用兩種以上的消毒劑，針對場地、用具、出口、圈舍進行全面的消毒，切斷病原，避免病原，傳播病情。陰性養殖場應該每間隔三天消毒一次，28天再進行一次消毒處理。陽性養殖場應該堅持每天消毒一次，連續消毒28天。消毒28天之后結合養殖場的檢疫結果，確定今后的消毒頻率和消毒次數。當牛群當中檢測出結核病之后，應該對養殖場的用具車輛以及運動場地進行緊急的清理和消毒處理，及時清除在環境當中散落的結核病原。將患病牛單獨隔離，假定健康牛和患病牛排出的排泄物和尿液應該及時收集并進行堆積發酵處理和無害化處理。養殖場的日常設施也需要制定針對性的消毒制度，相關管理人員車輛在進出入養殖場之前都需要進行徹底的清洗消毒池，應該保持消毒濃度達標，定期更換消毒劑，保證消毒藥效合理，建議每周更換一次消毒液。養殖場4周的環境可以選擇使用2%的氫氧化鈉溶液消毒，養殖場內的污水池，下水道出口應該選擇使用漂白粉進行消毒處理。繁殖母牛進入生產階段之后，應該嚴格落實生產過程的全過程消毒，注重做好分娩室以及保育室的徹底消毒，并嚴格按照相關要求進行有效的擠奶，做好擠奶設備的消毒處理，選擇使用0.1%的新吉爾滅進行消毒，有效控制病原的傳播，降低發生流行率。

3、做好日常管理

不管是奶牛養殖場還是肉牛養殖場，在日常飼養過程中一定要構建健康養殖管理檔案，防疫檔案出入證登記制度，非飼養管理人員不能夠進出入生產區，如果必須進入生產區域，應該穿戴相應的工作服裝，并落實嚴格的衛生消毒制度。養殖場當中不能夠養殖其他牲畜類動物，避免牛群和家禽、其他牲畜類動物頻繁接觸。防疫人員獸醫人員，養殖場的飼養管理人員，應該每年進行一次全面的體檢，如果檢測出結核病需要進行針對性的治療，恢復健康之后才能夠上崗，新上崗的工作人員一定要出具健康證明，通過嚴格的檢查，不存在結核桿菌感染和其他傳染性疾病感染的情況下，才能夠進入到生產區域。日常要注重做好養殖培訓工作，合理的分配工作任務組織，工作人員參與各項培訓活動，增強養殖管理人員對結核病等人畜共患傳染性疾病危害的認知，嚴格按照動物防疫標準開展防疫工作和防控工作，保障養殖場的各項防控工作能夠落實到位。

4、注重做好病死動物的無害化處理

①病死牛收集前死因判定

養殖場發現病死牛的，在將病死牛臨時儲存到配備的冷凍設備前，應首先由養殖場方對病死情況進行初步判定，疑似重大動物疫病的，要及時向當地農業農村主管部門或動物疫病預防與控制中心報告。接到報告后，農業農村主管部門要立即組織動物疫病預防與控制中心等專業人員進行現場診斷，仍懷疑重大動物疫病的，按照《重大動物疫情應急條例》及有關規定進行處理；排除重大動物疫病的，出具情況說明，按照《病死及病害動物無害化處理技術規范》進行無害化處理。屠宰場病死牛收集前的死因判定由官方獸醫進行初步判定，如不能排除重大動物疫病的，要第一時間向當地農業農村主管部門報告，程序同上。

②規范收集管理

牛養殖場、屠宰場病死及病害牛的收集要明確專人負責；養殖場要配備專用冷凍設備，如小型冷庫或冷柜等，用于死亡牛的臨時儲存，且要遠離生產區；屠宰場病害牛產品要用防滲漏的包裝袋進行收集，可以與病死牛一起臨時儲存在專用冷庫，專用冷庫與商品肉冷庫要分開，不存在共用通道等交叉情況。

③處理條件要求

無害化處理場建設應符合農業農村部《動物防疫條件審查辦法》要求，取得《動物防疫條件合格證明》。無害化處理技術工藝應嚴格按照《病死及病害牛無害化處理技術規范》要求，各參數符合規定。冷凝排放水應冷卻后排放，產生的廢水應經污水處理系統處理，達到GB8978要求。處理車間廢氣應通過安裝自動噴淋消毒系統、排風系統和高效微?？諝膺^濾器（HEPA過濾器）等進行處理，達到GB14554要求后排放。同時，要做好防鼠、防鳥以及清洗消毒等其他生物安全措施。

④生物安全防護

收集、暫存、轉運及無害化處理操作人員應經過專門培訓，掌握必要的動物防疫知識和環保知識，身體健康且無外傷，并每年進行健康體檢；涉及高溫、高壓容器操作的工作人員應符合相關專業要求，接受培訓，持證上崗；各個環節工作人員在操作過程中應穿戴防護服、口罩、護目鏡、膠鞋和手套等防護用具；各環節使用的收集工具、包裝用品、轉運工具、清洗工具、消毒器材等應專項專用，各裝載工具不能混用；無害化處理場操作人員工作結束后應洗澡、清潔、消毒后方可離場。各個環節儲存病死及病害牛的冷庫（柜）等設施設備，每次清空后，須進行全面清洗消毒（每月應至少清空并清洗消毒一次）；無害化處理場對處理場所和運輸車輛要科學規范清洗消毒，對污區環境及設施設備進行全面清洗消毒；已使用的一次性防護用品要及時做無害化處理；消毒藥品要定期更換，達到最佳消毒效果。對養殖場（屠宰場）臨時儲存點、鄉鎮暫存點、無害化處理各環節運輸車輛、無害化處理場進行環境抽樣監測。養殖場（屠宰場）臨時儲存點和鄉鎮暫存點各取一個環境樣，將病死及病害牛從養殖場（屠宰場）轉運至鄉鎮暫存點、從鄉鎮暫存點轉運至無害化處理場的車輛各取一個環境樣，每個無害化處理場抽一個環境樣、一個水樣，環境（水）樣檢測為多點取樣混樣監測。

牛養殖業是互助縣牧業的重要支柱，是養殖戶收入主要來源，牛結核病嚴重影響大理牛產業的發展，牛結核病的控制直接影響大理州養牛產業的發展。牛結核病屬于人畜共患病，有嚴重的公共衛生影響，好的牛結核病防控效果不僅可以保護人民的身體健康減少結核感染風險還可以保證公共衛生安全，養牛所產生的經濟效益可提升養殖戶的收入，是鄉村振興的優良項目，有利于社會穩定。及時將患病牛捕殺無害化處理能避免更多牛感染造成疫情擴散大面積撲殺造成更大的環境污染。如何快速準確診斷牛結核病是控制牛結核病的關鍵。牛結核病γ-干擾素檢測技術可快速準確診斷牛結核病，為牛結核病防控提供科學依據。

（作者單位：810599 青海省互助縣林川鄉畜牧獸醫站）