基于RNA-seq的大麥苗期抗旱相關基因的挖掘與分析

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.05.005

摘" 要：【目的】挖掘與分析大麥苗期抗旱相關基因，為研究大麥分子抗旱機制和選育抗旱大麥品種提供理論支撐。

【方法】以啤酒大麥品種新啤6號為材料，應用轉錄組測序RNA-seq技術對干旱脅迫前后大麥苗期倒二葉葉片進行轉錄組測序，并采用實時熒光定量 RT-PCR 方法進行功能基因驗證。

【結果】（1）干旱脅迫前后新啤6號倒二葉中3 835個差異表達基因，主要為編碼ABC轉運蛋白、核糖體蛋白、轉錄因子、脫水素、過氧化物酶、蛋白質磷酸酶等的基因。（2）DEG主要富集在淀粉和蔗糖代謝、轉運蛋白、植物激素信號轉導、伴侶和折疊催化劑、氨基糖和核苷酸糖的代謝、苯丙氨酸代謝、牛磺酸和次牛磺酸代謝、過氧化物酶體等途徑。

【結論】大麥干旱脅迫前后基因表達差異顯著（其中上調基因1 592個，下調基因2 243個）。

關鍵詞：大麥；干旱脅迫；轉錄組；基因挖掘

中圖分類號：S512.3""" 文獻標志碼：A""" 文章編號：1001-4330（2024）05-1077-08

收稿日期（Received）：

2023-10-25

基金項目：

財政部和農業農村部： 國家現代農業產業技術體系項目（CARS-05-19B）；國家自然科學基金項目（32360456）

作者簡介：

鞠樂（1987-），女，河南鄧州人，助理研究員，研究方向為雜糧遺傳育種與栽培，（E-mail）695112004@ qq.com

通訊作者：

齊軍倉（ 1971-） ，男，陜西寶雞人，教授，碩士生/博士生導師，研究方向為大麥遺傳育種與栽培，（E-mail）shzqjc@ qq.com

0" 引 言

【研究意義】隨著全球氣候變暖，水資源緊缺日益突顯，干旱頻發［1］。干旱是影響作物生長發育的主要非生物限制性因素之一［2］。近年來，每年均因干旱導致作物減產［3］，因此，解析作物抗旱機制、培育抗旱作物新品種，對提升作物抗旱能力具有重要意義［4］。【前人研究進展】大麥是抗逆性較強的作物，針對其抗旱性機理的研究多數集中在種子萌發、苗期或成株期有關形態、生理或農藝性狀等方面［5-11］。已有大麥種子萌發期［12，13］、苗期［14］、成株期［15，16］等抗旱性鑒定方面的研究。【本研究切入點】目前，雖然在大麥抗旱性研究方面取得一些進展，但關于大麥抗旱分子調控機制的研究相對較少，因此關于大麥干旱分子響應機制方面的研究仍有待加強，需進一步挖掘大麥抗旱性相關基因。【擬解決的關鍵問題】以新啤6號為材料，應用轉錄組測序RNA-seq 技術對干旱脅迫前后大麥苗期倒二葉進行轉錄組測序，挖掘與抗旱相關的差異表達基因，為解析大麥分子抗旱機制和指導大麥抗旱育種提供理論支撐。

1" 材料與方法

1.1" 材 料

供試啤酒大麥品種新啤6號由石河子大學農學院提供，選取健壯飽滿的種子，經0.4%高錳酸鉀消毒1.5 h，用蒸餾水沖洗干凈。

1.2" 方 法

1.2.1" 試驗設計

以營養土為培養基質，將100 粒大麥種子點播于塑料盆中，出苗后間苗，每盆留生長一致的幼苗12株，設2個處理：全生長期正常供水，大麥幼苗生長4周后不澆水進行干旱脅迫處理，直到取樣（大麥葉片出現半卷狀態時進行取樣），每個處理6 個重復。將樣品（倒二葉葉片）于液氮中速凍，儲存于-80℃冰箱中，用于轉錄組測序試驗。

1.2.2" 利用RNA-seq技術進行轉錄組測序

文庫構建和轉錄組測序由開泰明鏡基因科技（北京）有限公司完成。

1.2.2.1" RNA提取及質量檢測

首先提取Total RNA，并進行RNA質量檢測，符合質量的RNA才可進行后續的文庫構建。檢測RNA樣品：（1） 瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染；（2） Nanodrop檢測RNA的純度（OD260/280比值）。

1.2.2.2" 構建文庫

樣品檢測合格后，使用Oligo（dT） Beads分離得到mRNA；加入打斷試劑將mRNA打斷成短片段，以此為模板，使用First Strand Synthesis合成第一條cDNA鏈，加入Second Strand Synthesis Mix合成第二鏈，經過末端補平和加“A”后，連接上RNA-Seq Adapter，純化連接產物后進行PCR擴增，使用磁珠純化回收300～600 bp目的產物進行測序。

1.2.2.3" 文庫質檢

文庫構建完成后，使用Qubit進行初步定量，稀釋文庫至1 ng/μL，隨后使用Qseq100 DNA Analyzer對文庫的insert size進行檢測，insert size符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量（文庫有效濃度＞2 nM）。

1.2.2.4" 上機測序

庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求pooling后使用Illumina NovaSeq 6000平臺，PE150測序文庫。

1.2.3" 實時熒光定量 RT-PCR 進行功能基因驗證

從差異表達基因數據庫中挑選5個上調基因，利用Primer 6.0 設計引物，采用實時熒光定量 RT-PCR以驗證轉錄組測序結果的準確性。表1

1.3" 數據處理

生物信息學數據分析由開泰明鏡基因科技（北京）有限公司完成。

1.3.1" 原始數據過濾

使用fastp 軟件對原始測序數據（Raw Data）過濾，質控包括：（1）去除引物和接頭序列（Adaptor）；（2）去除片段長度lt;50 bp的序列；（3）去除N堿基達到一定比例的reads（默認設為5 bp）；（4）去除質量值小于20的低質量堿基；（5）以4堿基為窗口計算堿基平均質量值，若堿基平均質量值低于20（Q20）則切除。

1.3.2" 參考序列比對

使用hisat2將Clean Data與參考基因組進行相似性比對（mapping），獲取 reads在參考基因組上的位置信息，以及測序樣本的特征信息。

1.3.3" 新轉錄本預測

用stringtie軟件對Mapped Reads進行拼接，與參考基因組的注釋文件比較，尋找新的轉錄區，確定新轉錄本以及新基因。

1.3.4" 基因表達量

使用HISAT2將質量控制后的序列和參考基因組進行比對，利用 stringtie對已知的和新的基因和轉錄本進行定量表達。

1.3.5" 差異表達基因的GO 和KEGG 富集

使用eggNOG構建go KEGG數據庫，使用R包clusterProfiler，對差異基因進行GO和KEGG富集分析。

2" 結果與分析

2.1" 干旱脅迫處理大麥苗期葉片的轉錄組

研究表明，將干旱脅迫處理前后樣品分別命名為CK和T，共檢測到3 835個差異表達基因（DEG），其中上調基因1 592個，下調基因2 243個。圖1

2.2" 差異表達基因（DEG）功能

研究表明，將P＜0.05，差異倍數≥2作為標準篩選DEG，共鑒定到1 618個（496個上調基因和1 122個下調基因）DEG，其中，P＜0.05，差異倍數≥8的DEG共84個（32個上調基因和52個下調基因）。鑒定到的1 618個DEG，HORVU.MOREX.r3.3HG0286930上調倍數為8.54、HORVU.MOREX.r3.4HG0386330上調倍數為11.16、HORVU.MOREX.r3.6HG0622770上調倍數為15.66、HORVU.MOREX.r3.2HG0112630下調倍數為10.23、HORVU.MOREX.r3.5HG0479070下調倍數為10.31。1 618個DEG主要為編碼ABC轉運蛋白、核糖體蛋白、轉錄因子、脫水素、過氧化物酶、蛋白質磷酸酶等的基因。表2

2.3" 差異表達基因（DEG）功能富集

研究表明，DEG主要富集在94個生物學過程，主要富集在RNA 修飾（GO：0009451）、對含氧化合物的反應（GO：0043207）、內切酶活性（GO：0004519）、葉綠素生物合成過程的調節（GO：0010380）等生物學過程。DEG主要富集在淀粉和蔗糖代謝、轉運蛋白、植物激素信號轉導、伴侶和折疊催化劑、氨基糖和核苷酸糖的代謝、苯丙氨酸代謝、牛磺酸和次牛磺酸代謝、過氧化物酶體等途徑。表3，圖2

2.4" 實時熒光定量PCR驗證

研究表明，挑選的5個基因在干旱處理前后的表達模式與RNA-seq結果一致。表4

3" 討 論

3.1

RNA-seq是一種快速、有效鑒定差異表達基因的方法，是揭示植物抗逆機理以及篩選抗逆基因的主要技術手段［17-18］。賀小彥［19］利用RNA-seq技術鑒定到野生大麥XZ5干旱脅迫前后根系中216個差異表達基因，并篩選出36個與野生大麥XZ5耐旱相關的差異表達基因，這些基因主要參與抗逆脅迫、抗氧化脅迫、能量代謝、細胞壁修飾等生物學過程。研究利用RNA-seq技術共檢測到新啤6號干旱脅迫前后苗期葉片中3 835個差異表達基因（其中上調基因1 592個，下調基因2 243個），主要為編碼ABC轉運蛋白、核糖體蛋白、轉錄因子、脫水素、過氧化物酶、蛋白質磷酸酶等的基因；KEGG代謝途徑富集分析結果表明，DEG主要富集在淀粉和蔗糖代謝、轉運蛋白、植物激素信號轉導、伴侶和折疊催化劑、氨基糖和核苷酸糖的代謝、苯丙氨酸代謝、牛磺酸和次牛磺酸代謝、過氧化物酶體等途徑。宋士偉等［20］研究中共檢測到野大麥干旱脅迫前后旗葉中6 868個上調表達基因，2 081個下調表達基因；對6 579個差異表達基因進行KEGG通路分析，這些基因主要富集到136個通路中，主要包括過氧化物酶體、精氨酸和脯氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、糖酵解和糖異生等途徑。張學雷［21］研究表明，野生大麥通過提高轉運體與氧化還原酶活性、增加滲透調節物的合成以提高抗旱能力。上述結果與試驗研究結果比較一致。

3.2

試驗研究檢測篩選到許多與抗旱相關的DEG。當植物遭受干旱脅迫時，主要通過抗氧化酶系統清除活性氧，避免植物組織因活性氧積累而導致氧化損傷［22］。過氧化物酶是一種抗氧化酶，在植物抗旱脅迫過程中發揮重要的作用［23］。試驗研究發現，編碼過氧化物基因HORVU.MOREX.r3.7HG0671530；編碼過氧化氫基因HORVU.MOREX.r3.2HG0181160、HORVU.MOREX.r3.2HG0181170和HORVU.MOREX.r3.7HG0669590；編碼超氧化物歧化酶基因HORVU.MOREX.r3.7HG0640950，5個基因在大麥受到干旱脅迫時表達顯著上升，可能參與了活性氧清除過程。ABC轉運蛋白是植物中重要的抗逆蛋白［24］，是一類跨膜蛋白，主要參與信號傳導、細胞解毒和跨膜運輸等生理過程［25］。研究結果發現7個編碼ABC轉運蛋白的基因（分別為HORVU.MOREX.r3.3HG0282720、HORVU.MOREX.r3.3HG0286070、HORVU.MOREX.r3.6HG0577120、HORVU.MOREX.r3.7HG0722520、HORVU.MOREX.r3.7HG0665860、HORVU.MOREX.r3.1HG0010450和HORVU.MOREX.r3.4HG0386330）在大麥受到干旱脅迫時表達顯著上升，可能參與了對干旱脅迫的響應。轉錄因子通過調控下游靶基因的表達，進而誘導多種保護機制以應對非生物脅迫［26］。研究結果發現，HORVU.MOREX.r3.3HG0299650、HORVU.MOREX.r3.1HG0090590、HORVU.MOREX.r3.5HG048653、HORVU.MOREX.r3.6HG0617580、HORVU.MOREX.r3.5HG0463120、HORVU.MOREX.r3.3HG0286890、HORVU.MOREX.r3.5HG0463450、HORVU.MOREX.r3.6HG0556820、HORVU.MOREX.r3.3HG0286980、HORVU.MOREX.r3.5HG0443240、HORVU.MOREX.r3.2HG0135680、HORVU.MOREX.r3.3HG0302280、HORVU.MOREX.r3.4HG0391440和HORVU.MOREX.r3.1HG0088760等14個編碼不同種類轉錄因子的基因，在大麥受到干旱脅迫時表達顯著上升，可能通過調控相關基因的表達，進而參與對干旱脅迫的響應［27］。研究結果發現，5個編碼蛋白質磷酸酶的基因（HORVU.MOREX.r3.7HG0728500、HORVU.MOREX.r3.4HG0389000、HORVU.MOREX.r3.5HG0473680、HORVU.MOREX.r3.3HG0276740和HORVU.MOREX.r3.3HG0302180）在大麥受到干旱脅迫時表達顯著上升，可能參與了對干旱脅迫的響應。LEA蛋白參與植物抗逆反應，植物可以通過提高LEA蛋白基因的表達來提高其耐旱性［28］。研究發現HORVU.MOREX.r3.6HG0622770、HORVU.MOREX.r3.6HG0622790和HORVU.MOREX.r3.6HG0622760等3個編碼LEA蛋白的基因，在大麥受到干旱脅迫前后差異極顯著，基因表達上升極顯著，這些基因與大麥抗旱性相關。

4" 結 論

4.1

新啤6號干旱脅迫前后倒二葉中3 835個差異表達基因（其中上調基因1 592個，下調基因2 243個），主要為編碼ABC轉運蛋白、核糖體蛋白、轉錄因子、脫水素、過氧化物酶、蛋白質磷酸酶等的基因。

4.2

DEG主要富集在淀粉和蔗糖代謝、轉運蛋白、植物激素信號轉導、伴侶和折疊催化劑、氨基糖和核苷酸糖的代謝、苯丙氨酸代謝、牛磺酸和次牛磺酸代謝、過氧化物酶體等途徑。

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RNA-seq-based mining and analysis of drought-related

genes in barley seedlings

JU Le1，2， QI Juncang1， NIU Yinting2， SHI Peichun1， SONG Ruijiao1， SONG Lingyu1，YIN Zhigang2， CHEN Peiyu2， QIANG Xuelan3

（1." College of Agriculture， Shihezi University， Shihezi Xinjiang 832003， China; 2. Academy of Agricultural Sciences， Nanyang City， Nanyan Henan 473000， China;3. Bureau of Agriculture and Rural Development， Wancheng District， Nanyang Henan 473000， China）

Abstract：【Objective】 To excavate the genes related to drought resistance in the hope of providing theoretical support for analyzing the molecular drought resistance mechanism of barley and guiding the drought resistance breeding of barley.

【Methods】 Taking New beer No.6 as the test material， we applied transcriptome sequencing RNA-seq technology to sequence the inverted bilobed leaves of barley seedlings before and after drought stress， and real-time fluorescence quantitative RT-PCR was used to verify the functional genes.

【Results】 （1） In this study， 3835 differentially expressed genes were detected in the inverted bilobed of New beer 6 before and after drought stress by using RNA-seq， mainly genes encoded by ABC transporter proteins， ribosomal proteins， transcription factors， dehydrins， peroxidases， protein phosphatases， etc.The results showed that DEG was mainly enriched in starch and sucrose metabolism， transporter proteins， plant hormone signaling transduction， and protein phosphatases.（2） By KEGG metabolic pathway enrichment analysis， DEGs were mainly enriched in starch and sucrose metabolism， transporter proteins， phytohormone signaling， chaperones and folding catalysts， aminosugar and ribosugar metabolism， phenylalanine metabolism， taurine and hyposulphite metabolism， peroxisomes and other pathways.

【Conclusion】" Significant differences are shown in gene expression before and after drought stress in barley.The results of this study have laid the foundation for the excavation of key drought-resistant genes and for further analysis of drought-resistant mechanisms in barley（1592 up-regulated genes and 2243 down-regulated genes） .

Key words：barley; drought stress; transcriptome; gene mining

Fund projects：The Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System （CARS-05-19B）; National Natural Science Foundation of China（32360456）

Correspondence author： QI Juncang （ 1971-）， male， from Baoji， Shaanxi， professor， doctoral supervisor，research direction： Genetic breeding and cultivation techniques of barley， （E-mail） shzqjc@ qq.com