非轉基因和轉基因大豆中色氨酸含量分析

摘 要：目的：對大豆中色氨酸分析的堿水解方法進行研究，比較非轉基因和轉基因大豆中色氨酸的含量。方法：樣品用氫氧化鋰溶液水解提取，樣液經中和定容、過膜后，用超高效液相-熒光檢測器測定，外標法定量。結果：應用氫氧化鋰對大豆樣品進行堿水解，方法的回收率為90%～93%，相對標準偏差小于5.0%。非轉基因和轉基因大豆樣品的色氨酸分析，轉基因大豆的色氨酸含量均不低于非轉基因大豆，其中的色氨酸可以滿足人體健康需要。結論：該方法準確快速、重現性好，適用于大豆中色氨酸含量分析的檢測要求。

關鍵詞：色氨酸；大豆；轉基因；非轉基因

大豆富含優質蛋白質，是豆類作物中營養價值較高的植物[1]。色氨酸作為人體必需的氨基酸之一，參與機體多項代謝和合成的網絡通路，其來源主要靠食物提供，色氨酸在代謝過程中與碳水化合物、蛋白質、脂肪、維生素和微量元素等各種營養素之間有十分密切的關系，充足的色氨酸供給是人類健康所需 [2]。培育優良品質的大豆品種對我國食物營養和食品安全工作有著重要意義，轉基因大豆自問世之日起，其安全評價便廣受專家學者和廣大群眾關注[3]。世界衛生組織（WHO）、聯合國糧農組織（FAO）、經濟合作與發展組織（OECD）等多家國際權威相關組織先后對轉基因產品的必要性和安全評價工作進行了大量的研究探討，在多家機構和相關研究組織推動、科研團隊的努力下，抗蟲、抗病等轉基因大豆的研究取得一定進展[4-6]。

氨基酸分析在大豆的營養品質評價方面起著重要作用，色氨酸不同于其他氨基酸，它是堿性環境下穩定存在的氨基酸，在經典的酸水解的前處理過程中會被破壞，故不能在酸水解法中被同時檢測分析，準確、高效地檢測大豆色氨酸含量是大豆品質分析的重要研究方向。色氨酸具有紫外吸收和熒光發射特性，故不需要衍生可通過紫外檢測器或熒光檢測器直接進行檢測。在參考國內外學者研究的基礎上[7-9]，超高效液相-熒光檢測器法具有準確可靠、重現性好等特點，我們采用該方法對大豆中色氨酸含量檢測進行研究。本試驗對其色氨酸前處理過程進行優化，通過比較選用配有熒光檢測器的超高效液相色譜儀進行分析，建立了準確快速的大豆中色氨酸含量檢測方法，并對來自三亞、石家莊、北京3個不同試驗基地的非轉基因和轉基因大豆樣品進行測定，比較其所含的色氨酸含量，為評價轉基因和非轉基因大豆中的色氨酸含量提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：大豆樣品編號1～6，粉碎備用（用四分法縮減）。其中1、2、3號（中黃10-A，B，C）為非轉基因大豆，4、5、6號（ZH10-6-A，B，C）為轉基因大豆，A、B、C代表北京、石家莊、三亞3個不同的種植基地。 ZH10-6的大豆是中黃10的大豆品種通過轉入耐除草劑G2-epsps、gat價基因獲得。G2-epsps基因可以編碼不被草甘膦抑制的EPSP酶，植物本身的EPSP酶對草甘膦非常敏感，在草甘膦處理下，植物由于不能合成芳香族氨基酸致死，通過編碼修飾，在草甘膦存在的環境中，轉入基因表達后能在植物體內執行植物免受草甘膦的破害的功能。另一個gat基因表達后可以在大豆植物體內降解草甘膦農藥。

色氨酸標樣，中國食品藥品檢定研究院；氫氧化鋰和氫氧化鉀（優級純）、乙酸鈉（色譜級），阿拉丁試劑公司；甲醇和乙酸（色譜級），MERK公司；配制試劑所用水為MilliQ純水器處理的超純水。

1.2 儀器和設備

ACQUITY I-CLASS超高效液相色譜儀，美國Waters；電熱恒溫干燥箱，上海森信。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液 稱取2.0 mg的色氨酸標準品于10 mL容量瓶中，滴加0.1 moL/L的氫氧化鉀溶液使其溶解，用水定容，得到濃度為200 μg/mL的標準儲備液。準確吸取一定體積的標準儲備液至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，得到濃度分別為5、10、25、50、75、100 μg/mL的標準溶液。

1.3.2 大豆樣品預處理 稱取粉碎后的均勻樣品約0.10 g于聚四氟乙烯水解管中，管內加入4 mol/L氫氧化鋰溶液1.5 mL，輕輕搖動混勻，然后充入高純氮氣，將四氟乙烯水解管放在110℃的恒溫干燥箱中，水解20 h，取出后冷卻至室溫。將水解管內的水解液轉移到25 mL容量瓶內，用乙酸鈉（0.008 5 mol/L，pH=4）多次沖洗水解管并定容至25 mL，經0.22 μm濾膜過濾后供儀器測定。

1.3.3 色譜條件 色譜柱ACQUITY BEH C18，50 mm×2.1 mm，1.7 μm；發射波長283 nm，激發波長343 nm；色譜柱溫度30 ℃；進樣體積2 μL；流動相：乙酸鈉（0.008 5 mol/L，pH=4）：甲醇=90 ∶10；流速0.2 mL/min。

2 結果與分析

色氨酸作為人體所需要的必需氨基酸，高效液相色譜法被大多數研究者認為是一種可靠高效測定色氨酸的方法。GB/T 15400—2018《飼料中色氨酸的測定》將高效液相色譜法作為飼料中色氨酸的檢測分析方法[10]。在此基礎上，本研究采用配有熒光檢測器的超高效液相色譜儀對轉基因大豆和非轉基因大豆中的色氨酸含量進行了測定，方法優化結果如下。

2.1 儀器條件優化

2.1.1 色譜條件選擇 應用超高效液相色譜儀，比較了二極管陣列檢測器和熒光檢測器的分析效果。二極管陣列檢測器的最佳波長為280 nm。熒光檢測器的發射波長為283 nm，激發波長為343 nm。 吸取10 μg/mL標準溶液2 μL，分別應用二極管陣列檢測器和熒光檢測器分析。從圖1、圖2可以看出，基線平穩，目標峰均窄而尖，分離效果較好，二極管陣列檢測器分析10 μg/mL標準溶液的信噪比為1 386，熒光檢測器分析10 μg/mL標準溶液的信噪比為16 120。熒光檢測器的響應強度明顯優于二極管陣列檢測器，因此本試驗選擇熒光檢測器對大豆中的色氨酸進行分析。在樣品分析中，色氨酸目標峰與樣品中的其他雜質峰無干擾，該方法準確可靠。

2.1.2 方法的精密度 取同一產地、同一批次大豆樣品6份，按上述前處理條件做精密度試驗，測定的相對標準偏差小于5.0%，表明本檢測方法重復性較好。

2.1.3 方法的檢出限與定量限 在上述分析條件下，5～100 μg/mL標準曲線范圍內，方程Y=7.27e+006 X+6.21e+006，R=0.999 8。結合大豆樣本稱樣量和定容的體積，以3倍信噪比計算本方法檢出限（LOD） 0.001 2 g/100 g，10倍信噪比計算方法定量限（LOQ）0.003 8 g/100 g。

2.2 水解方法對氨基酸檢測結果的影響

2.2.1 堿水解液的確定 本試驗前處理過程中比較了3種不同的堿水解試劑，分別是含1個結晶水的氫氧化鋰溶液（4 mol/L）、不含結晶水的氫氧化鋰溶液（4 mol/L）、不含結晶水的氫氧化鈉溶液（5 mol/L），分別將其作為提取液對樣品進行添加回收試驗。應用含1個結晶水的氫氧化鋰溶液的樣本回收率為80%～82%。應用不含結晶水的氫氧化鋰溶液的水解效果較好，樣本添加回收率為90%～93%。應用不含結晶水的氫氧化鈉溶液回收率相對較低，為61%～64%。本試驗還比較了不同純度的氫氧化鋰對水解效果的影響，試驗發現，純度越高水解效果越好（表1）。通過比較，本試驗使用了99.9%純度的不含結晶水的氫氧化鋰配置4 mol/L的溶解作為堿提取液。

2.2.2 水解時間的確定 水解18、20、22、24 h對大豆樣本水解效果的影響如圖3所示，隨著水解時間的增加，水解效果逐漸提高，水解20 h和22 h的測定結果沒有明顯差異，優于24 h，考慮110℃高溫水解時間過長會造成色氨酸的損失，為了節省時間及降低水解過程中的目標物降解，最終確定水解時間為20 h。

2.2.3 水解管材質的確定 因強堿溶液不能放置在玻璃容器中，本試驗比較了聚四氟乙烯和聚丙烯材質的2種水解管的水解效果，試驗發現聚四氟乙烯的密封性、耐腐蝕性優于聚丙烯水解管，所以本試驗選用聚四氟乙烯材質的水解管。

2.3 樣品檢測結果

通過超高效液相色譜儀對3個試驗基地的非轉基因大豆和轉基因大豆樣品中的色氨酸進行分析及比較，2組樣本的均值比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05，統計分析使用IBM SPSS 26.0軟件（表2）。轉基因和非轉基因大豆中色氨酸差異無統計學意義（P＞0.05）。轉基因大豆中色氨酸含量不低于非轉基因大豆中的含量，不同產地培植出來大豆的色氨酸含量不存在顯著性差異。

3 結論

本試驗通過對大豆色氨酸分析的堿水解方法和液相儀器條件進行研究，應用高純度氫氧化鋰作為堿水解液進行20 h水解，中和定容、過濾后使用配有熒光檢測器的超高效液相色譜儀進行分析檢測，分析步驟相對簡單，重現性良好，回收率較高。通過對轉基因農作物試驗基地的非轉基因和轉基因大豆樣品中的色氨酸進行檢測，對試驗所得數據進行分析，轉基因和非轉基因大豆中的色氨酸含量穩定，且色氨酸含量不存在顯著性差異，其中的色氨酸可以滿足人體健康需要。

參考文獻

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Tryptophan Content Analysis of Non-transgenic and Transgenic Soybeans

LIU Ting-ting，LI Yan，XU Ze-chao，ZHUO Qin

（National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China）

Abstract：ObjectiveTo establish a new method for the determination of the content of tryptophan in soybeans with the Ultra Performance Liquid Chromatography （UPLC） in order to compare the contents of tryptophan in non-transgenic and transgenic soybeans. MethodThe sample was extracted via the alkaline hydrolysis method with a lithium hydroxide solution. The sample solution went through the processes of constant volume，neutralization and transmembraning before it was measured with UPLC，then the external standard method was used for quantitative analysis." ResultThis experiment that lithium hydroxide was used for alkaline hydrolysis of soybean samples was proved to be effective. The recovery rate was 90%—93% in this method. In the tryptophan analysis of non-transgenic and transgenic soybean samples，the content of tryptophan in transgenic soybean was not lower than that of non-transgenic soybean，and the rich tryptophan can meet the needs of human health. ConclusionThe method is accurate，rapid and reproducible，which is suitable for the detection requirements of tryptophan content analysis in soybeans.

Keywords： tryptophan; soybean; transgenic; non-transgenic

基金項目：轉基因生物新品種培育國家科技重大專項課題“轉基因生物的食用和飼用安全評價技術”（項目編號：2016ZX08011-005）；“耐除草劑轉基因大豆ZH10-6食用安全性評價”（項目編號：2019ZX08013002-006）。

作者簡介：劉婷婷（1985— ），女，碩士，副研究員，研究方向：營養與食品衛生。

通信作者：卓 勤（1969— ），女，博士，研究員，研究方向：營養與食品衛生。