響應面法優化黑木耳液體菌種發酵配方及條件

摘要：液體菌種已在黑木耳菌包工廠化生產中廣泛應用并取得較好效果，但提高黑木耳液體菌種發酵生產效率仍是菌包生產企業的重要技術需求。為深入探究發酵營養條件、環境條件及其交互作用對黑木耳液體菌種生產效率的影響，為黑木耳液體菌種高效生產提供有益參考。試驗以國家認定品種黑木耳2 號為試驗菌株，以發酵醪中菌絲量為響應值，采用經典的響應面法對液體菌種發酵過程進行研究。結果表明，發酵基質營養與環境條件對黑木耳菌絲生物量具有顯著影響，試驗范圍均出現影響峰值；基質營養條件中的碳源濃度、環境條件中與溶氧水平密切相關的裝液量和搖床轉速都與其他發酵條件有很強的交互作用。結合單因素試驗、響應面試驗分析和驗證試驗，確定最佳配方為葡萄糖22.3 g/L、蛋白胨2.7 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L，同時添加羧甲基纖維素鈉3 g/L，菌絲生物量達13.22 g/L，與預測值13.05 g/L 相比，相對誤差為1.3%；最佳發酵條件為溫度30 ℃、時間7 d、搖床轉速165 r/min、裝液量105 mL（250 mL 錐形瓶），菌絲生物量達到14.32 g/L，與預測值14.11 g/L 相比，相對誤差為1.49%。研究結果表明，此液體發酵培養基配方及調控條件有效可行、菌絲得率高。

關鍵詞：黑木耳；液體菌種；響應面法；交互作用；發酵配方；發酵條件

中圖分類號：S646.6 文獻標識碼：A 文章編號：1002?2481（2023）06?0653?10

黑木耳（Auricularia heimuer F.WU，B.K.Cui amp;Y.C.Dai）[1]屬于擔子菌綱木耳目木耳科木耳屬[2]，是一種食藥兼用大型膠質真菌，含有豐富的膳食纖維、多糖、必需氨基酸、微量元素和維生素等營養物質[3]；具有抗腫瘤[4]、抗輻射[5]、改善肝損傷[6]、降血脂[7]、抗氧化[8]等多種功效。據中國食用菌協會統計，2020 年我國黑木耳產量已達到706.43 萬t[9]，成為第二大食用菌品種。

近年來，隨著黑木耳栽培量逐漸上升，液體菌種因具有制種周期短、發菌點多、代謝旺盛、菌齡整齊以及接種方便等[10]優點受到青睞，在黑木耳工廠化生產中應用比例越來越高。液體發酵技術是20 世紀40 年代由于抗生素生產需要而生，1948 年，HUMFELD[11]首次使用液體發酵法成功培養出蘑菇菌絲體，自此液體發酵技術在食用菌生產中得到進一步應用。黑木耳液體菌種的研究在1983 年已有報道，當時萬國昌等[12]對黑木耳、香菇等6 種食用菌的液體菌種進行了初步的研究。此后，黑木耳液體菌種研究逐漸成為熱點，目前對黑木耳液體菌種的優化方法主要有單因素試驗、正交試驗及響應面試驗。錢雪婷等[13]通過響應面試驗優化黑木耳液體菌種配方，結果表明，最佳配方為葡萄糖2.16%、牛肉粉0.48%、馬鈴薯15%、KH2PO4 0.33%、MgSO4·7H2O 0.1%，為黑木耳液體菌種配方提供了理論依據。解修超等[14]通過響應面試驗優化發酵工藝，得到最優值為葡萄糖50.27 g/L、KH2PO4 4.93 g/L、初始pH 值5.1。

本研究以應用廣泛的國家認定品種黑木耳2 號菌株為試材，在試驗過程中加入具有調節發酵液黏度和可能具有誘導纖維素酶活力的輔助原料羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），系統調整液體培養基狀態，采用單因素及響應面試驗對培養基配方及發酵條件進行優化，擬通過以上試驗得到最優培養基配方及發酵條件，并詳細分析營養與環境因子的交互作用，旨在為黑木耳液體菌種發酵生產提供更高效、更適用的技術參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 國家認定黑木耳品種黑木耳2 號（黑29），由黑龍江省科學院微生物研究所提供。

1.1.2 培養基配方 改良PDA 培養基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖 20 g/L、蛋白胨 3 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、瓊脂15 g/L、pH 自然。

液體培養基：馬鈴薯 200 g/L、葡萄糖 20 g/L、蛋白胨 3 g/L、KH2PO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、CMC-Na（羧甲基纖維素鈉）3 g/L、pH 自然。

1.1.3 試劑與儀器 葡萄糖、KH2PO4、MgSO4 ·7H2O（分析純），天津市科密歐化學試劑有限公司產品；蛋白胨、瓊脂（生物試劑），北京奧博星生物技術有限責任公司產品；CMC-Na（分析純），福晨（天津）化學試劑有限公司產品。

GI54DWS 立式自動壓力蒸汽滅菌器（致微（廈門）儀器有限公司），ZHJH-C1115B 超凈工作臺、ZWY-111B 恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司），GHP-9080 隔水式電熱恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司），TGL-20M 高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），GZX-9030MBE 電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠），LT302C 電子天平（常熟市天量儀器有限責任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化與液體菌種制備 將黑木耳黑29菌種接種到改良PDA 平板上，28 ℃恒溫培養8 d。

取約2 cm2 菌塊用接種針分割為25 小塊后，接種至裝有100 mL 液體培養基的錐形瓶（容量250 mL）中，28 ℃、160 r/min 搖床中培養8 d。

1.2.2 培養基成分單因素試驗 根據前期黑29 品種營養條件和環境條件影響水平的研究結果，以1.1.2 液體培養基為基礎，試驗檢測不同葡萄糖質量濃度（10、15、 20、25、30 g/L）、不同蛋白胨質量濃度（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/L）、不同KH2PO4 質量濃度（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L）和不同MgSO4·7H2O質量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L）對菌絲生物量的影響，并確定不同組分的最適質量濃度。

1.2.3 響應面法優化液體培養基配方 在單因素試驗基礎上，以菌絲生物量為響應值，采用Box-Behnken Design 進行4 因素3 水平試驗優化液體培養基配方（表1）。

1.2.4 培養基發酵條件單因素試驗 利用1.2.3 優化培養基，以發酵溫度28 ℃、轉速160 r/min、裝液量100 mL 和發酵8 d 為基礎，研究不同溫度（24、26、28、30、32 ℃）、不同轉速（140、150、160、170、180 r/min）、不同裝液量（90、100、110、120、130 mL）和不同發酵時間（6、7、8、9、10 d）對菌絲生物量的影響，確定最適發酵條件。

1.2.5 響應面法優化發酵條件 在單因素試驗的基礎上，以菌絲生物量為響應值，采用Box-BehnkenDesign 進行4 因素3 水平試驗優化液體菌種發酵條件（表2）。

1.2.6 菌絲生物量測定 本研究菌絲生物量以菌絲干質量計，根據戴建清[15]的方法微調。將黑木耳液體發酵醪液4 000 r/min 離心10 min，收集沉淀置于65 ℃電熱鼓風干燥箱中干燥至恒質量，稱得菌絲干質量。

1.3 數據分析采用SPSS Statistics 23 進行數據顯著性分析，采用Design-Expert 12 軟件進行響應面設計和分析，采用Origin 2019 軟件作圖。所有試驗均重復3 次，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 液體培養基配方單因素試驗

從圖1 可以看出，葡萄糖質量濃度對菌絲生物量影響顯著（Plt;0.05），菌絲生物量隨葡萄糖質量濃度增加呈現先升高后下降的趨勢，當葡萄糖質量濃度為20 g/L 時，菌絲生物量達到最高。因此，確定20 g/L 為葡萄糖最適質量濃度。

圖1 結果顯示，菌絲生物量隨蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O 質量濃度增加均呈先上升后下降的趨勢。其中，蛋白胨質量濃度為2.5 g/L 與3.0 g/L間菌絲生物量差異不顯著，當蛋白胨為2.5 g/L 時菌絲生物量最高，確定其為最適質量濃度；KH2PO4對菌絲生物量影響顯著（Plt;0.05），當質量濃度為1.5 g/L 時菌絲生物量最高；MgSO4·7H2O 質量濃度為1.0 g/L 時菌絲生物量最高。因此，確定蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O 的最適質量濃度分別為2.5、1.5、1.0 g/L。

2.2 響應面法優化液體培養基配方

2.2.1 響應面法優化配方試驗設計及結果 由表3可知，不同質量濃度營養成分對菌絲生物量具有一定影響，菌絲生物量最低為10.02 g/L，最高為13.06 g/L。

2.2.2 模型建立與方差分析 通過Design-Expert12 軟件進行二次多項回歸擬合，得到菌絲生物量回歸方程如下。

Y=-15.321 42+1.562 47A1+7.248 33B1+1 .6 0 1 C 1—0 .7 7 6 D 1 + 0 .1 5 3 A 1 B 1—0 .0 1 8 A 1 C 1 +0.168A1 D1—0.33B1 C1 —0.85B1 D1+ 1.01C1 D1—0.048 97A12—1.637B12—0.462C12—0.792D12 （1）

由表4 可知，回歸模型Plt;0.01，表現為極顯著；失擬項Pgt;0.05，表現為不顯著，表明該模型預測值與實際值誤差小。該模型R2=0.902 7 能解釋90.27% 的響應值變化差異。以上結果均表明，該模型擬合度良好。

由表4 可知，培養基配方組分對菌絲生物量的影響大小依次為A1gt;B1gt;D1gt;C1，即葡萄糖gt;蛋白胨gt;MgSO4·7H2Ogt;KH2PO4。其中，A1D1、B12 對菌絲生物量影響顯著（Plt;0.05），A1、B1、A12 對菌絲生物量影響極顯著（Plt;0.01）。

2.2.3 響應曲面分析 配方雙因素交互作用對菌絲生物量的影響如圖2 所示。

響應面曲面圖及等高線圖是回歸模型具體形象的呈現，響應面圖能夠直觀地反映各個因素與響應值之間的關系以及各個因素之間的交互作用[16-17]。當響應面三維圖的坡度越陡峭、二維圖中等高線越密集、等高線呈橢圓時，表明兩因素交互作用較顯著[18]。如圖2-a、b、c 所示，三維曲面圖陡峭，等高線密集且為橢圓形，說明葡萄糖與蛋白胨、葡萄糖與KH2PO4、葡萄糖與MgSO4·7H2O 之間交互作用明顯；而圖2-d、e、f 則顯示，蛋白胨與KH2PO4、蛋白胨與MgSO4·7H2O、KH2PO4 與MgSO4·7H2O之間雖具有一定交互作用，但作用不明顯。可見，在配方優化試驗中，主要是碳源葡萄糖與蛋白胨和微量元素KH2PO4 及MgSO4·7H2O 等3 種營養原料之間交互作用對菌絲生物量影響更明顯。

2.2.4 驗證試驗 根據回歸模型預測及實際生產狀況微調得到最佳配方：葡萄糖22.3 g/L、蛋白胨2.7 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L，菌絲生物量預測值為13.05 g/L。驗證試驗所得菌絲生物量為13.22 g/L，與預測值相對誤差為1.3%。證明采用響應面法優化液體培養基配方有效可行。

2.3 液體發酵條件單因素試驗

基于2.2.4 中最佳配方進行液體發酵條件單因素試驗及優化試驗，結果如圖3 所示，發酵溫度、轉速、裝液量和發酵時間等對菌絲生物量影響顯著（Plt;0.05），菌絲生物量均呈先上升后下降的趨勢，最適發酵條件為：發酵溫度28 ℃、發酵時間8 d、轉速170 r/min、裝液量100 mL。在此基礎上進行響應面優化試驗。

2.4 響應面法優化液體發酵條件

2.4.1 響應面法優化液體發酵條件試驗設計及結果 從表5 可以看出，不同發酵條件對菌絲生物量具有一定影響，菌絲生物量最低為8.81 g/L，最高為13.94 g/L。

2.4.2 模型建立與方差分析 通過Design-Expert12 軟件進行二次多項回歸擬合得到菌絲生物量回歸方程如下。

Y=-555.459 92+21.003 58A2+5.519 33B2+2 . 4 9 0 3 2 C 2 + 0 . 6 1 0 0 8 3 D 2—0 . 2 8 2 5 A 2 B 2—0.018 13A2C2—0.007 375A2D2+0.037 5B2C2—0 . 0 2 B 2 D 2 + 0 . 0 0 6 5 2 5 C 2 D 2—0.255 563A22—0.107 25B22—0.008 772C22—0.006 297D22 （2）

由表6 可知，回歸模型Plt;0.01，表現為極顯著；失擬項Pgt;0.05，表現為不顯著，表明該模型預測值與實際值誤差小。該模型R2=0.945 1，能解釋94.51% 的響應值變化差異。綜上所述，表明該模型擬合度良好。

從表6 可以看出，發酵條件影響順序依次為A2gt;D2gt;C2gt;B2，即發酵溫度gt;裝液量gt;轉速gt;發酵時間。其中，A2B2、C2D2 對菌絲生物量影響顯著（Plt;0.05），A2、C2、D2、A22、C22、D22 對菌絲生物量影響極顯著（Plt;0.01）。

2.4.3 響應曲面分析 由圖4-a 可知，三維曲面圖陡峭，等高線疏散且無法觀察形狀，說明溫度與發酵時間交互作用不顯著。由圖4-b、c、d 可知，溫度與轉速、溫度與裝液量、發酵時間與轉速之間具有一定交互作用，但不明顯；圖4-e、f 三維曲面圖陡峭，等高線密集且為橢圓形，說明發酵時間與裝液量、轉速與裝液量之間交互作用明顯。綜上，在發酵條件優化試驗中，發酵時間與裝液量、轉速與裝液量之間交互作用對菌絲生物量影響明顯。

2.4.4 驗證試驗 根據回歸模型分析及實際應用得到最佳發酵條件為：溫度30 ℃ 、時間7 d、轉速165 r/min、裝液量105 mL，預測值14.11 g/L。驗證試驗所得菌絲生物量為14.32 g/L，相對誤差為1.49%。

表明此發酵條件有效可靠，可用于實際生產中。

3 結論與討論

優化黑木耳液體菌種配方及發酵條件是提高黑木耳液體發酵效率的重要前提，本研究采用單因素試驗與響應面試驗對黑木耳液體菌種配方及發酵條件進行優化。單因素試驗發現，菌絲生物量隨各營養因素濃度增高均呈現先升高后下降的趨勢，并具有顯著性差異，該結果與劉俊梅等[19]試驗結果一致，表明營養缺乏或過量均會抑制菌絲生物量積累，使用適量濃度的營養有利于菌絲生物量積累。

響應面優化培養基配方試驗研究表明，碳源物質葡萄糖是影響最大的因素，該結果與李超等[20]、于海洋等[21]試驗結果一致，可能與葡萄糖易被吸收利用有關。而通過響應面法優化得到的最佳配方與選用復合碳氮源的結果存在一定差異，如盛立柱等[22]以黑山菌株為試材，確定碳源玉米粉最適量為2.5 g/L、氮源豆粕最適量為2.0 g/L，可能與所用菌種特性及玉米粉和豆粕的復合營養有關。

發酵溫度會影響黑木耳菌絲代謝活性，進而影響菌絲對營養物質的吸收利用。本研究發現，菌絲生物量隨發酵條件變化也呈現先升高后下降的趨勢，該研究結果與李玉梅等[23]、車星星等[24]試驗結果一致，表明發酵條件對液體菌種發酵過程具有顯著影響。響應面法優化液體發酵條件試驗結果表明，發酵溫度對菌絲生物量影響最大，該結果與孟麗君等[25]利用冀誘1 號研究結果一致。王謙等[26]利用自有菌株研究表明，pH 影響最大、溫度影響最小。戴肖東等[27]在栽培特性研究中發現，pH 對黑29 菌絲生長影響不大。王志偉等[28]研究發現，pH對大白樁菇菌絲體干質量、多酚、黃酮、粗多糖的積累具有較大的影響，可能是由于菌株種類不同造成的差異。綜上，推測最優發酵配方和發酵條件與菌種生物學特性和培養基原料種類有關，后續試驗研究中應根據不同菌種特性需求確定最優發酵配方及發酵條件。

響應面曲面分析形象反映了不同營養因子和不同環境因子兩兩之間交互作用對發酵效果的影響。在液體培養基配方優化試驗中，碳源葡萄糖與蛋白胨、KH2PO4 及MgSO4·7H2O 都有較強的交互作用，而氮源沒有顯現出與微量元素的顯著交互作用，推測微量元素可能會在更大程度上影響碳源的消耗和利用。在發酵條件優化試驗中，發酵時間與裝液量之間、轉速與裝液量之間交互作用顯著，而培養基裝液量和搖床轉速都與發酵液的溶解氧水平緊密相關，這種交互作用顯示在黑木耳液體發酵過程中溶解氧的需求強烈，嚴重影響黑木耳菌絲生長過程，包括發酵效率和發酵終點的判定。目前，關于溶氧量的研究鮮有報道，研究發酵液中溶解氧水平與菌絲量變化之間的相關性對提高黑木耳液體發酵效率和液體菌種生產技術具有重要意義。

綜上所述，響應面法能有效對黑木耳黑29 菌種液體培養基配方及發酵條件進行優化，從而提升黑木耳液體菌種發酵效率。同時，本研究證明該發酵工藝可靠有效，可為黑木耳液體菌種生產提供重要參考，并支撐黑木耳工廠化和規模化生產。