磁性濾料對生物脫氮濾池微生物群落的影響

摘要：使用4種不同磁感應強度的磁性濾料構建生物脫氮濾池，探究磁性濾料對濾池脫氮效能的影響，并從分子生物學角度對影響機理進行解析。結果表明：磁性濾料對濾池的氨氮與亞硝態氮的去除效果有明顯的促進作用；磁性濾料會對濾池內的微生物群落結構產生影響，表面磁感應強度為0.5、1.5 mT的磁性濾料使微生物群落中氨氧化菌與亞硝酸鹽氧化菌的相對豐度顯著提高，表面磁感應強度為2.5 mT的磁性濾料使氫噬胞菌屬和Delftia tsuruhatensis種的相對豐度提高；根據功能基因預測，脫氮效果的提升與磁性濾料對優勢功能基因的作用有關。

關鍵詞：磁性濾料；脫氮濾池；微生物群落；功能基因預測

中圖分類號：TU992.3

文獻標志碼：A

Effect of Magnetic Filter Materials on Microbial Community in Biological Nitrogen Removal Filter

SUN Shaojun1， SHEN Jun2， WANG Xiaoyu3， WANG Jiabin1， SUN Shaofang1， SONG Jian2， LUAN Jiajia4

（1. School of Civil Engineering and Architecture， University of Jinan， Jinan 250022， Shandong， China; 2. Shandong Academy of Environmental Sciences Co.， Ltd.， Jinan 250013， Shandong， China; 3. China Nonferrous Metals Processing Technology Co.， Ltd.， Luoyang 471000， Henan， China; 4. Department of Logistics Service， Weifang Vocational College， Weifang 262737， Shandong， China）

Abstract： Four kinds of magnetic filter materials with different magnetic field intensities were used to construct a biological filter， the influence of magnetic filter materials on nitrogen removal efficiency of the filter was explored， and the influence mechanism was analyzed from the perspective of molecular biology. The results show that the magnetic filter materials can significantly promote the removal of ammonia nitrogen and nitrite nitrogen in the filter. The magnetic filter materials can affect microbial community structure in the filter. Magnetic filter materials with surface magnetic field strengths of 0.5 mT and 1.5 mT significantly increase relative abundance of ammonia oxidizing bacteria and nitrite oxidizing bacteria in the microbial community， and magnetic filter materials with surface magnetic field strength of 2.5 mT increase relative abundance of Hydrogenophaga and Delftia tsuruhatensis species. According to functional gene prediction， improvement of nitrogen removal effect is related to effect of magnetic filter materials on dominant functional genes.

Keywords： magnetic filter material; nitrogen removal filter; microbial community; functional gene prediction

收稿日期：2021-12-28 網絡首發時間：2022-03-25T15∶53∶38

基金項目：國家自然科學基金項目（51678276）；濟南大學科技計劃項目（XBS2001）

第一作者簡介：孫紹鈞（1996—），男，山東青島人。碩士研究生，研究方向為市政工程。E-mail：717644357@qq.com。

通信作者簡介：王嘉斌（1979—），男，山東濟南人。教授，博士，碩士生導師，研究方向為市政工程。E-mail：cea_wangjb@ujn.edu.cn。

網絡首發地址：https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1378.N.20220325.1035.004.html

水體的氮污染是一個普遍且嚴重的水環境問題，一直威脅著人類社會飲水及生產需求與生存環境^［1-2］。生物脫氮被認為具有較高的成本效益，為了提高生物脫氮效率，近年來諸多學者相繼開展了相關的研究^［3-4］。

目前許多研究結果表明，磁場有利于提高微生物活性，進而促進生物脫氮效果。Xu等^［5］發現，磁場刺激了硝化細菌亞硝酸菌屬、硝化螺旋菌、反硝化細菌膠菌屬、脫氯單胞菌等在脫氮過程中起重要作用的功能菌。相關研究發現，靜態磁促進了電子傳遞活性^［6］，納米級四氧化三鐵磁性粉末能夠提高污水處理中微生物活性^［7］，磁場能夠提高革蘭氏陰性菌的含量，從而提高微生物群落對寒冷環境的適應性^［8］。磁性填料有利于微生物附著生長，Dixon等^［9］構建了一種生物量較大的曝氣磁性生物膜反應器，而厚磁性生物膜反應器的脫氮效率比對照懸浮生長生物反應器好得多。生物濾池是生物膜法中較為高效的處理方式，但目前對于生物濾池方面的磁場影響研究卻很少。

本文中使用磁性濾料構建生物脫氮濾池，研究磁性濾料對濾池脫氮效能的影響，探究其作用機理，解析磁性濾料對微生物群落結構與功能基因的影響規律。

1 材料與方法

1.1 磁性濾料

本文中使用2種磁性濾料，分別是濾料a和濾料b。濾料a為復合磁性濾料，其表面磁感應強度為0.5 mT，粒徑為5 mm；濾料b的磁感應強度為2.5 mT，為直徑為3～5 mm的不規則顆粒，使用矩形永磁鐵通過物理超壓鍛造和研磨制成。

1.2 反應器的構建

反應器由有機玻璃制成，為4個完全相同的上流式濾柱，直徑為5 cm，高度為120 cm，有效容積為1.96 L，承托層厚度為20 cm，濾料層厚度為80 cm。接種污泥取自濟南市某大型污水廠的回流污泥區污泥。4個反應器由不同的濾料來填充，分別為反應器R₀（普通陶粒，不含任何磁性物質）、反應器R₀.5（磁性濾料a，磁感應強度為0.5 mT）、反應器R₁.5（磁性濾料a、b混合，磁感應強度為1.5 mT）和反應器R₂.5（磁性濾料b，磁感應強度為2.5 mT）。

1.3 模擬污水

反應器進水為模擬污水，氯化銨提供氮氨（NH+₄-N），亞硝酸鈉提供亞硝態氮（NO-₂-N），碳酸氫鈉既可提供無機碳源，又可提供所需堿性環境。進水pH調控在7.96±0.02，NH+₄-N質量濃度為25～30 mg/L，NO-₂-N質量濃度為33～48 mg/L，逐漸提高進水的含氮量以促進脫氮細菌的增長。

1.4 高通量測序

利用Illumina NovaSeq測序平臺研究靶向細菌16S rRNA（核糖體核糖核酸）基因高變區V4的檢測。從實驗運行結束后的反應器混合濾料中提取生物膜，進行擴增與測序，聚合酶鏈式反應（PCR）擴增引物為515F （GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和806R （GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。經過拼接過濾，操作分類單元（OTUs）聚類，進行物種注釋及豐度分析。利用京都基因與基因組百科全書（KEGG）數據庫與基因功能預測軟件PICRUSt推斷不同菌群的潛在功能。使用R語言（4.1.0）進行主坐標分析（PCoA）與熱圖繪制^［10］，通過生物科學數據分析軟件Cytoscape（3.9.0）進行網絡分析的可視化。

2 結果與分析

2.1 反應器處理效果

圖1所示為不同反應器對模擬污水的處理效果。可以看出：4臺反應器接種污泥啟動，25 d左右均達到了較好的氨氮去除效果［見圖1（a）］，尤其是反應器R₂.5，在25 d左右氨氮去除率達到了97%以上［見圖1（b）］。而在25～60 d，各個反應器氨氮去除率不斷下降，但亞硝態氮的去除能力不斷提升［見圖1（c）—（d）］。3臺使用磁性濾料反應器的氨氮去除率在60 d開始回升，而反應器R₀的氨氮去除率直到65 d仍在下降。在65～105 d，4臺反應器氨氮與亞硝態氮處理效果不斷提升，但與此同時硝態氮的累積量也不斷增大［見圖1（e）］。在100～105 d，4臺反應器處理效果達穩定，根據后續微生物群落分析可知，此時反應器進行的反應以硝化、亞硝化與反硝化反應為主，3組使用磁性濾料的反應器的氨氮與亞硝態氮處理效果明顯優于空白對照組的，反應器R₀.5、R₂.5優勢明顯，其中反應器R₀.5的磁性濾料對氨氮的去除效果最好，反應器R₂.5的磁性濾料對亞硝態氮的去除效果最好。

2.2 微生物群落研究

使用擴增子分析工具QIIME（Version 1.9.1）計算Chao 1指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson指數4項α多樣性指標和Good覆蓋度指數，對每個樣本的覆蓋度的多樣性估計如表1所示。在本研究中，Good覆蓋度指數在所有樣品的覆蓋率均為0.995，表明測序深度可以反映4個反應器內真實微生物群落。在長期穩定運行后，反應器R₂.5中的微生物豐富度（由Chao 1指數和ACE指數估計）和多樣性（由Shannon指數和Simpson指數估計）明顯低于其他3個反應器的，可能是該反應器磁場較強所致。而其他3個反應器中的總體微生物多樣性和豐富度相似，因此還需要進一步比較微生物組成，揭示有關微生物群落差異的更多信息。

不同反應器中細菌群落的主坐標分析結果見圖2。反應器R₀.5、R₁.5的群落結構比較接近，且與反應器R₀、R₂.5有較大差別。為了更好地了解磁性濾料對微生物群落和組成的影響，對Illumina NovaSeq測序平臺獲得的序列讀數在門、綱和屬水平上進行了系統分析，如圖3所示。從門水平上看，4個反應器中檢索到37個門，優勢門見圖3（a）。變形菌門是樣本中最豐富的門，分別占64.74%、55.92%、51.25%、91.39%。根據反應器R₀、R₀.5、R₁.5的變形菌門分布情況可知，磁感應強度為0～1.5 mT時，變形菌門的相對豐度隨磁感應強度增強而減小，厚壁菌門、硝化螺旋菌門、擬桿菌門的相對豐度隨磁感應強度增強而有不同程度上升。磁感應強度為2.5 mT時，變形菌門在生物群落中具有極強的優勢，相對豐度達到了90%以上。一定磁感應強度的磁場有利于維持變形菌門的穩定性^［11］。

從綱水平上看［見圖3（b）］，α變形菌綱與γ變形菌綱是樣本中最豐富的綱，磁感應強度為0～1.5 mT時，γ變形菌的相對豐度隨磁感應強度增強而下降，α變形菌綱、擬桿菌綱、梭菌綱、硝化螺旋菌綱的相對豐度隨磁感應強度增大而有不同程度增加。在磁感應強度為2.5 mT時，γ變形菌綱具有極強的優勢，相對豐度達到68.74%，明顯大于其他反應器。

陶厄氏菌屬是短程反硝化的重要功能菌屬，能夠將硝態氮轉化為亞硝態氮^［12-14］。如圖3 （c）所示，陶厄氏菌屬在反應器R₀中的相對豐度為16.44%，而在反應器R₀.5、R₁.5、R₂.5的相對豐度為4.46%～6.21%，在磁性濾料的作用下，陶厄氏菌屬的相對豐度大幅減小，導致反應器R₀出水中硝態氮濃度低于反應器R₀.5、R₁.5、R₂.5的。亞硝化菌屬是一種重要的氨氧化菌（AOB），不明的硝化螺旋菌屬則屬于亞硝酸鹽氧化菌（NOB）。其中亞硝化菌屬在4個反應器的相對豐度分別為2.29%、4.57%、3.12%和2.79%，可見在磁感應強度為0.5 mT濾料的影響下，亞硝化菌屬最具優勢，隨著磁場的增強，亞硝化菌屬相對豐度有減小的趨勢，與2.1節中反應器R₀.5具有最高氨氮去除率的結果一致。不明的硝化螺旋菌屬在4個反應器的相對豐度分別為2.11%、4.43%、7.22%、1.59%，由此可知，隨著磁感應強度增強，不明的硝化螺旋菌屬的相對豐度先呈增大趨勢，在磁感應強度為1.5 mT時達到最大，但在磁感應強度為2.5 mT時相對豐度反而減小。

代爾夫特菌屬通常被認為是反硝化菌，可以將硝酸鹽還原成其他氮氧化物^［15］。在實驗中富集的代爾夫特菌種多為Delftia tsuruhatensis（見表2）。相關研究表明，Delftia tsuruhatensis是貧營養型好氧反硝化菌，而且能夠降解氨氮^［16-17］，以亞硝態氮為底物進行反硝化。在反應器R₂.5中Delftia tsuruhatensis的相對豐度較大，達到了18.92%，顯著大于其他反應器的，這是導致反應器R₂.5中氨氮與亞硝態氮去除率大于反應器R₀、R₁.5的原因之一。氫噬胞菌屬可以進行厭氧呼吸，以硝酸鹽為電子受體進行還原反應^［18］，在反應器R₂.5中的相對豐度也明顯大于其他反應器的，說明反應器R₂.5具有更強的反硝化能力，對硝態氮有更好的去除效果。反應器R₂.5出水中硝態氮濃度較高，說明其具有更強的硝化能力，產生的硝態氮更多。

2.3 基因功能預測分析

使用基因功能預測軟件PICRUSt推斷脫氮濾池系統中的細菌潛在功能，不同反應器中一級細菌功能預測的分布見圖4。由圖可見，在細菌功能預測頂層，代謝（相對豐度為49.50%～48.89%）是每個反應器中的主要功能基因類別，其次是遺傳信息處理（相對豐度為14.39%～16.10%），環境信息處理和細胞過程也是主要的類別，而人類疾病和有機體系統的相對豐度低于1.20%。值得一提的是，仍有13.80%～14.26%的功能基因屬于未分類，表明存在一些其他功能。根據不同反應器中細菌功能預測的主坐標分析（見圖5），使用磁性濾料的反應器R₀.5、R₁.5、R₂.5中微生物群落功能與反應器R₀有顯著差異，為此進一步研究了功能子類別（二級）的41個細菌潛在功能基因，結果見圖6。

細胞運動在反應器R₂.5中較豐富。膜運輸是每個樣品中環境信息處理的主要途徑，相對豐度為11.34%～12.61%，在每個反應器中都很豐富。在不同磁性強度的濾池中，遺傳信息處理類的復制和修復也很豐富，翻譯在反應器R₀、R₀.5與R₁.5中較豐富。代謝類的氨基酸代謝（相對豐度為10.23%～10.64%）、碳水化合物代謝（相對豐度為9.58%～9.93%）和能量代謝（相對豐度為5.26%～6.02%）較豐富。輔助因子和維生素代謝在反應器R₀、R₀.5與R₁.5中較豐富，脂質代謝和外源性生物降解和代謝在在反應器R₂.5中較豐富。而人類疾病與有機體系統方面的功能基因含量較低。

為了進一步探究磁性濾料對功能基因與處理效能的影響，篩選了相對豐度大于1%的功能亞類（二級）細菌功能，進行了基于Spearman相關系數的網絡分析，如圖7所示，其中Spearman相關系數ρ≥0.8。研究發現，磁性濾料對氨基酸代謝、脂質代謝功能基因有促進作用，進而促進了氨氮去除與亞硝態氮轉化。磁性濾料對不佳特征、折疊、分類和降解的功能基因有抑制作用，而此2種功能基因與氨氮去除率與亞硝態氮轉化率呈負相關，可知磁性濾料通過對2種基因的抑制促進了氨氮去除與亞硝態氮轉化。相比較其他反應器，氨基酸代謝、異生素生物降解和代謝與脂質代謝3種功能基因在反應器R₂.5中豐富，同時3種功能基因與亞硝態氮轉化率呈正相關，這可能是反應器R₂.5出水中硝態氮濃度較高的原因之一。

3 結論

磁性濾料改變了濾池中主要脫氮細菌的組成，促進了脫氮濾池的脫氮效果。使用磁性濾料的反應器R₀.5、R₁.5中，屬于AOB的亞硝化菌屬與屬于NOB的不明硝化螺旋菌屬的相對豐度顯著增大，反應器R₂.5中具有厭氧反硝化能力的氫噬胞菌屬、具有氨氮去除能力的貧營養型好氧反硝化菌Delftia tsuruhatensis種的相對豐度顯著增大，進而提高了脫氮濾池的氨氮與亞硝態氮去除效果。功能基因預測分析表明，磁性濾料可以通過對優勢功能基因的作用提升生物濾池的脫氮效果。

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（責任編輯：于海琴）