篤斯越橘對(duì)心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)及UPLC-MS分析

摘 要：目的：探討篤斯越橘對(duì)氧化損傷心肌細(xì)胞的作用。方法：以篤斯越橘果實(shí)為原料提取得到粗提物1個(gè)，并進(jìn)一步純化得到4個(gè)柱層析組分，建立H2O2氧化模型，考察提取物及純化產(chǎn)物對(duì)氧化損傷細(xì)胞存活率的影響，并對(duì)最優(yōu)組分進(jìn)行成分分析。結(jié)果：篤斯越橘粗提物及4種純化產(chǎn)物均能提高氧化損傷H9c2心肌細(xì)胞的存活率，其中30%乙醇水溶液洗脫組分效果最好，能有效減少ROS和MDA生成，提高SOD活性；對(duì)該組分進(jìn)行超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）分析，鑒定出花色苷14種。結(jié)論：篤斯越橘果實(shí)提取及純化產(chǎn)物均對(duì)H2O2引起的H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：心肌細(xì)胞；氧化損傷；篤斯越橘；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析；花色苷

氧化應(yīng)激是缺血性心臟病、心力衰竭、高血壓等諸多病理性心血管損傷的共通機(jī)制，在這些疾病發(fā)生過(guò)程中都有過(guò)量的活性氧（ROS）產(chǎn)生，大量積累時(shí)會(huì)引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，致使心肌細(xì)胞凋亡或壞死，而大量心肌細(xì)胞的凋亡和壞死進(jìn)一步加重了疾病的程度［1-4］。減少細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，降低細(xì)胞凋亡對(duì)治療心血管疾病具有重要的意義，采用心肌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)氧化應(yīng)激對(duì)象的研究越來(lái)越多［5-6］。作為重要ROS之一，過(guò)氧化氫（H2O2）易獲得，性質(zhì)比較穩(wěn)定，極容易穿透細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)與鐵離子經(jīng)反應(yīng)形成具有極高活性的自由基，因而漸漸成為細(xì)胞氧化損傷研究的重要工具［7-9］。

篤斯越橘（Vaccinium uliginosum ）為杜鵑花科越橘屬落葉灌木［10］，為我國(guó)分布最廣且儲(chǔ)量最大的野生藍(lán)莓。篤斯越橘果實(shí)形狀多變，成熟時(shí)果皮藍(lán)紫色，有白霜，果肉瑩白多汁，口感細(xì)膩，風(fēng)味酸甜、薄澀，有著悠久的食用歷史及藥用價(jià)值［11］。篤斯越橘果實(shí)中的花色苷和黃酮等活性成分的含量高于部分常見(jiàn)藍(lán)莓品種，抗氧化能力較強(qiáng)［12-13］。近年來(lái)，篤斯越橘因其豐富的活性成分及顯著的功效而受到相關(guān)各領(lǐng)域的關(guān)注和研究。本試驗(yàn)研究了篤斯越橘果實(shí)提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其中主要的花色苷成分進(jìn)行LC-MS分析，以期為我國(guó)野生藍(lán)莓抗心血管氧化損傷的深入研究及開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篤斯越橘，收集于大興安嶺地區(qū)塔河縣；XDA-6樹(shù)脂，南開(kāi)大學(xué)樹(shù)脂廠；H9c2心肌細(xì)胞，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司；CCK-8試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；H2O2、抗壞血酸（維生素C）、活性氧檢測(cè)試劑盒，Sigma公司；胎牛血清，Gibco公司；胰蛋白酶，北京索萊寶；MDA檢測(cè)試劑盒、SOD檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY超高效液相色譜（配備2996 PDA檢測(cè)器和Quattro Premier質(zhì)譜系統(tǒng)），Waters公司；Bio-Rad680 酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices；CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Scientific；CK40倒置顯微鏡（型號(hào)IX51），Olympus公司；cytation 5高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)，美國(guó)BioTek公司；無(wú)菌操作臺(tái)，上海BOXUN；BS210S電子天平，北京Sartorious有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法 采用超聲波輔助提取工藝提取，提取液為體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，料液比為1∶10（W1∶V）、提取溫度設(shè)定40 ℃、提取時(shí)間30 min，提取2次，合并提取液。提取液48 ℃減壓濃縮后凍干得到篤斯越橘花色苷粗提物，標(biāo)記為D0。

1.3.2 純化方法 采用柱層析法對(duì)篤斯越橘提取物進(jìn)行分離純化，通過(guò)固定相介質(zhì)篩選和流動(dòng)相介質(zhì)優(yōu)化，確定了分離的固定相介質(zhì)為XDA-6型介質(zhì)，依次以蒸餾水、10%乙醇水溶液、30%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液、70%乙醇水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，得到4個(gè)分離純化組分，分別標(biāo)記為D1（篤斯越橘10%乙醇洗脫物）、D2（篤斯越橘30%乙醇洗脫物）、D3（篤斯越橘50%乙醇洗脫物）、D4（篤斯越橘70%乙醇洗脫物）。

1.3.3 H2O2損傷模型建立 試驗(yàn)時(shí)選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2心肌細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度約5×103 個(gè)/mL，接種于96孔板內(nèi)，0.1 mL/孔，CO2培養(yǎng)箱設(shè)定為37 ℃、CO2濃度5%，培養(yǎng)24 h。H2O2用DMEM培養(yǎng)基（無(wú)血清）稀釋配制成50、100、200、400、800 μmol/L濃度梯度處理液，分別處理H9c2細(xì)胞1、2、3、4、5、6 h，每組6個(gè)重復(fù)。處理結(jié)束按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.3.4 篤斯越橘提取物最佳濃度選擇 實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2心肌細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，每孔給予不同濃度的篤斯越橘提取物（0、0.1、1.0、10、50、100、200、300、400、500、1 000 mg/L）預(yù)處理1 h后，加入H2O2（400 μmol/L）處理2 h，加入CCK-8測(cè)試液，酶標(biāo)儀于450 nm測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率，每組6個(gè)重復(fù)。

1.3.5 篤斯越橘提取物處理時(shí)間選取 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2心肌細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，篤斯越橘提取物培養(yǎng)不同時(shí)間（0、1、2、4、12、24 h）后加入H2O2（400 μmol/L）處理2 h，加入CCK-8測(cè)試液，450 nm測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率，每組6個(gè)重復(fù)。

1.3.6 不同篤斯越橘提取物純化組分對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2心肌細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，分別加入5種不同篤斯越橘提取物純化組分（D0、D1、D2、D3、D4）和維生素C溶液，培養(yǎng)2 h后加入H2O2（400 μmol/L）處理2 h，加入CCK-8測(cè)試液，450 nm測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率，每組6個(gè)重復(fù)。

1.3.7 H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè) 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2心肌細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)24 h。加入相同濃度（100 mg/L）不同溶液處理，分別標(biāo)記為DH（篤斯越橘提取物D2純化物組）、VH（維生素C組）、CK（空白對(duì)照組）、Model（H2O2模型組）。培養(yǎng)心肌細(xì)胞2 h，加入H2O2濃度400 μmol/L，損傷處理2 h，用無(wú)血清DMEM稀釋DFCH-DA濃度到10 μmol/L，干預(yù)結(jié)束后，在每孔加入1 mL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，再用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液洗3次，高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)分析，每組3個(gè)重復(fù)。

1.3.8 H9c2心肌細(xì)胞丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定 將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)24 h。各組處理方法同1.3.7，取處理后細(xì)胞按照MDA和SOD檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行測(cè)定，每組3個(gè)重復(fù)。

1.3.9 UPLC-MS分析條件 ACQUITY超高效液相色譜，Aeris PEPTTDE XB-C18 色譜柱 （150 × 4.60 mm，3.6 μm，Torrance，CA）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為5%甲酸水溶液，梯度洗脫（0 min，5% A；2 min，7% A；10 min，7% A；20 min，15% A；30 min，80% A；35min，80% A；40 min，5% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為520 nm；流速1.0 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣10 μＬ。正離子模式，掃描m／z 100和1 000之間的離子；毛細(xì)管電壓0.6 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃。

1.3.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 17.0進(jìn)行組間單因素方差分析，并進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異顯著用不同字母標(biāo)記，利用R版本4.1.2加載數(shù)據(jù)包ggplot2進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2濃度和處理時(shí)間對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響

通過(guò)外源H2O2引起細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧，造成氧化應(yīng)激損傷模型。試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度H2O2對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的相對(duì)存活率影響不同。隨著H2O2濃度升高，細(xì)胞相對(duì)存活率降低；400 μmol/L和800 μmol/L濃度下細(xì)胞相對(duì)存活率隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低。在H2O2 濃度為400 μmol/L時(shí)處理2～3 h，心肌細(xì)胞存活率達(dá)到了（49.98±2.33）%，接近50%，表明400 μmol/L的H2O2能誘導(dǎo)適當(dāng)氧化應(yīng)激損傷及細(xì)胞活力，模型穩(wěn)定、易重復(fù)，作為試驗(yàn)中的損傷模型使用（圖1）。

2.2 篤斯越橘提取物濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響

圖2為不同濃度篤斯越橘提取物對(duì)400 μmol/L H2O2氧化損傷處理心肌細(xì)胞存活率的影響。0.1、1、10 mg/L這3個(gè)濃度與單純加入H2O2組細(xì)胞存活率（50.15%）無(wú)顯著差異，而50～500 mg/L篤斯越橘提取物處理過(guò)的心肌細(xì)胞能顯著改善H2O2對(duì)細(xì)胞存活率造成的影響，存活率最高提高至67.89%。濃度為1 000 mg/L時(shí)，心肌細(xì)胞的存活率也與H2O2組達(dá)到顯著性差異，降低至40.54%，表明高濃度篤斯越橘提取物不利于心肌細(xì)胞生存。提取物預(yù)處理濃度范圍100～300 mg/L效果最好，均可極顯著降低H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷，各組間差異不顯著，進(jìn)一步分組試驗(yàn)中取100 mg/L作為提取物試驗(yàn)濃度。

如圖3所示，加入篤斯越橘提取物培養(yǎng)0～24 h均對(duì)心肌細(xì)胞氧化損傷有較好的保護(hù)作用。各時(shí)間分組均與H2O2模型組差異顯著，效果最好為培養(yǎng)時(shí)間2 h組，細(xì)胞存活率63.79%，與H2O2組相比死亡抑制率達(dá)到35.41%，為篤斯越橘提取物培養(yǎng)心肌細(xì)胞最佳試驗(yàn)時(shí)間。

2.3 篤斯越橘花色苷對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)作用

如圖4所示，篤斯越橘各組分及維生素C均有保護(hù)心肌細(xì)胞的作用，細(xì)胞存活率與H2O2模型組比均達(dá)到差異顯著。篤斯越橘中的D2組分表現(xiàn)最好，細(xì)胞存活率為70.17%，與H2O2組相比死亡抑制率達(dá)到37.62%。其次為D3組，細(xì)胞存活率為65.16%，與H2O2組相比死亡抑制率為27.79%。篤斯越橘粗提物D0組的保護(hù)作用最低，與H2O2組相比死亡抑制率僅為6.63%。

常用氧化應(yīng)激化學(xué)誘導(dǎo)劑H2O2能引起細(xì)胞明顯的氧化損傷。在本研究中，H2O2濃度為400 μmol/L時(shí)處理H9c2心肌細(xì)胞2 h，細(xì)胞相對(duì)存活率在50%左右，表明該氧化應(yīng)激細(xì)胞損傷模型成功，結(jié)果與Chen等［14-15］的研究結(jié)果相一致。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，花色苷對(duì)細(xì)胞氧化損傷具有較好的保護(hù)作用，李亞巍等［16］發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓花色苷對(duì)H2O2所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用；劉迪等［17］研究表明，矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)人胚腎HEK-293細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，細(xì)胞活性顯著提高，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，富含花色苷的篤斯越橘提取物處于低濃度（0.1～10 mg/L）時(shí)對(duì)H9c2細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，而50～500 mg/L篤斯越橘提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞活性的降低均有顯著的改善作用。

2.4 篤斯越橘提取物處理可減少H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞ROS生成

通過(guò)DCFH-DA探針檢測(cè)確定經(jīng)由篤斯越橘提取物D2預(yù)處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激ROS水平的影響，如圖5所示，顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光為ROS，與CK組相比，H2O2模型組心肌細(xì)胞中釋放ROS顯著增多（Plt;0.01），DH、VH組則較H2O2組的ROS釋放顯著降低。H2O2組心肌細(xì)胞中熒光強(qiáng)度（417.6±30.7）比CK組增強(qiáng)了456.9%，而DH、VH組的熒光強(qiáng)度則下降為（139.3±16.2）、（142.7±22.1），比H2O2組分別降低了66.64%、65.84%。活性氧是機(jī)體正常的代謝產(chǎn)物，生物體內(nèi)氧化過(guò)程中總是伴隨著ROS的釋放。其存在具有兩面性：低含量的ROS對(duì)機(jī)體具有一定的積極生理作用，殺菌、解毒、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因活性誘導(dǎo)、刺激生長(zhǎng)、分裂和細(xì)胞凋亡等；大量的ROS則會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷［18］。DCF熒光探針?lè)ㄊ峭ㄟ^(guò)DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞膜后水解，被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化生成有熒光的DCF。綠色熒光強(qiáng)度與ROS的水平成正比，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度可分析ROS的水平。結(jié)果表明，篤斯越桔提取物D2和維生素C均能有效清除心肌細(xì)胞內(nèi)的活性氧，降低H2O2帶來(lái)的氧化損傷。

2.5 篤斯越橘提取物處理對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD活性影響

MDA為生物體內(nèi)脂質(zhì)物質(zhì)受自由基氧化生成的最終氧化產(chǎn)物。ROS極易氧化細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸而形成脂質(zhì)自由基，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，引起MDA水平升高，因此MDA水平直接反映了細(xì)胞膜受到自由基氧化損傷的嚴(yán)重程度。由圖6 a可見(jiàn)，H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型組MDA水平與對(duì)照組相比顯著上升（Plt;0.01），表明H2O2模型組的心肌細(xì)胞受刺激后細(xì)胞膜出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷；與H2O2組相比，篤斯越橘提取物和維生素C均能顯著抑制氧化應(yīng)激細(xì)胞中的MDA含量，表明維生素C、篤斯越桔提取物具有對(duì)抗ROS引發(fā)的脂質(zhì)氧化的作用，能有效減輕氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體損傷的活性。

抗氧化酶系在機(jī)體的抗氧化及維護(hù)氧化應(yīng)激動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用。SOD可催化過(guò)氧陰離子產(chǎn)生歧化反應(yīng)清除自由基，因此SOD的活力能間接反映H9c2心肌細(xì)胞清除自由基能力的強(qiáng)弱。如圖6 b所示，與對(duì)照組相比，H2O2組細(xì)胞中SOD活性顯著下降，表明模型組的H2O2破壞了H9c2細(xì)胞的氧化動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)平衡能力，細(xì)胞自身抗氧化代謝調(diào)控能力不足以應(yīng)付外界刺激，細(xì)胞受到嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷；加入篤斯越橘提取物和維生素C的處理組與H2O2組相比SOD酶活性均顯著提高，分別提高68.21%、76.07%，兩者差異不顯著，表明兩種抗氧化活性成分均能減輕H2O2對(duì)細(xì)胞SOD抗氧化酶的破壞，減輕氧化應(yīng)激損傷及提高對(duì)外界氧化應(yīng)激的調(diào)控能力。

2.6 UPLC-MS分析

篤斯越橘提取物D2組分檢測(cè)得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)（圖7、附表），結(jié)合文獻(xiàn)［19-21］分析共鑒定出花色苷14種，其中飛燕草素-3-葡萄糖苷（22.92%）、錦葵素-3-葡萄糖苷（18.38%）、矮牽牛素-3-葡萄糖苷（14.48%）含量較高。綜合分析，飛燕草素類(lèi)花色苷占37.74%、矢車(chē)菊素類(lèi)花色苷占9.4%、矮牽牛素類(lèi)花色苷占17.18%、芍藥素類(lèi)花色苷占2.07%、錦葵素類(lèi)花色苷占21.38%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用心肌細(xì)胞氧化損傷模型，研究篤斯越橘提取物及其純化物對(duì)氧化損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果表明，篤斯越橘果實(shí)提取物及4個(gè)純化物均對(duì)H2O2引起的H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷有一定的保護(hù)作用，其中純化物D2組分表現(xiàn)最好，細(xì)胞存活率為（70.17±3.34）%，與H2O2組相比死亡抑制率達(dá)到37.62%，具有非常好的抗心肌氧化損傷作用，能夠有效減少細(xì)胞ROS產(chǎn)生，提高SOD活性，降低MDA生成，可以進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)為相關(guān)醫(yī)療保健產(chǎn)品。對(duì)D2組分進(jìn)行UPLC-MS分析，鑒定出花色苷14種，其中飛燕草素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-葡萄糖苷和矮牽牛素-3-葡萄糖苷含量較高，是篤斯越橘提取物抗氧化損傷作用中重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

［1］Anchez-Flores M，Marcos-Perez D，Costa S，et al.Oxidative stress，genomic features and DNA repair in frail elderly：a systematic review［J］.Ageing Res Rev，2017（37）：1-15.

［2］田野.活性氧在急性心肌梗死心肌再灌注損傷中的作用和機(jī)制［J］.臨床心血管病雜志，2017，33（7）：611-614.

［3］陳興宇，孫樂(lè)，李艷，等.ROS介導(dǎo)的自噬在心血管疾病中的作用［J］.心臟雜志，2019，31（2）：207-211.

［4］Cadenas S.ROS and redox signaling in myocardial ischemiareperfusion injury and cardioprotection［J］.Free Radic Biol Med，2018（117）：76-89.

［5］羅丹，李玉慈.槲皮黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的抑制作用［J］.中國(guó)藥師，2021，24（6）：1075-1079.

［6］賈增芹，杜勝利，荀志紅，等.穩(wěn)心顆粒對(duì)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡損傷的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2020，29（22）：2405-2410.

［7］MAO C，Lu H，Kong N，et al.Levocarnitine protects H9c2 rat cardiomyocytes from H2O2-induced mitochondrial dysfunction and apoptosis［J］.Int J Med Sci，2013，11（11）：1107-1115.

［8］厲新新，劉麗娟，陳寶石，等.銀杏內(nèi)酯B 對(duì)H2O2誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用［J］.眼科新進(jìn)展，2016，36（9）：822-825.

［9］Peng X，Hu T，Zhang Y，et al.Synthesis of caffeic acid sulfonamide derivatives and their protective effect against H2O2 induced oxidative damage in A549 cells［J］.RSC Advances，2020，10（17）：9924-9933.

［10］宗長(zhǎng)玲，鄧萌，宗成文，等.篤斯越橘研究進(jìn)展［J］.北方園藝，2011（12）：173-176.

［11］蘇上，王麗金，吳杰，等.篤斯越橘化學(xué)成分及其功能活性的研究進(jìn)展［J］.植物學(xué)報(bào)，2016，51（5）：691-704.

［12］Hkkinen SH，Trrnen AR.Content of flavonols and selected phenolic acids in strawberries and Vaccinium species：influence of cultivar，cultivation site and technique［J］.Food Res Int，2000，33（6）：517-524.

［13］Taruscio TG，Barney DL，Exon J.Content and profile of flavanoid and phenolic acid compounds in conjunction with the antioxidant capacity for a variety of northwest Vaccinium berries［J］.J Agric Food Chem，2004，52（10）：3169-3176.

［14］Chen L，Xin X，Yuan Q，et al.Phytochemical properties and antioxidant capacities of various colored berries［J］. J Sci Food Agric，2014（94）：180-188.

［15］薛晉紅.橙皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究［D］.太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2017.

［16］李亞巍，昌盛，王黎明，等.藍(lán)莓花色苷對(duì)過(guò)氧化氫所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2016，27（8）：1830-1831.

［17］劉迪，孫宏宇，時(shí)文艷，等.矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用［J］.食品工業(yè)科技，2019（6）：273-278.

［18］邊云飛.氧化應(yīng)激與心血管疾病［M］.北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2012.

［19］Li R，Wang P，Guo Q，et al.Anthocyanin composition and content of the Vaccinium uliginosum berry［J］. Food Chem，2011（125）：116-120.

［20］Wang E，Yin Y，Xu C，et al.Isolation of high-purity anthocyanin mixtures and monomers from blueberries using combined chromatographic techniques［J］. J Chromatogr A，2014（1327）：39-48.

［21］Ancillotti C，Ciofi L，Pucci D.Polyphenolic profiles and antioxidant and antiradical activity of Italian berries from Vaccinium myrtillus L.and Vaccinium uliginosum L.subsp.gaultherioides （Bigelow）S.B.Young ［J］. Food Chemistry，2016，（204）：176-184.

Protective Effects of Vaccinium uliginosum on Hydrogen Peroxide-induced Cellular Oxidative Stress Injury in Cardiomyocytes and UPLC-MS Analysis

WANG Hua1，LI Meng-sha1，HE Dan-rao1，WANG Chun-li2，ZHOU Li-ping1

（1Institute of Natural Resources and Ecology，Heilongjiang Academy of Sciences/Sino-Finnish Center for Berry Research and Technology，Harbin 150040，China；2 Harbin Examing and Inspection Center for Products Quality，Harbin 150030，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of Vaccinium uliginosum "on oxidative damage of cardiomyocytes.Method One crude extract was extracted from the fruit and further four column chromatographic components were obtained.An H2O2 oxidation model was established to investigate the effects of the extract and purified products on the survival rate of oxidative damage cells，and the optimal components were analyzed.Result The extract of Vaccinium uliginosum "fruit and four column chromatography purified products can improve the survival rate of H9c2 cardiomyocytes.Among them，30% ethanol aqueous solution has the best effect，which can effectively reduce the production of ROS and MDA and improve the activity of SOD.By UPLC-MS analysis，14 kinds of anthocyanins were identified.Conclusion The extract of Vaccinium uliginosum "fruit and four column chromatography purified products have protective effects on the oxidative damage of H9c2 cardiomyocytes caused by H2O2.

Keywords：cardiomyocytes；oxidative damage； Vaccinium uliginosum ；UPLC-MS；anthocyanin

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金聯(lián)合引導(dǎo)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：LH2019C078）；黑龍江省院所基本應(yīng)用技術(shù)研究專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：ZNBZ2020ZR02）；黑龍江省科學(xué)院國(guó)際合作項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：GH2021-ZR01）。

作者簡(jiǎn)介：王 化（1981— ），女，博士，副研究員，研究方向：植物天然產(chǎn)物。

通信作者：周麗萍（1976— ），女，博士，副研究員，研究方向：植物天然產(chǎn)物。