芪參顆粒防治阿霉素所致心肌損傷的作用機制研究及實驗驗證

張敬美 薛思明 李偉利 陳 歡 盧令慧 王其艷

(1 北京中醫(yī)藥大學生命科學學院,北京,100029; 2 北京中醫(yī)藥大學證候與方劑基礎研究教育部重點實驗室,北京,100029; 3 北京中醫(yī)藥大學證候與方劑基礎研究北京市重點實驗室,北京,100029; 4 北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院,北京,100029)

阿霉素(Doxorubicin,DXR)是一種高效的化療藥物,在臨床上廣泛用于癌癥治療[1-2]。然而其在長期使用過程中會對人體產(chǎn)生嚴重的不良反應,尤其是心肌損傷[3-6],可導致左心功能不全,甚至心力衰竭。目前右丙亞胺是美國食品藥品監(jiān)督管理局唯一推薦用于減輕阿霉素心肌損傷的藥物,雖然被證明有一定的心臟保護作用,但其會加重骨髓抑制,并出現(xiàn)神經(jīng)毒性、食欲下降、惡心嘔吐、靜脈炎、腹瀉等不良反應[7]。因此,還需要更多的基礎和臨床研究積極尋找安全且有效的防治阿霉素心肌損傷的藥物。

芪參顆粒(Qishen Granules,QSG)是由黃芪、丹參、金銀花、玄參、附子、甘草6味藥材組成,臨床研究表明其可顯著提高心力衰竭患者的射血分數(shù)和中醫(yī)證候積分[8],降低患者的N末端B型利鈉肽原(N-terminal Pro-B-type Natriuretic Peptide,NT-proBNP)水平[9]。此外,前期本課題組研究表明QSG可顯著改善心力衰竭大鼠和小型豬的心功能并減少心肌纖維化[10-11]。但是關于QSG治療阿霉素心臟毒性的報道尚不多,其機制亦不明確,因此本研究將結合網(wǎng)絡藥理學和體內(nèi)體外實驗探索并驗證QSG減輕阿霉素心臟毒性的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級雄性C57BL/6J小鼠,6～8周齡,體質(zhì)量(20±2)g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,動物許可證號為SCXK-(京)-2019-0010,飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學SPF級動物房內(nèi)。按照隨機數(shù)字法分組,動物自由進食飲水,并按照自然晝夜節(jié)律光照。本實驗獲得了北京中醫(yī)藥大學倫理委員會批準(倫理審批號:BUCM-4-2018001201-1014)。

1.1.2 藥物 芪參顆粒(由北京中醫(yī)藥大學自主制備加工處理),普伐他汀(上海第一三共制藥有限公司,貨號:H20060271),阿霉素(GLPbio公司,美國,貨號:GC17576)。

1.1.3 試劑與儀器 BCA定量試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司,貨號:P1511-1),Cell Counting Kit-8(江蘇凱基生物技術股份有限公司,貨號:KGA317),CBA Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit(BD公司,美國,貨號:560485),磷酸化蛋白激酶B(Phospho-protein Kinase B,p-AKT)抗體(CST,美國,貨號:#13038),磷酸化促分裂原活化的蛋白激酶(Phosphorylated Mitogen Activated-protein Kinase,p-MAPK)抗體(CST,美國,貨號:#9211),促分裂原活化的蛋白激酶P38(Mitogen-activated Protein Kinase P38,MAPKP38)抗體(CST,美國,貨號:#9212),磷酸化核因子κB P65(Phospho-Nuclear Factor kappa-B P65,p-NF-κB P65)抗體(Abcam,美國,貨號:ab28856),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)抗體(Abcam,美國,貨號:ab181602),Goat anti Rb二抗(Abcam公司,英國,貨號:ab6721),PBS緩沖液(Servicebio公司,貨號:G4202),多聚甲醛固定液(Servicebio公司,貨號:G1101),DMEM培養(yǎng)基(Gibco,美國,貨號:C11995500BT),Trypsin-EDTA(Gibco公司,美國,貨號:25300-054),雙抗-青鏈霉素混合液(AQ公司,貨號:AQ512),RIPA組織細胞裂解液(Biorigin公司,貨號:BN25012-A),蛋白酶抑制劑(普利萊,貨號:P1265),蛋白磷酸酶酶抑制劑(普利萊,貨號:P1260),ECL Plus超敏發(fā)光液(Solarbio,貨號:PE0010),無蛋白快速封閉液(雅酶,貨號:PS105),一抗稀釋液(Biorigin,貨號:BN21010),大小鼠尾靜脈顯像儀(南京卡爾文生物科技有限技術公司,型號:KW-XXY),小動物超聲影像系統(tǒng)(加拿大VisualSonics公司,美國,型號:Vevo TM2100),離心機(Eppendorf公司,德國,型號:5424R),組織超聲破碎儀(Qiagen公司,德國,型號:HildenTissueLyser II),Multiskan全自動酶標儀(Thermo公司,美國,型號:MK3),低溫離心機(Eppendorf公司,德國,型號:5424R),凝膠成像儀及圖像分析系統(tǒng)(Bio-rad公司,美國,型號:Molecular lmagery ChemiDocTM XRST),流式細胞儀(BD公司,美國,型號:LSRFortessa)。

1.1.4 網(wǎng)絡藥理學分析數(shù)據(jù)庫及方法 使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)[12]數(shù)據(jù)庫根據(jù)口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18對QSG中的活性成分及靶點進行篩選,通過人類基因數(shù)據(jù)庫(The Human Gene Database,GeneCards)(https://www.genecards.org/)[13]、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(https://omim.org/)[14]及遺傳藥理學與藥物基因組學數(shù)據(jù)庫(Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Knowledge Base,PharmGKB)(https://www.pharmgkb.org/)[15]等數(shù)據(jù)庫以“Doxorubicin/Adriamycin Myocardial Injury”為關鍵詞對阿霉素心臟損傷疾病靶點進行篩選,而后取QSG和阿霉素心肌損傷的交集靶點輸入蛋白互作數(shù)據(jù)庫(Search Tool for the Retrieval of Interaction Gene/Proteins,STRING)(https://cn.string-db.org/)[16]數(shù)據(jù)庫,物種設置為“Homo Sapiens”,獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡,下載此相互作用網(wǎng)絡的TSV格式文件,導入Cytoscape軟件進行可視化分析,使用其Cytohubba插件篩選核心靶點,MCODE插件進行交集靶點的聚類分析。將聚類后得到前2個模塊的蛋白質(zhì)靶點導入Hiplot(https://hiplot.com.cn/)數(shù)據(jù)庫,閾值為P<0.01,進行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析的篩選,選取前10個條目繪制成氣泡圖。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 本實驗選SPF級C57BL/6J雄性健康小鼠30只,入組時體質(zhì)量(20±2)g,在動物房適應性喂養(yǎng)3 d后,根據(jù)隨機數(shù)字法分為正常組、阿霉素組、芪參顆粒低劑量組、芪參顆粒高劑量組和陽性藥物普伐他汀組,每組6只。阿霉素組和給藥組(芪參顆粒低劑量組、芪參顆粒高劑量組和陽性藥物普伐他汀組)小鼠在實驗的第1天和第4天尾靜脈注射阿霉素,劑量為6 mg/kg,累計劑量為12 mg/kg;正常組則尾靜脈注射等體積的生理鹽水。

1.2.2 給藥方法 實驗開始前5 d,對QSG給藥小鼠灌胃給藥,根據(jù)等效劑量換算芪參顆粒給藥劑量,低劑量組為2.5 g/kg,高劑量組為5 g/kg;給予陽性藥物組的小鼠灌胃普伐他汀40 mg/kg;同時,給予空白對照組和模型組小鼠等體積的生理鹽水灌胃,累計12 d,實驗第7天進行超聲取材,實驗結束。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 心臟超聲檢測 對各組小鼠進行超聲檢查以評估心功能。取胸骨旁短軸切面,由超聲引導M型曲線進行檢測,相關參數(shù)包括心臟射血分數(shù)(Ejection Fraction,EF)和短軸縮短分數(shù)(Fractional Shortening,FS)。

1.2.3.2 病理學檢測 心肌組織在4%多聚甲醛中充分固定后,置于包埋框中進行石蠟包埋,切片。經(jīng)蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色后制作病理切片,在超分辨顯微成像系統(tǒng)拍攝圖像以分析心臟組織局部病理改變。

1.2.3.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測相關蛋白表達 將心臟組織在低溫條件下充分研磨,蛋白質(zhì)定量試劑盒(Bicinchoninic Acid Assay,BCA)方法蛋白定量后,用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)(10%)對蛋白樣品進行電泳分離并轉移至聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)膜上;將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜,二抗在室溫孵育1.5 h,再用Omni-ECLTM增強型化學發(fā)光檢測試劑盒(Omni-ECLTMEnhanced Pico Light Chemiluminescence Kit,Omni-ECLTM)在凝膠成像儀中曝光成像。最后,使用Image-Lab軟件對條帶的灰度進行分析,以統(tǒng)計目的蛋白在不同組中的差異。

1.2.3.4 流式多因子檢測技術CBA(Cytometic Bead Array,CBA) 首先使用細胞計數(shù)試劑(Cell Counting Kit-8,CCK8)法對QSG的無毒范圍和有效范圍進行濃度梯度的篩選。而后取對數(shù)生長期的H9C2細胞,用含10%胚牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,棄上清液,加入濃度為800 μg/mL QSG預給藥24 h。棄上清液,1 μmol/L阿霉素刺激的同時給予800 μg/mL的QSG,24 h后進行收集上清,用于后續(xù)細胞因子的檢測。具體參照說明書的方法如下,向帶有濾膜(0.22 μm)的96孔板中加入Wash Buffer進行潤洗,對標準品進行梯度稀釋;向孔中分別加入一定體積的Th1/2/17 Capture Beads混合液(40 μL/孔)、標準品或樣品(50 μL/孔)和Mouse Th1/2/17 PE Detection Reagent(40 μL/孔),在室溫條件下孵育2 h,離心去除多余液體,每孔加入120 μL的Wash Buffer,充分混勻珠子,并將珠子轉移至新的U型96孔板內(nèi);流式上機檢測,用FCAP Array軟件分析樣品中細胞因子的含量。

1.2.3.5 癌細胞活力測定 使用CCK-8試劑盒評估細胞活性。將MCF-7人乳腺癌細胞接種在96孔板中,每孔設有5 000個細胞,待1 μmol/L阿霉素造模24 h后每孔加入100 μL含10%CCK-8的完全培養(yǎng)液孵育2 h,培養(yǎng)至檢測時間點后取出培養(yǎng)板,放置酶標儀中450 nm處測定各組光密度(Optical Density,OD)值。

2 結果

2.1 QSG改善阿霉素誘導的心臟功能障礙 與空白對照組比較,模型組小鼠的EF和FS顯著降低(P<0.01)。而在不同劑量的QSG治療后,小鼠的EF和FS值顯著升高(P<0.01)。圖1。

圖1 QSG改善小鼠阿霉素誘導的心肌損傷的心功能

2.2 QSG緩解阿霉素誘導的心肌組織損傷 空白對照組小鼠心肌細胞排列整齊,形態(tài)完整且著色均勻,細胞核無明顯結構性改變。模型組心肌細胞排列松散,心肌纖維橫紋不清楚甚至消失不見,并伴有明顯的炎癥細胞浸潤,正常結構喪失。經(jīng)不同劑量QSG治療后,小鼠心肌細胞排列整齊,且炎癥細胞浸潤減少,病理變化被顯著改善。見圖2。

2.3 QSG治療阿霉素心肌損傷的網(wǎng)絡藥理學分析 篩選出174種化學成分,261個基因靶點;疾病基因合并去重后獲得1 521個基因,二者交集靶點為156個。排名前10的Hub基因分別為:信號轉導及轉錄激活因子3(Signal Transduction and Transcriptional Activator 3,STAT3)、白細胞介素6(Interleukin 6,IL6)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、蛋白激酶B1(Protein Kinase B1,AKT1)、半胱氨酸蛋白酶3(Apoptosis-Related Cysteine Peptidase,CASP3)、血管內(nèi)皮生長因子A(VAscular Endothelial Growth Factor A,VEGFA)、TP53、過氧化物合酶2(Peroxidase Synthase 2,PTGS2)、禽肉瘤病毒17的假定轉化基因(V-Jun Avian Sarcoma Virus 17 Oncogene Homolog,JUN)(圖3A)。模塊一包括CASP3、JUN、AKT1等共70個靶標蛋白(圖3B),模塊二包括小窩蛋白1(Caveolin1,CAV1)、熱休克蛋白B1(Heat Shock Protein B1,HSPB1)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,BAX)等共21個靶標蛋白(圖3C)。模塊一KEGG共富集到142條通路,結果顯示,主要與IL-17信號通路、TNF信號通路、Toll-like Receptor等炎癥及癌癥信號通路相關;模塊二共富集到56條生物條目,結果顯示,主要與絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3 Kinase/protein Kinase B,PI3K/AKT)、p53及癌癥信號通路等。

圖2 各組小鼠的心臟組織損傷情況(HE染色,×20)

2.4 QSG對PI3K/AKT及MAPK通路相關蛋白表達的影響 結果顯示,與空白對照組比較,模型組小鼠心肌細胞磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated-protein Kinase B,p-AKT)的表達量顯著下降,磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(Phosphorylated Mitogen Activated-protein Kinase,p-MAPK)及磷酸化核因子κB(Phosphorylated Nuclear Factor-κB,p-NF-κB)的表達量顯著升高;與模型組比較,QSG觀察組小鼠心肌細胞p-AKT表達量顯著升高,p-MAPK及p-NFκB的表達量顯著降低。見圖4。

2.5 QSG對阿霉素誘導的H9C2細胞相關炎癥指標的影響 結果顯示,與空白組比較,阿霉素顯著提高了H9C2細胞中炎癥介質(zhì)γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)、IL-6、IL-17A和TNF的水平,而QSG可逆轉阿霉素誘導的相關炎癥介質(zhì)水平的升高。見圖5。

圖3 QSG治療阿霉素心肌損傷的網(wǎng)絡藥理學分析

圖4 QSG對小鼠心臟組織p-AKT、p-MAPK及p-核因子κB蛋白的影響

2.6 QSG不影響阿霉素的抗腫瘤活性 CCK-8結果顯示,與單獨使用阿霉素比較,聯(lián)合使用QSG后未減弱阿霉素對腫瘤細胞增殖的抑制作用。見圖6。

圖5 QSG對阿霉素誘導的H9C2細胞相關炎癥指標的影響

圖6 QSG對阿霉素抗腫瘤效果的影響

3 討論

阿霉素是一種廣泛使用的化療藥物,可提高癌癥患者的生存率,但會誘發(fā)不可逆的心肌損傷[17]。多項研究表明,阿霉素誘發(fā)的心肌損傷與氧化應激、炎癥反應及凋亡的發(fā)生密切相關[18-19]。中醫(yī)理論認為阿霉素誘發(fā)心肌損傷的主要病機是心陽受損或心之氣陰不足,推動血液無力,氣滯血瘀,以氣虛氣滯夾瘀為主,推薦使用溫陽益氣類藥物進行治療。QSG作為溫陽益氣類方劑,由黃芪、丹參、玄參、金銀花、甘草、附子等6味中藥組成,在多種心力衰竭動物模型中表現(xiàn)出對心功能有顯著的改善作用,而且在臨床使用的過程中也具有比較顯著的治療效果[8-9]。但是關于QSG治療阿霉素心肌損傷的報道尚不多,其藥效物質(zhì)及作用機制不清。網(wǎng)絡藥理學是一門研究疾病機制和藥物作用機制的新學科,其主要目標是多層次、多角度、更系統(tǒng)地解釋中藥復方成分復雜,治療疾病的活性成分不清晰等問題,被廣泛用于探索中藥治療疾病的分子藥理學機制的研究[20-21]。故本研究采用網(wǎng)絡藥理學分析及體內(nèi)和體外實驗驗證,初步探析QSG治療阿霉素心肌損傷的作用機制,以期為QSG的臨床應用提供實驗基礎。我們首先采用體內(nèi)尾靜脈注射阿霉素的方式構建阿霉素心臟損傷模型,通過超聲心動圖和病理組織染色等對QSG的藥效進行了評價。超聲結果顯示:與阿霉素組比較,經(jīng)QSG治療后,小鼠心臟EF值和FS值顯著增加,表明QSG給藥后可改善阿霉素誘導的心功能障礙。HE是常用的組織學及病理學檢測的基本方法,可直觀反映小鼠心肌組織形態(tài)與結構的改變。結果顯示,空白對照組小鼠心肌細胞排列有序,形態(tài)完整;在模型組中觀察到心肌纖維斷裂,心肌細胞排列紊亂及炎癥細胞的浸潤。與模型組比較,QSG組表現(xiàn)出心肌細胞排列紊亂狀態(tài)改善,細胞核趨于完整,且炎癥細胞浸潤明顯減少,表明QSG減輕了阿霉素誘導的小鼠心臟的病理改變。

而后我們從PPI網(wǎng)絡互作結果發(fā)現(xiàn)QSG治療阿霉素心肌損傷的核心靶點主要STAT3、IL6、TNF、IL1B、AKT1、CASP3、VEGFA、TP53、PTGS2。一些研究表明,心臟STAT3可通過抑制細胞凋亡和自噬來預防阿霉素誘導的心肌病[22-23],此外可參與調(diào)控血管穩(wěn)態(tài)的關鍵生長因子VEGFA的轉錄和表達,減少阿霉素誘導的心肌損傷[24]。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,參與細胞存活、增殖和代謝的調(diào)節(jié),在阿霉素處理的小鼠心臟中其活性受到抑制[25]。越來越多的研究表明,AKT激活可預防阿霉素引起的心肌細胞凋亡,而抑制AKT的活性則會加重阿霉素誘導的心肌細胞凋亡和心功能障礙[26-27]。IL-6、TNF、IL-1β是炎癥介質(zhì),據(jù)報道,核因子κB可在阿霉素誘導心肌細胞損傷后的1 h內(nèi)被激活,激活的核因子κB可誘導合成TNF-α、IL-1β及IL-6等炎癥介質(zhì),這些炎癥介質(zhì)可形成炎癥反應微環(huán)境并募集白細胞進入心肌,進而加重炎癥反應損傷[28-33]。

根據(jù)KEGG通路富集分析,QSG治療阿霉素心肌損傷與IL-17信號通路、TNF信號通路、Toll-like Receptor信號通路、MAPK信號通路、PI3K/AKT信號通路及癌癥信號通路等相關,大多數(shù)參與炎癥反應,提示炎癥反應在QSG治療阿霉素心肌損傷中發(fā)揮重要作用。其中MAPK是真核生物中一組高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,由p38-MAPK激酶(p38-MAPKα,β,γ和δ亞型)、c-jun氨基末端激酶(JNK1-3)和胞外信號調(diào)節(jié)激酶1-2(Extracellular Signal-regulated Kinase1-2,ERK1-2)組成,該通路的功能是調(diào)節(jié)細胞對有絲分裂和胞外刺激的反應[34]。PI3K/AKT信號通路是細胞內(nèi)最重要的信號通路之一,在細胞代謝、細胞生長、細胞增殖、細胞凋亡和炎癥反應等基本細胞活動中起主要作用[35]。既往的研究發(fā)現(xiàn),MAPK和PI3K/AKT信號通路與自身免疫性疾病[36-37]、炎癥疾病[38-39]、心血管疾病[40-41]、癌癥[42-43]和神經(jīng)退行性疾病[44-45]等密切相關,并針對其開發(fā)出一系列的藥物。在阿霉素誘導的心臟毒性模型中,炎癥反應是阿霉素導致心臟毒性的一個重要病理特征,研究者們也對MAPK和PI3K/AKT信號通路進行了一系列研究。據(jù)報道,阿霉素激活p38 MAPK,JNK,ERK和NFκB可誘導心臟組織炎癥反應[46]。SHI等[47]發(fā)現(xiàn)甘草素可以抑制阿霉素誘導的小鼠心臟組織中p65、IκBα和磷酸化的p38 MAPK、JNK和ERK的水平,表明其可以通過抑制MAPK/NFκB途徑發(fā)揮對阿霉素誘導的心臟毒性的抗炎作用。THANDAVARAYAN等[48]發(fā)現(xiàn)五味子苷B以劑量依賴性的方式減弱阿霉素誘導的小鼠心臟p38 MAPK的激活和IL-1β,IL-16和TNF-α等炎癥介質(zhì)的表達,進而發(fā)揮抗炎作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)阿霉素也通過下調(diào)PI3K/AKT生存途徑誘導心肌細胞凋亡[49]。YU等[50]發(fā)現(xiàn)姜黃素通過PI3K/AKT依賴性方式抑制阿霉素誘導的心肌細胞焦亡,進而改善阿霉素誘導的心肌損傷。同樣的,SAHU等[51]發(fā)現(xiàn)芹菜素和阿魏酸對阿霉素處理的大鼠心肌細胞表現(xiàn)出濃度依賴性的保護作用,其主要的機制與PI3K/AKT信號通路密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)QSG可以顯著減輕阿霉素誘導的小鼠心臟組織中炎癥細胞的浸潤,并且其可以抑制阿霉素處理的H9C2中IFN-γ、IL-6、IL-17A和TNF等炎癥介質(zhì)的水平,減輕炎癥反應。在QSG的抗炎機制中,我們發(fā)現(xiàn)QSG可抑制心臟組織中p-MAPK及p-核因子κB的表達,并促進p-AKT的水平。因此,QSG可以在體內(nèi)和體外表現(xiàn)出明顯的抗炎能力,具體機制可能與核因子κB、MAPK和PI3K/AKT信號通路有關。

為了評價與QSG聯(lián)用后是否會影響阿霉素本身的抗腫瘤效果,本研究使用人乳腺癌細胞MCF-7進行驗證。CCK-8結果表明在與QSG聯(lián)用后,MCF-7的細胞活力與模型組差異無統(tǒng)計學意義,表明阿霉素與QSG聯(lián)用后不會影響阿霉素本身的抗腫瘤效果。

4 小結

綜上所述,本研究通過網(wǎng)絡藥理學系統(tǒng)分析了QSG治療阿霉素心肌損傷的潛在機制,并通過體內(nèi)及體外實驗評價了QSG治療阿霉素心肌損傷的有效性及安全性,主要表現(xiàn)為減少炎癥反應損傷并且不影響阿霉素本身的抗腫瘤效果,從而改善心功能。但本研究只是對QSG抗阿霉素心肌損傷的機制進行了初步探究,后續(xù)還需要更多的實驗進行驗證,比如對動物進行敲減基因的處理,對細胞實驗使用干擾小分子或抑制劑來抑制相關蛋白的表達,進一步明確QSG治療阿霉素心肌損傷的確切機制,從而為闡明QSG的作用機制奠定堅實的基礎。

利益沖突聲明:無。