固本解毒方調控肺腺癌免疫微環境的分子機制研究及實驗驗證

郭宵飛 張 平 白建琦 楊 晨 李靜靜 歐陽琴 鄧曉曦 郭家敏 朱冬菊 王 源

(1 中國中醫科學院望京醫院病理科,北京,100102; 2 北京市海淀醫院中醫科,北京,100080)

腫瘤微環境(Tumor Microenvironment,TME)的概念部分來源于Steven Paget的“種子和土壤”假說,它指的是腫瘤或腫瘤干細胞所存在的細胞環境等[1-2],在腫瘤發生、進展以及轉移的過程中起著重要作用。腫瘤免疫微環境(Tumor Immune Microenvironment,TIME)是腫瘤微環境里的重要部分。腫瘤細胞是TIME的主要細胞成分,它可通過分泌腫瘤抗原或影響免疫細胞的代謝環境,從而影響免疫細胞的功能[3],促進腫瘤的進展。據統計,2018年全球有209.4萬例新增肺癌病例,這使肺癌成為全球發病率最高的癌病,而肺腺癌是肺癌中最主要的類型,約占所有肺癌的40%[4],研究TIME的干預途徑對于肺癌的治療有著重要意義。

中藥在疾病的治療中有著多靶點多通路的特點,在激活免疫細胞,介導信號轉導從而發揮對腫瘤免疫微環境的整體調節作用的同時[5],還可減少放化療及免疫治療等傳統治療的不良反應。目前關于中藥作用于TIME的分子機制研究尚不足。固本解毒方為中國中醫科學院樸炳奎教授治療肺癌的經驗方,在肺腺癌的臨床治療中有著良好效果,方中的北沙參、黃芪等均與免疫細胞的激活與抑制有著密切聯系[6-7]。前期研究發現,固本解毒方對肺腺癌A549細胞的增殖和轉移均有較好的抑制作用[8],但其對肺腺癌免疫微環境的作用通路和機制等尚缺乏進一步探討。網絡藥理學是信息化時代中藥研究的前沿學科,隨著網絡藥理學的使用日益規范化,其影響力及應用價值不斷升高[9]。本研究通過網絡藥理學方法的方法初步篩選固本解毒方作用于肺腺癌免疫微環境的候選活性成分、潛在作用靶點及相關通路等,并通過分子對接及動物實驗初步驗證,為固本解毒方調節肺腺癌免疫微環境的臨床應用及后續研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 本研究所需小鼠購自北京唯尚立德生物科技有限公司,共購入40只6～8周齡雌性免疫缺陷小鼠(NOD/SCID/IL2 Rγ-/-,NSG),體質量(18±2)g[許可證號為SCXK(京)2021-0010],并于北京唯尚立德生物科技有限公司飼養[許可證號SYXK(京)2021-0056],自由食水,溫度(22±3)℃,濕度40%～80%,晝夜明暗交替12 h。動物實驗方案已通過該公司倫理委員會審核(倫理審批號:VS212600907)。

1.1.2 藥物 固本解毒方中藥飲片購自中國中醫科學院望京醫院,由王景紅主任藥師鑒定為正品。中藥飲片:北沙參(批號:2107012)、桔梗(批號:20210514)、黃芪(批號:21062512)、當歸(批號:2107020)、續斷(批號:c4111511)、骨碎補(批號:2103075)、牛膝(批號:2105034)、補骨脂(批號:c5091411)、太子參(批號:21020301)、半枝蓮(批號:c3161341)、土茯苓(批號:c21031401)、白花蛇舌草(批號:20210720)、甘草(批號:2112068)。固本解毒方藥物組成為北沙參20 g、桔梗9 g、黃芪30 g、當歸10 g、續斷10 g、骨碎補10 g、牛膝10 g、補骨脂10 g、太子參15 g、半枝蓮20 g、土茯苓20 g、白花蛇舌草15 g、甘草6 g。將中藥飲片加水浸泡2 h后煎煮至含生藥量0.7 g/mL(低劑量組)、1.4 g/mL(中劑量組)、2.8 g/mL(高劑量組),并于4 ℃冰箱分別保存。

1.1.3 試劑與儀器 洛斯維·帕克紀念研究所1640(Roswell Park Memorial Institute 1640,RPMI-1640)培養基、細胞凍存液、無菌磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffer Saline,PBS)(北京索萊寶公司,貨號分別為31800、24800、P1020-500),0.25%胰蛋白酶、胎牛血(Hyclone公司,美國,貨號分別為SH30042.01、SH30070.03),二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶公司,貨號:PC0020),信號轉導及轉錄激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3)抗體、促分裂原活化的蛋白激酶P38(Mitogen-activated Protein Kinase P38,P38 MAPK)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)抗體(武漢三鷹生物技術有限公司,貨號分別為10253-2-AP、14064-1-AP、10494-1-AP)、胞外信號調節激酶1/2(Extracellular Regulated Kinase1/2,ERK1/2)抗體(武漢博士德生物工程有限公司,貨號:BM4326),磷酸化胞外信號調節激酶1/2(Phosphorylated Extracellular Regulated Kinase1 1/2,p-ERK1/2)抗體(北京博奧森生物技術有限公司,貨號:bs-3016R),羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(北京博奧森生物技術有限公司,貨號分別為bs-0295G-HRP、bs-0296G-HRP),乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid,EDTA)抗原修復液(北京中杉金橋生物技術有限公司,貨號:21110203),人肺腺癌A549細胞由美國克利夫蘭州立大學Aimin Zhou實驗室提供,電泳儀、電轉儀(Bio-rad,美國,貨號分別為1645070、BE6085)。

1.2 方法

1.2.1 固本解毒方的候選活性成分與靶點預測 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)檢索固本解毒方中除補骨脂外各味中藥的化學成分,以口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%且類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18為條件進行篩選[10],獲得各味中藥的候選活性成分。利用中藥分子機制生物信息學分析工具平臺(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine,BATMAN-TCM)以Score cutoff=20,P-value=0.05為條件篩選補骨脂的主要候選活性成分,將其候選活性成分輸入Swiss ADME平臺(http://www.swissadme.ch/),設置潛在核心化合物的標準為:1)腸胃吸收顯示為“High”;2)5類藥性預測結果中有2個及2個以上顯示為“Yes”,保留符合以上條件的成分[11]。將中藥候選活性成分的2D結構輸入Swiss Target Prediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/),初步預測固本解毒方的潛在作用靶點。

1.2.2 肺腺癌和腫瘤免疫微環境相關靶點的篩選 分別以“lung adenocarcinoma”“tumor immune microenviroment”為關鍵詞在GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫以及DisGeNET(https://www.disgenet.org/)數據庫中進行疾病相關靶點的篩選。GeneCards數據庫收集多個數據庫以及科學文獻、組學數據,數據整合度好,在GeneCards中分別檢索肺腺癌和TIME的相關靶點,并以相關性分數(Relevance score)排序,分別以大于3倍中位數、2倍中位數為篩選條件[12],去除重復項后得到肺腺癌和TIME候選疾病靶點。DisGeNET數據庫根據多個數據庫整合了人類基因-疾病關聯。在DisGeNET數據庫中檢索疾病靶點,并以Score_gda值大于0.1的靶點為候選疾病靶點。通過Uniprot(https://www.uniprot.org/)數據庫規范疾病相關靶點的名稱后取交集獲得肺腺癌免疫微環境的相關靶點。

1.2.3 蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網絡的構建 將固本解毒方、肺腺癌以及TIME的相關靶點取交集,獲得固本解毒方干預肺腺癌免疫微環境的潛在作用靶點,輸入PPI數據庫(Search Tool for the Retrieval of Interaction Gene/Proteins,STRING)(https://string-db.org)數據庫,將物種選擇為“Homo sapiens”,最小互相作用閾值調至為Highest confidence(0.9),并隱藏游離節點,獲得潛在作用靶點的PPI網絡,最后利用Cytoscape 3.7.1軟件對獲得的PPI網絡進行可視化。用CytoNCA插件分析節點交互關系,計算中心性(Degree Centrality,DC)、介度中心性(Betweenness Centrality,BC)、接近中心性(Closeness Centrality,CC)等值,并計算上述所有值的中位數,移除低于中位數的目標獲得核心潛在作用靶點。將獲取的藥物候選活性成分、潛在作用靶點等數據導入Cytoscape軟件,構建中藥-候選活性成分-潛在靶點網絡并進行拓撲分析,得出核心候選活性成分。

1.2.4 富集分析 通過DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)對固本解毒方與肺腺癌、TIME的交集靶點進行基因本體(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號通路分析,分析潛在作用靶點所涉及的生物學功能以及相關聯的通路。

1.2.5 固本解毒方藥理作用特點分析 將固本解毒方干預肺腺癌免疫微環境的潛在作用靶點進一步通過馬爾可夫聚類算法進行聚類分析,根據各分組對應的通路及病理環節研究固本解毒方的具體藥理作用特點。

1.2.6 候選活性成分-核心潛在作用靶點分子對接驗證 利用蛋白數據庫(Protein Data Bank,PDB)(https://www.rcsb.org)及PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)分別下載核心靶點的晶體結構、核心候選活性成分的2D結構,應用Autodock Vina及AutoDockTools 1.5.6軟件對其進行分子對接,分子對接結果用PyMOL軟件進行可視化。

1.3 實驗驗證

1.3.1 分組與模型制備 將小鼠按隨機數字表法隨機均分為空白組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組,每組8只。將人肺腺癌A549細胞懸液推注入小鼠尾部靜脈造模[13]。

1.3.2 給藥方法 根據人與動物體表面積換算比值計算灌注劑量,中藥低、中、高劑量組小鼠灌注劑量分別為13.875 g/(kg·d)、27.75 g/(kg·d)、高55.5 g/(kg·d),2次/d,持續3周,模型組以生理鹽水灌胃。在禁食不禁水12 h后將各組小鼠腹腔注射1%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉,仰臥固定開胸,快速游離出小鼠的肺臟組織放入凍存管,迅速置于液氮罐內,后轉移至-80 ℃冰箱凍存用于蛋白質印跡法檢測,部分用4%的多聚甲醛液進行固定,常規脫水后石蠟包埋。

1.3.3 免疫組織化學檢測 將各組小鼠的石蠟包埋組織以2.5 μm為標準切片,用二甲苯及乙醇脫蠟、脫水,檸檬酸抗原緩沖液抗原修復后根據SP法對石蠟標本進行一抗P38MAPK(1∶150)、STAT3(1∶200)、ERK1/2(1∶50)、p-ERK1/2(1∶200)37 ℃孵育過夜,最后顯色及封片后在光學顯微鏡下觀察。用Image J軟件對各組小鼠切片的染色強度進行半定量分析,結果以平均光密度值表示。

1.3.4 蛋白質印跡法檢測 將各組凍存的樣本取出置于冰上裂解,離心后測定蛋白質濃度,95 ℃煮5 min后上樣,行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳(Sodium Dodecylsulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)電泳,在4 ℃下以200 mA 90 min為條件轉膜,室溫搖床封閉2 h后加一抗P38MAPK及STAT3(1∶2 000)4 ℃孵育過夜,洗膜,加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。顯色曝光后使用Image J軟件分析灰度值。

2 結果

2.1 固本解毒方的候選活性成分及其相關靶點 通過篩選共獲得固本解毒方候選活性成分251種,經初步預測共獲得895個固本解毒方的候選作用靶點。

2.2 疾病的相關靶點 經合并去重后分別得到肺腺癌及TIME相關靶點1 785個、1 736個,交集靶點共884個,將其與固本解毒方的候選作用靶點取交集之后得到固本解毒方作用于肺腺癌免疫微環境的潛在作用靶點217個。見圖1。

圖1 固本解毒方和肺腺癌、腫瘤免疫微環境的交集靶點

2.3 PPI網絡的構建及核心靶點的篩選 所獲取的潛在作用靶點構建PPI網絡,網絡節點大小、顏色透明度與度值的高低正相關,將度值≥20的潛在作用靶點進行可視化展示。見圖2。利用CytoNCA插件篩選后獲得核心潛在作用靶點STAT3、MAPK14、MAPK1、MAPK3等,核心候選活性成分主要包括槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、柚皮素(Naringenin)等。

2.4 潛在作用靶點基因的富集分析 GO富集分析結果涉及232個生物過程、130個細胞組分、152個分子功能,其中生物過程主要涉及信號轉導、凋亡過程負向調控、細胞增殖正向調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控等。細胞組分主要涉及細胞溶質、細胞質、細胞核、質膜等。分子功能主要涉及蛋白質結合、ATP結合、相同的蛋白質結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等。KEGG通路富集共獲取相關通路169條,涉及到的通路主要為癌癥相關通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase/Protein Kinase B,PI3K-AKT)信號通路、MAPK信號通路、癌癥中的蛋白聚糖等。

圖2 潛在作用靶點的PPI網絡

2.5 固本解毒方藥理作用特點分析 通過馬爾可夫聚類算法聚類分析后可將固本解毒方干預肺腺癌免疫微環境的潛在作用靶點主要分為4個靶點網絡。見圖3。分別與信號轉導失常、內分泌代謝紊亂、細胞周期異常、病毒感染及免疫功能異常等相關。

2.6 藥物主要候選活性成分與潛在的核心作用靶點分子對接 分子對接結果顯示,各組結合能均<-5.0 kcal/mol(1 cal=4.184 J)。Beta-sitosterol與MAPK14的結合能最高,結合能<-9.0 kcal/mol,并且其與STAT3、MAPK1、MAPK3的結合能均<-7.0 kcal/mol,將此4組分子對接結果進行可視化分析。見表1,圖4。

圖3 固本解毒方藥理作用特點分析

表1 主要候選活性成分結合能(kcal/mol)

圖4 分子對接3D模式圖

2.7 固本解毒方對肺腺癌小鼠組織中ERK1/2、p-ERK1/2、P38 MAPK、STAT3蛋白表達的影響 與模型組比較,固本解毒方低、中劑量組ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3蛋白表達均有所下降(P<0.05),固本解毒方低、中、高劑量組P38 MAPK蛋白表達均有所上升(P<0.05),低劑量固本解毒方影響最為顯著。見圖5,表2。

與模型組比較,固本解毒方低劑量組中STAT3蛋白表達水平顯著下降(P<0.01),固本解毒方低、中、高劑量組中P38 MAPK的蛋白表達量均顯著提高(P<0.001)。見圖6,表3。

圖5 各組核心蛋白的表達情況(免疫組織化學染色法,×400)

表2 各組核心蛋白表達情況的平均光密度值分析

圖6 STAT3;MAPK14蛋白表達電泳

表3 各組中STAT3、P38 MAPK蛋白表達電泳的灰度值分析

3 討論

研究發現,TIME與免疫治療效果相關,提高免疫治療的療效需要更好地理解TME中免疫細胞的免疫調節作用[14]。在中醫理論體系中,肺癌屬“肺積”“積聚”等范疇。在《醫宗必讀》中對積聚的成因描述為“積之成者,正氣不足,而后邪氣踞之”。由此可見在中醫的治療理念中,肺癌的治療應著眼于“正氣不足”,也就是現在的免疫抑制[15-16]。中藥在腫瘤的治療中具有調節改善機體的免疫水平以及細胞功能,重塑其免疫表型,逆轉TIME的作用[17],但是關于中藥調節肺腺癌免疫微環境的分子機制和信號通路等方面的研究尚且不足。

本研究發現,固本解毒方干預肺腺癌免疫微環境的主要候選活性成分為槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素等。現代研究發現,槲皮素、山柰酚等活性成分與多種腫瘤疾病相關,如劉鑫等[18]在研究當歸補血湯治療肺癌篩選出的主要活性成分也包含槲皮素、山柰酚,而馬雪等[19]在研究大瀉心湯治療肺癌的作用機制時,也發現槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、柚皮素等與肺癌的發生發展密切相關,本研究進一步說明了槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、柚皮素等活性成分在肺癌治療中的核心價值。槲皮素為黃酮醇之一,能有效阻止腫瘤細胞周期,促進其細胞凋亡,抑制其血管生成和轉移,另外,它還能通過增加免疫細胞數量或調節免疫細胞內的胞內信號通路從而發揮免疫調節的作用[20]。山柰素可見用于化療,有著抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性,部分研究表明山柰酚可以增強T細胞的抑制功能,這說明山柰素可作用于人類自身的免疫性疾病[21]。β-谷甾醇有著較強的免疫調節功能,實驗發現,β-谷甾醇可以增強巨噬細胞的免疫作用[22]。柚皮素有著多種藥理活性,如抗癌、降糖、保肝等,柚皮素可以提高免疫力,修復DNA損傷,清除自由基[23]。由此可見,在肺癌等腫瘤疾病的治療中,調節免疫細胞功能以及免疫細胞內的胞內信號通路等可能是槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素等活性成發揮作用的重要方式。

固本解毒方干預肺腺癌免疫微環境的核心潛在作用靶點包括STAT3、MAPK14、MAPK1、MAPK3等。STAT3參與細胞增殖、存活、分化、血管生成等多種生物過程[24],大量的臨床研究發現,STAT3的過度激活會降低免疫刺激因子的表達,同時增加某些細胞因子和生長因子的表達,從而產生深遠的免疫效應[25]。MAPK1(ERK2)、MAPK3(ERK1)和MAPK14均是MAPK家族轉導信號的重要環節[26-28]。ERKs是腫瘤免疫抵抗和免疫逃逸的多效調節因子[29],其中ERK1/2的激活主要與免疫抑制特性相關,涉及幾乎所有已知的決定免疫抵抗或免疫逃逸的成分,通過抑制腫瘤細胞中的ERK1/2可以逆轉化療耐藥和腫瘤誘導的免疫抑制。抑制ERK/STAT3信號通路還可阻斷乳酸誘導M2巨噬細胞極化推動腫瘤的生長和血管生成的進程[30]。MAPK14在正常免疫和炎癥反應中都發揮著重要作用。現有研究認為MAPK14的高表達促進了腫瘤的發生,但也有研究表明,MAPK14在人肺腫瘤中的表達比正常人肺組織低3倍以上,Mapk14的缺失會影響其對肺干和祖細胞功能的調控,誘發肺腫瘤的發生[31]。通過免疫組織化學以及蛋白質印跡法檢測部分潛在核心靶點,研究發現固本解毒方可顯著抑制或上調STAT3、ERK1/2、p-ERK1/2、MAPK14等蛋白的表達,這進一步證明了STAT3等靶點在固本解毒方干預肺腺癌免疫微環境中發揮了重要作用。

根據KEGG通路富集分析結果,固本解毒方干預肺腺癌免疫微環境涉及到的主要通路有PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路等。既往研究發現,PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路與癌癥以及自身免疫系統疾病均有密切的關聯。PI3K/AKT信號通路在腫瘤的發生、增殖、侵襲、轉移以及免疫微環境等均存在著密切的關聯[32],研究發現,多種藥物免疫功能的發揮均與PI3K/AKT通路的激活相關[33]。朱冬菊等[8]研究發現固本解毒方肺癌抑制A549細胞遷移與調控PI3K/AKT信號通路密切相關。MAPK信號通路的異常是多種腫瘤發生的誘因之一,它與細胞分化、增殖、侵襲、血管生成、凋亡和轉移等腫瘤發生的多個方面相關[34]。

根據馬爾可夫聚類算法對潛在作用靶點聚類分析的結果,固本解毒方在調節肺腺癌免疫微環境的過程中,或許是通過促進信號轉導、調節內分泌代謝、穩定細胞周期、抗病毒感染等改善免疫微環境,激活免疫功能,從而發揮了抗腫瘤的作用,這進一步揭示了固本解毒方在調節肺腺癌免疫微環境中的作用機制。

本研究通過網絡藥理學的方法,初步探索了固本解毒方干預肺腺癌免疫微環境的作用機制,并通過分子對接及動物實驗進行了初步驗證。研究結果表明,固本解毒方調節肺腺癌免疫微環境的主要是通過槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素等核心候選有效成分作用于STAT3、MAPK14、MAPK1、MAPK3等核心潛在作用靶點從而促進信號轉導、調節內分泌代謝、穩定細胞周期、抗病毒感染發生的,這一過程與PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路密切相關。本研究初步揭示了固本解毒方調節肺腺癌免疫微環境的作用機制,為肺腺癌的臨床治療提供了一定的依據,同時也為固本解毒方的進一步研究奠定了基礎。但是本研究僅對固本解毒方干預肺腺癌免疫微環境的核心靶點進行了驗證,今后還需要更多實驗進一步完善固本解毒方的理論研究,為臨床用藥提供依據。

利益沖突聲明:無。