宏基因組學第二代測序技術與傳統實驗室微生物培養在支氣管擴張病原學診斷中的比較

【摘要】目的 研究宏基因組學第二代測序技術（mNGS）與傳統實驗室微生物培養在支氣管擴張病原學診斷中的價值，為臨床提供參考。方法 選取百色市人民醫院2021年9月至2022年10月收治的170例支氣管擴張癥患者為研究對象進行回顧性分析，根據檢測方法不同分為mNGS組（65例）和實驗室培養組（105例）。根據患者自我選擇用藥情況將需調整抗生素使用的 43 例患者分為 mNGS1 組（ 22 例）、傳統培養組（ 12 例） 及經驗組（ 9 例）。收集其經纖維支氣管鏡防污染-肺泡灌洗液的常規微生物檢查結果，分離培養檢查結果及臨床宏基因學組檢測結果等臨床資料，比較實驗室培養與mNGS檢測陽性率及不同用藥狀態下患者轉歸情況。結果 mNGS檢測陽性率高于實驗室培養（Plt;0.05）。mNGS1組患者平均住院時間短于傳統培養組、經驗組，mNGS1組患者白細胞計數、中性粒細胞計數、C反應蛋白及白細胞介素-6水平低于傳統培養組、經驗組（Plt;0.05）。結論 mNGS在支氣管擴張病原學診斷中具有一定優勢，診斷陽性率更高，對患者經驗用藥具有一定幫助，能夠縮短住院時間，降低炎癥因子水平，值得臨床應用。

【關鍵詞】宏基因組學第二代測序技術；實驗室微生物培養；支氣管擴張；診斷

【中圖分類號】R562.2+2 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-2665.2023.11.0098.03

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2023.11.033

支氣管擴張是由呼吸道感染、氣道阻塞或先天遺傳等因素引起的支氣管及其周圍肺組織出現纖維化，導致機體支氣管壁的肌肉與彈性組織被破壞，使支氣管出現永久性擴張及變形[1]。下呼吸道感染是支氣管擴張的常見病因，其病原體較多，包括細菌、病毒及支原體等[2]。支氣管擴張反復急性發作及發展的主要因素是各種致病菌感染，對臨床醫師來說，明確病原體是精準治療的關鍵，以往對抗生素使用僅僅局限于廣譜抗生素經驗性治療，近年來抗生素的濫用導致了多重耐藥菌明顯增加，故精準使用抗生素顯得尤為重要[3]。傳統實驗室檢測存在一定弊端，陽性率低且耗時長，難以快速診斷，對于危重患者感染難以做到早期精準治療，無法滿足臨床需求。臨床宏基因組學第二代測序技術（mNGS）通過高通量測序技術，能夠縮短檢測時間，提高病原檢測敏感度[4]。因此，本研究將mNGS與傳統實驗室微生物培養進行對比分析，進一步尋找病原學診斷的最佳方式，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取百色市人民醫院2021年9月至2022年10月收治的170例支氣管擴張癥患者為研究對象進行回顧性分析，根據檢測方法不同分為實驗室培養組（105例）和mNGS組（65例）。實驗室培養組患者男性41例，女性64例；年齡42～68歲，平均年齡（57.00±4.58）歲；白細胞計數（5.50～10.54）×109/L，平均白細胞計數（8.25±1.87）×109/L；中性粒細胞計數4.00%～7.68%，平均中性粒細胞計數（5.58±1.54）%；C反應蛋白水平23.05～35.65 mg/L，平均C反應蛋白水平（28.13±4.36）mg/L；白細胞介素-6水平22.01～26.55 pg/mL，平均白細胞介素-6水平（22.57±2.14）pg/mL。mNGS組患者中男性21例，女性44例；年齡42～69歲，平均年齡（57.22±4.54）歲；白細胞計數（5.51～10.51）×109/L，平均白細胞計數（8.34±1.72）×109/L；中性粒細胞計數4.00%～7.70%，平均中性粒細胞計數（5.45±1.56）%；C反應蛋白水平23.00～35.85 mg/L，平均C反應蛋白水平（28.55±5.33）mg/L；白細胞介素-6水平22.05～26.69 pg/mL，平均白細胞介素-6水平（22.14±2.55）pg/mL。兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），組間具有可比性。本研究經百色市人民醫院醫學倫理委員會批準。納入標準：①符合《中國成人支氣管擴張癥診斷與治療專家共識》[4]中支氣管擴張的診斷標準；②可耐受電子支氣管鏡檢查。排除標準：①伴嚴重心臟疾病或呼吸循環衰竭疾病者；②有嚴重精神障礙者；③合并其他肺部疾病如胸腔積液者。

1.2 研究方法 完善患者肺部 CT、血氣分析及凝血功能等常規檢查。經臨床醫師評估及患者同意后，由有經驗的醫師行電子支氣管鏡（福建康百納醫療器械有限公司，型號：BF-1TQ290）檢查，并根據肺部CT提示的擴張部位用 37 ℃生理鹽水進行灌洗，回收部分灌洗液，獲取防污染支氣管-肺泡灌洗液20 mL送檢。將支氣管-肺泡灌洗液分成2管，每管不少于3 mL，在室溫下放置不超過2 h，立即送百色市人民醫院檢驗科微生物實驗室進行細菌、真菌及L型細菌培養，同時通過冷鏈運送至第三方檢驗公司（金域檢驗公司）進行mNGS檢測。進行電子支氣管鏡檢查并獲取防污染肺泡灌洗液后，立即進行經驗性抗生素治療，病原體陽性的根據藥敏調整抗生素，病原體檢測陰性的根據臨床經驗用藥（口服三代頭孢菌素類藥物、半合成青霉素或氟沙星類藥物、氧氟沙星、左氧氟沙星和洛美沙星；結合化痰藥止咳）。

1.3 觀察指標 ①比較實驗室培養與mNGS檢測的陽性率。 實驗室培養以培養出病原菌為陽性，mNGS檢出特異序列即可判為陽性。②比較mNGS1組、傳統培養組和經驗用藥患者的轉歸情況。所有患者中有6例未使用抗生素，抗生素未調整121例，剩下43例患者均調整抗生素使用，其中有22例根據mNGS病原體結果進行調整，為mNGS1組；有12例根據病原體結果進行調整，為傳統培養組；有9例未根據mNGS結果或培養結果進行調整，為經驗組。轉歸情況包括呼吸困難加重、反復咳嗽咳痰、咯血及住院時間，同時采集患者空腹靜脈血2 mL，抗凝后置入離心機（北京海富達科技有限公司，型號：BY/TD-3A），以3 000 r/min離心10 min，去除上清液，取下層血漿置于-15 ℃冷凍保存，使用全自動免疫分析儀[強生上海醫療器材有限公司，注冊號國食藥監械（進）字2010第3400145號，型號：5600]與配套試劑檢測白細胞計數、中性粒細胞計數、C反應蛋白及白細胞介素-6水平。

1.4 統計學分析 采用SPSS 18.0統計學軟件分析數據。計量資料以（x）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以[例（%）]表示，兩組間比較采用χ2檢驗，多組間比較采用Bonferroni" χ2檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗室培養與mNGS檢測陽性率比較 mNGS檢測陽性率高于實驗室培養，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表1。

2.2 mNGS1組、傳統培養組和經驗組患者轉歸情況比較 mNGS1組患者住院時間短于傳統培養組、經驗組，白細胞計數、中性粒細胞計數、C反應蛋白及白細胞介素-6水平低于傳統培養組、經驗組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表2。

3 討論

支氣管擴張作為臨床常見且多發的疾病，病原體包括細菌、病毒及支原體等，反復急性發作及發展的因素中最主要的是各種致病菌感染，因此明確病原體是精準治療的關鍵[5-6]。既往的治療主要使用廣譜抗生素開展經驗用藥，隨著抗生素濫用，患者多重耐藥菌明顯上升，精準使用抗生素顯得尤為重要[7]。但對于支氣管擴張的患者，相當一部分有反復使用抗生素的經歷，臨床常用的病因診斷手段如細菌、真菌培養及藥敏試驗等，常常得不到陽性結果[8]。mNGS檢測結果中主要為流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌，其中流感嗜血桿菌陽性多為呼吸道感染，且該病傳染速度快，因此臨床檢出率較高。銅綠假單胞菌存在于水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等環境，在機體免疫力降低的情況下，感染可發生于機體各部位，會導致檢出率較高的情況。其中銅綠假單胞菌在感染加重期和穩定期的原型菌、L型細菌中均占第一位，提示L型細菌可能作為潛在的致病菌在支氣管擴張癥患者的肺部定植，可導致支氣管擴張癥感染的遷延和反復發作[9]。在臨床工作中，發現支氣管擴張癥患者雖在急性加重期痰培養的陽性率較穩定期高，但總體陽性率仍不超過50%，而且近年由于抗生素的濫用等情況，導致支氣管擴張癥急性加重期少見的病原體如諾卡菌、結核分枝桿菌等也越來越多，但是查閱中外文獻，尚未見到有大規模的研究證實常見病原體及少見病原體近年如何變遷[10-11]。

目前多采用痰液作為檢測標本，而痰液標本極易受口腔和上呼吸道定植菌污染，影響結果判斷，對醫院該類疾病患者平均住院日的統計，多為10天以上，患者經濟負擔重，所以提出同時進行防污染支氣管-肺泡灌洗液病原體培養及藥敏試驗與病原體mNGS檢測[12]。基于宏基因組的二代測序技術具有病原菌陽性檢出率高、快速等優點，已經成為微生物檢測的研究熱點。本研究通過分析mNGS與傳統實驗室微生物培養結果，結果發現mNGS檢測陽性率更高，究其原因主要在于基于mNGS技術的微生物檢測方法，對宏基因組樣本實施大規模的完全測序，得到宏基因組的核酸序列，結合生物信息學工具，對核酸序列數據分析，得到微生物基因信息等，具有無需培養樣本、敏感度高、能夠檢測未知微生物的優點，彌補了傳統微生物檢測方法的不足，為臨床提供了新的決策依據[13]。根據病原體結果進行調整用藥，結果發現患者均存在不同的用藥效果，其中mNGS組患者住院時間更短，結果中mNGS組患者白細胞計數、中性粒細胞計數、C反應蛋白及白細胞介素-6低于傳統培養組、經驗組，在癥狀好轉情況上差異無統計學意義，證實mNGS對臨床經驗用藥具有一定幫助，在對用藥情況分析后，患者根據mNGS病原體結果調整，藥物使用更加具有針對性。絕大部分感染人群是由于病史及理化結果，經驗性使用抗生素治療后，病原學明確后對抗生素進行調整[14-15]。但本研究中根據mNGS結果進行抗生素調整，可減輕患者炎癥反應。依據微生物培養1周后得到的結果，可見患者大多情況下病原體已經出現一定改變，再針對培養結果調整抗生素方案，因此mNGS的快速、高效、實時性體現在檢出病原體種類方面。

綜上所述，支氣管擴張病原學檢查期間mNGS能夠提供良好支持，相比傳統實驗室微生物培養速度更快，能夠及時調整患者抗生素使用情況，對患者治療提供一定幫助。

參考文獻

農鳳珍. 成人支氣管擴張患者的病因及臨床特點分析[J/CD]. 臨床醫藥文獻電子雜志， 2017， 4（89）： 17467-17468.

江霜霜，程璘令. 122例支氣管擴張癥病因分析[J]. 廣州醫科大學學報， 2021， 49（5）： 31-33.

羅越，胡洋洋，張興，等. 《中國宏基因組學第二代測序技術檢測感染病原體的臨床應用專家共識》解讀[J]. 河北醫科大學學報， 2021， 42（7）： 745-749.

支氣管擴張癥專家共識撰寫協作組，中華醫學會呼吸病學分會感染學組.中國成人支氣管擴張癥診斷與治療專家共識[J].中華結核和呼吸雜志， 2021， 44（4）： 311-321.

羅汝斌，黃曼，胡行，等.嚴重爆炸致燒傷患者感染病原微生物的特征及宏基因組學第二代測序技術在病原微生物檢測中的應用[J].中華燒傷雜志， 2021， 37（10）： 946-952.

李繼法，陳阿麗，李云雷，等. 300例成人支氣管擴張癥患者臨床特點及病因分析[J]. 健康研究， 2021， 41（2）： 229-231.

《中華傳染病雜志》編輯委員會.中國宏基因組學第二代測序技術檢測感染病原體的臨床應用專家共識[J].中華傳染病雜志， 2020， 38（11）： 681-689.

伍增祥，安康，李雙慶.宏基因組學第二代測序技術輔助診斷內臟利什曼病1例并文獻復習[J].中華全科醫學， 2022， 20（9）： 1628-1630.

米婷，王雅寧.氣管鏡下宏基因組學二代測序技術在肺癌鑒別診斷中的臨床應用價值[J].陜西醫學雜志， 2022， 51（4）： 437-440.

中華醫學會神經病學分會感染性疾病與腦脊液細胞學學組.中樞神經系統感染性疾病的腦脊液宏基因組學第二代測序應用專家共識[J].中華神經科雜志， 2021， 54（12）： 1234-1240.

張弦，顧宇峰，趙華，等.宏基因組學二代測序在免疫功能受損不明原因肺部感染患者病原鑒別中的意義[J].交通醫學， 2020， 34（3）： 242-245.

TUNNEY M M， EINARSSON G G， WEI L， et al. Lung microbiota and bacterial abundance in patients with bronchiectasis when clinically stable and during exacerbation[J]. Am J Respir Crit Care Med， 2013， 187（10）： 1118-1126.

中華醫學會呼吸病學分會感染學組.中國成人醫院獲得性肺炎與呼吸機相關性肺炎診斷和治療指南（2018年版）.中華結核和呼吸雜志， 2018， 41（4）： 255-280.

韓李周，靳妍玉. 支氣管肺泡灌洗液宏基因組學二代測序對侵襲性肺真菌病的診斷價值[J]. 新鄉醫學院學報， 2022， 39（9）： 871-873， 877.

沈婉林. 病原宏基因組學二代測序技術在肺部感染性疾病鑒別診斷中的臨床應用研究[D].大連：大連醫科大學， 2021.