不同基因型烤煙成熟期細(xì)胞壁物質(zhì)及相關(guān)酶活性變化

摘要：為了解不同煙葉成熟度細(xì)胞壁物質(zhì)含量及其酶活性的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為煙葉適時(shí)采收、煙葉品質(zhì)提升提供一定理論依據(jù)，以烤煙品種NC71、中煙100 和NX211 的中部煙葉為材料，研究不同烤煙品種在成熟衰老過(guò)程中細(xì)胞壁組分含量及其相關(guān)酶活性動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，隨著葉片成熟與衰老進(jìn)程的不斷推進(jìn)，總果膠和纖維素含量均在適熟時(shí)達(dá)到最高，其中，總果膠含量大小表現(xiàn)為NC71gt;中煙100gt;NX211，但差異不顯著，纖維素含量大小表現(xiàn)為中煙100gt;NC71gt;NX211，但差異不顯著；木質(zhì)素含量從欠熟到適熟呈上升的趨勢(shì)；果膠酯酶（PE）在適熟時(shí)活性最低，其大小表現(xiàn)為NC71gt;中煙100gt;NX211，但NC71 和中煙100 差異不顯著；多聚半乳糖醛酸酶（PG）在適熟時(shí)活性最高，其大小表現(xiàn)為中煙100gt;NX211gt;NC71，各品種間PG 活性差異顯著；纖維素酶在完熟時(shí)活性達(dá)到最高，其大小表現(xiàn)為中煙100gt;NC71gt;NX211，但中煙100 和NC71 差異不顯著；不同烤煙品種細(xì)胞壁組分含量及相關(guān)酶活性變化趨勢(shì)相同，但在量和活性值上有所差異。根據(jù)不同烤煙品種在成熟期細(xì)胞壁物質(zhì)的變化規(guī)律，可有針對(duì)性地選擇適宜采收期。

關(guān)鍵詞：烤煙；成熟期；細(xì)胞壁；酶活性

中圖分類(lèi)號(hào)：S572 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1002?2481（2023）06?0639?06

煙草是世界上最廣泛種植的商業(yè)性非食物葉用經(jīng)濟(jì)作物，在許多國(guó)家的財(cái)政和經(jīng)濟(jì)政策中所占的地位引人注目。煙草細(xì)胞壁物質(zhì)包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠等成分，在烤煙煙葉內(nèi)占干物質(zhì)質(zhì)量的26%～35%[1]。閆克玉等[2]研究表明，細(xì)胞壁成分是糖類(lèi)中對(duì)煙草內(nèi)在品質(zhì)和風(fēng)味影響的不利因素，細(xì)胞壁物質(zhì)含量越高，煙葉的品質(zhì)越差；特別是低檔次煙葉中糖類(lèi)物質(zhì)含量很低，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素及果膠含量很高，致使煙葉的工業(yè)可用性較低。劉春奎等[3]研究表明，烤煙葉片細(xì)胞壁物質(zhì)與煙葉外觀質(zhì)量和感官質(zhì)量等品質(zhì)因素密切相關(guān)。因此，對(duì)烤煙煙葉成熟過(guò)程中細(xì)胞壁及相關(guān)酶活性變化進(jìn)行研究，可為煙葉成熟采收和調(diào)制提供新的判斷標(biāo)準(zhǔn)。沈穎等[4]研究表明，甜櫻桃果實(shí)的硬度與細(xì)胞壁物質(zhì)有關(guān)。林河通等[5]通過(guò)研究龍眼果實(shí)自溶過(guò)程中生理生化變化，得出龍眼果實(shí)適時(shí)采收可抑制細(xì)胞壁酶活性，保持較好的龍眼果實(shí)細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的完整性。馮美等[6]研究表明，枸杞果實(shí)成熟過(guò)程中的細(xì)胞壁物質(zhì)變化與其軟化程度有很大關(guān)系，選擇適宜果實(shí)成熟度可防止果實(shí)腐爛。關(guān)于煙草中細(xì)胞壁物質(zhì)的研究已有不少，霍開(kāi)玲等[7]通過(guò)研究細(xì)胞壁物質(zhì)及細(xì)胞壁酶活性在烘烤中的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁物質(zhì)降解是細(xì)胞壁降解酶綜合作用的結(jié)果。武圣江等[8]研究烤煙烘烤過(guò)程中細(xì)胞壁生理變化，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)延長(zhǎng)烘烤時(shí)間，保持較高的細(xì)胞壁降解酶活性，可以降低細(xì)胞壁組分，提升煙葉質(zhì)量。王威威等[9]通過(guò)不同烘烤工藝對(duì)翠碧一號(hào)進(jìn)行烘烤，發(fā)現(xiàn)變黃期中溫烘烤條件下烤后煙葉細(xì)胞壁物質(zhì)含量有利于提高煙葉質(zhì)量。

楊虹琦等[10]研究表明，添加外源纖維素酶、果膠酶可降低烤后煙葉纖維素和果膠等含量，提高吸食品質(zhì)。關(guān)于煙葉細(xì)胞壁物質(zhì)組分對(duì)煙葉品質(zhì)的影響已有較多研究，但已有的研究多集中在不同類(lèi)型煙草細(xì)胞壁組分含量差異、生態(tài)條件對(duì)細(xì)胞壁物質(zhì)含量影響以及細(xì)胞壁物質(zhì)在烘烤過(guò)程中的變化方面，而烤煙成熟期細(xì)胞壁物質(zhì)及相關(guān)酶活性變化規(guī)律尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以不同基因型烤煙中煙100、NC71 和NX211 為材料，對(duì)煙葉在成熟過(guò)程中細(xì)胞壁物質(zhì)及相關(guān)酶活性進(jìn)行測(cè)定，旨在探討煙葉在不同成熟度條件下的細(xì)胞壁成分含量及其酶活性變化規(guī)律，為煙葉適時(shí)采收和優(yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2020 年在漯河臨潁縣臺(tái)陳鎮(zhèn)荊李村進(jìn)行，土壤類(lèi)型為黃棕壤。耕作層的有機(jī)質(zhì)含量為9.42 g/kg，全氮含量為0.85 g/kg，速效氮含量為58.34 mg/kg，速效磷含量為24.15 mg/kg，速效鉀含量為87.24 mg/kg，pH 值7.6。

1.2 試驗(yàn)材料

供試烤煙品種為中煙100、NC71 和NX211。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于5 月2 日進(jìn)行移栽，田間管理措施均按漯河市優(yōu)質(zhì)煙葉栽培技術(shù)規(guī)程進(jìn)行。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3 次，共9 個(gè)小區(qū)，每小區(qū)面積19.8 m2，行距120 cm、株距55 cm，每試驗(yàn)小區(qū)植煙30 株。

試驗(yàn)設(shè)5 個(gè)取樣時(shí)期處理，煙葉打頂當(dāng)天即移栽后65 d 開(kāi)始取樣，此后每隔10 d 取樣一次，共取樣5 次。

通過(guò)對(duì)采后煙葉的外觀質(zhì)量判斷，打頂后10 d 煙葉為未熟，打頂后20 d 煙葉為尚熟欠熟，打頂后30 d煙葉為成熟適熟，打頂后40 d 煙葉為完熟。每個(gè)處理選取生長(zhǎng)均勻一致的煙株中部煙葉（第9—11 位）葉位葉片各5 片，去除主脈，所有樣品及時(shí)放入液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室放入-80 ℃冰箱中保存，用于測(cè)定果膠酯酶（PE）、纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、總果膠、木質(zhì)素、纖維素（CLL）。每個(gè)時(shí)期進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 細(xì)胞壁主要成分含量測(cè)定 總果膠含量采用咔唑比色法測(cè)定[11]，木質(zhì)素含量采用乙酰化法測(cè)定[12]，纖維素含量采用蘇州格銳思生物科技有限公司生產(chǎn)的酶試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定。

1.4.2 細(xì)胞壁相關(guān)降解酶活性測(cè)定 果膠酯酶（PE）、纖維素酶和多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性分別按照PE、纖維素酶和PG 試劑盒說(shuō)明書(shū)（蘇州格銳思生物科技有限公司）測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖采用Excel 2013 軟件進(jìn)行，差異顯著性分析采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型烤煙成熟期果膠酶活性及總果膠含量變化

2.1.1 PE 活性變化 PE 催化中膠層果膠部分的游離羧基酯化，使果膠的甲酯度下降，加速果膠的水解[13]。由圖1 可知，各基因型煙葉在煙株打頂之后PE 活性的變化規(guī)律基本一致，都表現(xiàn)為增—減—增的變化趨勢(shì)。煙葉打頂后，PE 活性迅速升高，在打頂后10 d 達(dá)到峰值；各個(gè)基因型煙葉PE 活性表現(xiàn)為NC71gt; 中煙100gt;NX211，且NC71 與中煙100 和NX211 差異達(dá)顯著水平（Plt;0.05），其酶活性分別為0.377、0.324、0.308 μmoL/（min·g）；從移栽后10 d 開(kāi)始，NC71 煙葉PE 活性迅速降低，NX211 和中煙100 煙葉PE 活性下降幅度相對(duì)較小；在移栽后30 d，NC71 和中煙100 煙葉PE 活性差異不顯著；在移栽后30 d，各基因型煙葉PE 活性上升，大小表現(xiàn)為NC71gt;中煙100gt;NX211，且NC71與中煙100 和NX211 差異達(dá)顯著水平（Plt;0.05）。

2.1.2 PG 活性變化 PG 可以水解細(xì)胞壁中果膠酸的1，4-2-D-半乳糖苷鍵，產(chǎn)生低聚半乳糖醛酸或半乳糖醛酸，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體[14]。不同基因型烤煙生長(zhǎng)過(guò)程中PG 活性的變化情況如圖2 所示。

由圖2 可知，各基因型煙葉PG 活性的變化趨勢(shì)一致，都表現(xiàn)為在打頂后10 d 下降，而后上升再下降的趨勢(shì)；都呈現(xiàn)出在打頂后活性降低，在打頂后10 d 開(kāi)始降低直至打頂后20 d 活性達(dá)到最小值，而后活性緩慢上升，在打頂20 d 后活性緩慢上升，而后緩慢下降。其中，中煙100 和NX211 變化趨勢(shì)較為一致，而NC71 在打頂后10 d 內(nèi)PG 活性迅速降低。因此，在打頂后0～10 d 各基因型煙葉PG 活性表現(xiàn)為中煙100gt;NC71gt;NX211，在打頂后20～40 d 各基因型煙葉PG 活性大小表現(xiàn)為中煙100gt;NX211gt;NC71，在煙葉成熟期間，3 個(gè)品種間PG活性差異達(dá)顯著水平（Plt;0.05）。

2.1.3 總果膠含量變化 果膠質(zhì)是細(xì)胞壁的重要成分，隨著煙株的成熟和衰老，原果膠大量溶化和去聚化，表現(xiàn)為水溶性果膠和果膠酸含量的增加[15]。從圖3 可以看出，各基因型煙葉總果膠含量在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中變化趨勢(shì)保持一致，都呈現(xiàn)出在打頂后含量降低，在打頂后10 d 開(kāi)始增加，直至打頂后30 d 含量達(dá)到最大值，而后開(kāi)始下降的變化規(guī)律。其中，在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的各個(gè)時(shí)期各基因型間煙葉總果膠含量大小均表現(xiàn)為NC71gt;中煙100gt;NX211，但在整個(gè)成熟期間，各品種的總果膠含量差異不顯著。

2.2 不同基因型烤煙成熟期木質(zhì)素含量變化

木質(zhì)素在植物中與細(xì)胞的抗病性相關(guān)，可與其他糖類(lèi)結(jié)合在一起，作為細(xì)胞壁的填充物質(zhì)，可使組織的機(jī)械強(qiáng)度提高[16]。從圖4 可以看出，各基因型煙葉在煙株打頂后的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中木質(zhì)素含量變化規(guī)律基本一致，呈“M”型變化趨勢(shì)，都表現(xiàn)為打頂后增加直至打頂后10 d 煙葉木質(zhì)素含量達(dá)到最大值，而后呈降低—升高—降低的變化趨勢(shì)。

其中，打頂時(shí)，中煙100 煙葉木質(zhì)素含量低于NX211，且各品種間木質(zhì)素含量差異達(dá)顯著水平（Plt;0.05），在打頂后10～30 d，各個(gè)基因型煙葉木質(zhì)素含量大小均表現(xiàn)為NC71gt;中煙100gt;NX211，且差異達(dá)顯著水平（Plt;0.05）；在打頂后40 d，各品種的木質(zhì)素含量差異不大。

2.3 不同基因型烤煙成熟期纖維素含量及纖維素酶活性變化

2.3.1 纖維素含量變化 纖維素是細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分，可促進(jìn)燃燒，其含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致雜氣和刺激性增加[17]。由圖5 可知，打頂后各基因型煙葉總體呈現(xiàn)出先升高后小幅降低的變化規(guī)律。其中在打頂當(dāng)天和打頂后30 d 煙葉纖維素含量大小表現(xiàn)為中煙100gt;NC71gt;NX211，但各品種間纖維素含量差異不顯著。在打頂10～20 d，各基因型煙葉纖維素含量大小表現(xiàn)為中煙100gt;NX211gt;NC71；在打頂后40 d，NC71 纖維素含量最高，其次是中煙100，NX211 纖維素含量最低，且各品種間纖維素含量差異達(dá)顯著水平（Plt;0.05）。

2.3.2 纖維素酶活性變化 纖維素酶為復(fù)合型水解酶，能降解纖維素，導(dǎo)致細(xì)胞壁中和膠層物質(zhì)的降解，半纖維素的分解，細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度下降[18]。

從圖6 可以看出，NC71、NX211 和中煙100 在整個(gè)烤煙成熟期煙葉纖維素酶活性呈現(xiàn)先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)。煙葉打頂后，纖維素酶活性迅速上升，3 個(gè)基因型煙葉纖維素酶活性均在打頂后40 d 達(dá)到高峰，其纖維素酶活性分別為1 370.84、1 370.61、1 160.64 μg/（h·g）。在打頂時(shí)至打頂后30 d，各基因型煙葉纖維素酶活性差異不顯著，大小都表現(xiàn)為中煙100gt;NC71gt;NX211。

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞壁物質(zhì)在果實(shí)的軟化、儲(chǔ)藏過(guò)程中有重要影響。菜豆豆莢[19]、甘蔗[20]和狗頭棗[21]等在發(fā)育、衰老過(guò)程中，細(xì)胞壁代謝會(huì)引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致果實(shí)硬度下降而軟化，影響食用品質(zhì)。煙葉中的細(xì)胞壁物質(zhì)對(duì)煙葉吃味、協(xié)調(diào)性和安全性等有較大影響。武圣江等[8]研究表明，煙葉在烘烤過(guò)程中，細(xì)胞壁物質(zhì)的水解能夠防止光滑煙的形成。烤煙在生長(zhǎng)成熟期和調(diào)制期間細(xì)胞壁物質(zhì)含量的變化，會(huì)影響煙葉的品質(zhì)。

張映璜等[22]研究表明，在煙葉衰老過(guò)程中，纖維素酶和果膠酶活性增加，使葉片的纖維素和果膠降解。本研究表明，葉片從尚熟到成熟時(shí)，PE 活性不斷下降，PG 活性升高，總果膠含量升高。從成熟到完熟時(shí)，PE 活性升高，PG 活性下降，總果膠含量下降。牛浩等[23]研究表明，隨著采收時(shí)間的推遲，葉片的果膠酶含量呈先升高后降低，與本研究結(jié)果一致。隨著成熟度的提高，果膠含量升高，果膠含量的增加明顯有利于烤煙抗破碎性的增強(qiáng)[24]，同時(shí)果膠含量又是保持主脈姿態(tài)的關(guān)鍵因素[23]，在果膠的降解過(guò)程中，煙葉組織結(jié)構(gòu)變疏松，若不及時(shí)采收，將會(huì)出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象[25]。細(xì)胞壁物質(zhì)的降解不僅與果膠有關(guān)，還與纖維素的降解有關(guān)。本研究結(jié)果表明，在尚熟至成熟時(shí)，纖維素含量略有增加，這可能是因?yàn)榧?xì)胞黏度略有上升，隨著成熟度的提高，纖維素含量下降，此時(shí)纖維素酶活性升高，說(shuō)明完熟時(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)解體，煙葉細(xì)胞質(zhì)體和膜結(jié)構(gòu)遭到一定的破壞。陳紅麗等[26]研究表明，纖維素含量與煙葉外觀質(zhì)量中的身份相關(guān)性顯著。衛(wèi)盼盼[24]研究表明，纖維素含量明顯制約著烤煙抗破碎性的增強(qiáng)。因此，纖維素含量的多少可以作為一種判斷成熟度的標(biāo)準(zhǔn)。木質(zhì)素與纖維素結(jié)合可以使植物保持一定的硬度。高婭北等[27]研究表明，烤煙成熟期的木質(zhì)素含量高低與煙葉保水能力呈顯著正相關(guān)。

本研究表明，在煙葉成熟期，木質(zhì)素含量在打頂后30 d 會(huì)有一定的上升，而后下降，與前人研究結(jié)果一致[28]。隨著煙葉的衰老，煙葉厚度增加，木質(zhì)素含量會(huì)減少，這可能是與煙葉的硬度以及組織結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[29]。因此，細(xì)胞壁物質(zhì)含量及相關(guān)酶活性的高低可作為判斷煙葉成熟的一種標(biāo)準(zhǔn)，在打頂后30 d，煙葉PE 活性低、PG 活性高、總果膠含量高、纖維素含量高，此時(shí)煙葉細(xì)胞壁組織結(jié)構(gòu)完成，不會(huì)導(dǎo)致煙葉外觀質(zhì)量結(jié)構(gòu)疏松，造成細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)含物質(zhì)流失。

本試驗(yàn)所選的3 個(gè)品種在成熟過(guò)程中的細(xì)胞壁物質(zhì)及酶活性規(guī)律變化一致，但是細(xì)胞壁物質(zhì)含量以及酶活性的大小有一定的差異。其中，NC71在成熟過(guò)程中的總果膠、纖維素和木質(zhì)素含量較高，中煙100 次之，NX211 含量最低。說(shuō)明不同烤煙品種的細(xì)胞壁物質(zhì)在成熟期的降解速率不同，NC71 在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞壁物質(zhì)轉(zhuǎn)化分解能力較低。采收后鮮煙的細(xì)胞壁物質(zhì)含量的多少會(huì)影響其烘烤后的煙葉質(zhì)量。武圣江[30]研究表明，鮮煙中的細(xì)胞壁物質(zhì)在烘烤過(guò)程中水解不完全或不充分，會(huì)影響內(nèi)含物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。王威威等[9]研究表明，細(xì)胞壁物質(zhì)總量高對(duì)香氣質(zhì)和香氣量存在不利影響，但雜氣增加；果膠和纖維素含量高有利于提高香氣質(zhì)和香氣量，減少雜氣。細(xì)胞壁物質(zhì)總量高對(duì)香氣質(zhì)、香氣量和雜氣貢獻(xiàn)較大。煙葉采收時(shí)，在保持一定煙葉組織結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上保持較低的細(xì)胞壁物質(zhì)，會(huì)使烤后煙葉的品質(zhì)有所提升。

本研究發(fā)現(xiàn)，烤煙在成熟衰老過(guò)程中，其細(xì)胞壁物質(zhì)會(huì)有明顯的變化。隨著煙葉成熟度的增加，總果膠、纖維素含量在適熟時(shí)達(dá)到最大，木質(zhì)素含量在適熟時(shí)會(huì)有一個(gè)高峰，PE 活性在適熟時(shí)最低，PG 活性在適熟時(shí)最高，纖維素酶活性在完熟時(shí)最高。所以，探討細(xì)胞壁物質(zhì)以及酶活性的變化規(guī)律，可作為判斷煙葉成熟度的一種方法。然而，關(guān)于土壤類(lèi)型、施肥量對(duì)細(xì)胞壁相關(guān)酶活性的影響，以及細(xì)胞壁物質(zhì)對(duì)鮮煙素質(zhì)的影響，還需要進(jìn)一步研究。